叶切蚁（Atta）在实验室条件下的采集与长期保育

在实验室条件下，成功采集并维持不同类型巢穴中的蚁群，有助于推动基础研究，并促进科学普及。由于野外蚁群难以监测，本方案可在受控环境中利用完整蚁群作为操作单元，开展初步实验。考虑到蚂蚁物种生活方式的异质性（例如 Acromimix 属的特殊蚂蚁），该方案可调整后适用于其他感兴趣的生物类群。

从未操作过该技术的人员可能会认为事件的不确定性以及复杂的日常护理流程是困难之处。首次采集应在婚飞结束后立即进行，将已脱落翅膀并开始挖掘的蚁后放入带有石膏基底的小型容器中。第二次采集应在婚飞六个月后进行，收集由成功启动蚁群建立的蚁后所发育形成的成熟蚁群。

菌落发育完成后，将其转移至较大的容器中，可选择不同的巢穴设置。准备带塑料盖的容器，并在底部铺设石膏层，用于单独饲养蚁后。在繁殖季节，于切叶蚁分布区域寻找阿塔属（Atta）蚁巢，并观察表明有翅繁殖蚁即将离巢的外部特征。

巢穴特征包括：隧道入口变宽，有翅的繁殖蚁出现在隧道入口，工蚁流量增加且对潜在捕食者表现出更强的攻击性。婚飞结束后，雌性繁殖蚁返回土壤，脱落翅膀并开始挖掘巢穴。此时可开始收集蚁后。

将它们分别小心地放入已准备好的带有石膏层的塑料容器中。将蜂后置于受控环境中，约三天内不要操作或移动，以避免造成应激。每两天用带针头的注射器在容器的石膏层上小心刺穿瓶盖并注入 2.5 毫升水。

只要真菌圃呈现干燥缺水的状态，就需对石膏层进行灌溉。在采集后两周检查蚁后是否已反刍出真菌。若未见真菌，应采集健康且已建立的菌圃蚁群的两克真菌圃材料，并将其转移至蚁后的容器中。

即使真菌未发育，也需执行此步骤。一旦出现首批工蚁，应根据蚁群的切割活动情况，定期提供幼嫩且较薄的叶片碎片，并及时清除蚁群废弃物及干燥的叶片碎片。持续观察蚁群发育状况，当菌圃体积达到容器容积的一半以上时，将蚁群转移至人工的持久性巢穴中。

在最后一次婚飞六个月后，通过观察土壤颗粒呈颗粒状的塔形土堆，确定初建的切叶蚁巢穴位置。婚飞六个月后，年轻蚁群的巢穴在土壤中的深度估计可达一米。此时，使用锄头挖掘巢穴入口，直至找到容纳年轻蚁群的巢室。

采集蚁后、菌圃、未成熟个体和年轻工蚁，放入容积约为 500 毫升的塑料容器中。将装有蚁群的带盖塑料容器转移至指定的受控环境。为避免造成应激，大约三天内不要操作或移动蚁群。

开始提供叶片。提供新叶片时，需移除干燥的叶片和菌群废弃物。借助勺子清除采集物中的土壤残留。

观察菌落的发育情况，当菌圃体积达到容器容积的一半以上时，将菌落转移至人工的、持久性巢穴中，包括封闭式垂直巢、封闭式水平巢和开放式竞技场巢。制备具有更适宜配置的人工持久性巢穴，包括封闭式垂直巢、封闭式水平巢和开放式竞技场巢。准备包含觅食室、废物室和菌圃室的封闭式垂直巢结构。

然后准备一个封闭的水平巢穴装置，包括觅食室、废物室和真菌园室。接下来，准备一个开放的竞技场式巢穴装置，包含觅食室和废物室，并连接一个真菌园室。该竞技场也可容纳真菌室。

用棉签蘸取聚四氟乙烯液体，并佩戴丁腈手套，以单次动作在实验区域边界涂抹一层液体，以限制蚂蚁活动。每个菌圃体积为一升的蚁群，每天至少向其觅食室提供一片大叶子。

投喂频率取决于工蚁将植物材料整合到真菌中的敏捷程度。如果蚂蚁的切割活动较为频繁，应增加叶片数量。在封闭式巢穴中，应迅速完成投喂，以避免蚂蚁逃离觅食室。

也可以提供其他类型的资源。在开放式场地巢穴中，应根据真菌的升数提供叶片，并将叶片放置在远离废弃物的位置。为控制种群数量，每两周需清除所有菌落、持久性巢穴以及工蚁的废弃室内的全部内容物。

如果处理的废弃物量较大，或湿度过高，应每周清除一次。若工蚁将健康的菌丝转移至废弃物室，需确保蚁后不在其上，然后将其移除。每次提供新的培养物时，应清除觅食室中未被蚂蚁取用的材料，并确保该区域始终保持清洁。

如果工蚁将健康的菌丝体转移到觅食室，则需将其扰动，保持容器盖敞开，并在觅食室边缘表面撒上中性滑石粉。这样，工蚁会将菌丝体重新转移回容器中，而不会丢失菌丝体或任何未成熟个体。若需扩大菌圃规模，可添加另一个涂有石膏的容器，并将部分菌丝团移入其中。

真菌园的生长应逐步进行，以免破坏菌落的平衡。如果需要使用更大的容器，务必确保真菌已完全占据最小容器的整个空间后，再进行转移。菌落废弃物不应在真菌园培养室中积聚。

通过按照本实验方案所述，在蚁后生命周期早期的不同阶段进行采集，并将尼龙丝引入个体的腹部，从而能够评估和比较未交配蚁后、新近交配蚁后以及交配六个月后的蚁后个体之间的免疫抗性。通过测量插入个体腹部的尼龙丝图像的平均灰度值来评估包囊化水平。颜色最深的尼龙丝被认为代表了高效的细胞免疫防御。

最近交配的拉氏切叶蚁（Atta laevigata）蚁后表现出最高的包囊化水平，表明其具有有效的个体免疫防御能力。为了改进种群控制方法，通过该方案采集的蚁群被用于进行Bates引诱性测试。在整个实验过程中，每种蚂蚁（拉氏切叶蚁和六齿切叶蚁）各使用五个蚁群，重复实验五次。

使用不同副产品配制的无毒饵料在重复实验中进行了多样化布置。此处展示了迟钝切叶蚁和六齿切叶蚁工蚁的平均取食百分比。对于这两个物种而言，柑橘果 pulp、大豆以及大豆加柑橘果 pulp 处理组的取食量最高。

然而，对Atta sexdens的最后一次处理是由Atta laevigata的工蚁以60%的负载完成的。在2016年至2019年期间，来自约34所学校的约2,020名学生得以参观切叶蚁实验室，观察按照前述方案采集并维持饲养的蚁群。可以看出，教育机构对举办活体昆虫（如蚂蚁）展览的兴趣有所增加，这类展览能够让学生近距离观察。

根据学生的教育水平，参观的目的各不相同，从普通生物学知识到社会行为学习均有涉及。该技术中的一些关键步骤包括促进真菌园的生长、保持巢穴清洁以及防止蚂蚁逃逸。该方案还可应用于其他具有科研价值的物种，以研究早期阶段的蚁群发育以及毒饵相互作用等。

该技术已被来自比较形态学、组织学、毒理学和微生物学等多个领域的研究人员应用了22年，涵盖个体和群体水平。