Name: 加速性骨关节炎内侧半月板和软骨划痕鼠模型的不稳定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学习微刀片划痕技术建立小鼠内侧半月板不稳定模型，用于研究创伤后骨关节炎早期病理变化。该方法可在两周内观察到骨赘形成和疼痛行为，为骨关节炎机制研究提供快速可靠的动物实验平台。

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我们谨向利物浦大学的 Gemma Charlesworth 和 Mandie Prior 致以谢意，她们获取了本出版物中使用的显微计算机断层扫描（µCT）图像。本研究工作由 Versus Arthritis（资助编号 20199 和 22483）提供资金支持。Lynette Dunning 由 Versus Arthritis（资助编号 20199）资助。Kendal McCulloch 获得西苏格兰大学（UWS）博士奖学金资助。Carmen Huesa 由 Versus Arthritis（资助编号 20199 和 22483）资助。

所有实验程序均经格拉斯哥大学和西苏格兰大学伦理审查委员会批准，并依照英国《1986年动物（科学程序）法案》的指南进行。本研究使用了10周龄、体重约25 g的雄性C57Bl6/J小鼠，小鼠来自商业来源（见材料表）。
1. 动物准备
注意：在考虑研究目的时，需关注小鼠的性别，因为创伤后骨关节炎模型在不同性别之间表现出显著差异8,9,10。
<ol>
	<li>确保麻醉试剂（2% 异氟烷）已准备就绪。 
	注意：也可使用注射用麻醉剂11。鉴于手术持续时间较短，建议使用吸入式麻醉。</li>
	<li>使用单独的假手术处理的同龄对照组作为手术对照。 
	注意：不得将对侧膝关节用作手术对照（即在对侧肢体进行假手术）。这可能涉及动物福利问题，并可能影响步态及其测量结果。对侧膝关节可用于标准化内在骨参数12，并在诱发性疼痛测试中作为配对比较13。</li>
	<li>使用骨骼成熟的成年小鼠。 
	&#8203;注意：大多数文献在小鼠8–12周龄时诱导骨关节炎。本研究中，小鼠为10周龄。</li>
</ol>
2. 术前护理（由手术助手完成）
<ol>
	<li>若从小鼠从其他机构转运而来，需在手术干预前至少留出1周时间，使其适应新环境。</li>
	<li>在适当指定的无菌房间内进行手术，确保所有表面均处于无菌状态（例如，使用无菌铺巾覆盖手术区域）。 
	注意：本手术为无菌操作。</li>
	<li>将无菌器械整齐摆放在无菌铺巾上。</li>
	<li>称量小鼠体重。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉舱内，通过标准麻醉装置引入2%异氟烷，持续不超过15分钟（参见材料表）。 
	注意：在放入小鼠前，麻醉舱内不得有&#34;残留&#34;的麻醉气体。</li>
	<li>待小鼠麻醉后，将其从麻醉舱中取出，使用小型毛发剪将膝关节周围、从小腿中段至大腿中段的前侧和外侧毛发剪除。 
	注意：后肢膝关节的选择取决于操作者习惯，以操作方便的一侧为准。本方案中操作的是左后肢。</li>
	<li>确认小鼠已完全麻醉（对足部夹捏无反应）。</li>
	<li>使用抗菌皮肤清洁剂（例如含氯己定或碘伏者，参见材料表）对剃毛后的暴露皮肤进行消毒。</li>
	<li>为缓解术后疼痛，皮下注射0.05 mg/kg的丁丙诺啡。</li>
	<li>将小鼠仰卧放置，使待手术的膝关节朝上，并将小鼠鼻部置于连接麻醉装置的鼻罩中。</li>
	<li>用带有小圆形开口的无菌铺巾覆盖小鼠身体。</li>
	<li>将待手术肢体摆放至膝关节屈曲小于90°的位置，使髌韧带朝上，并用手术胶带固定足部以实现制动。</li>
</ol>
3. 内侧半月板失稳手术操作及软骨划痕
<ol>
	<li>调节显微镜以聚焦于髌韧带。</li>
	<li>用有齿镊夹住膝关节外侧的皮肤（参见 材料表），使用手术剪在远端髌腱附近平行做一小切口，插入剪刀并将切口扩大至约1 cm。将皮肤推向内侧，暴露髌韧带和近端胫骨平台（图1).</li>
	<li>使用11号刀片，沿髌韧带内侧从韧带顶端到底端做一切口（图1A到达髌韧带底部时，将刀片旋转90°，切口从髌韧带向外侧延伸至内侧，以暴露关节囊。 
	注意：此步骤或后续步骤中可能出现出血。若发生出血，使用无菌棉签并施加压力数秒（5 至 30 秒）。</li>
	<li>用钝头镊夹住髌韧带，旋转手腕将其轻轻移向外侧，直至恰好暴露髌下脂肪垫（IFP）。 
	注意：为尽量减少对髌韧带的损伤，使用镊子时不可夹得过紧，只需足以将韧带固定在侧边即可。</li>
	<li>在轻轻持住髌韧带的同时，用显微镊子夹住髌下脂肪垫（参见 材料表）将其抬起并轻微上移。这有助于观察内侧半月板韧带。</li>
	<li>识别内侧半月板的内侧半月板胫骨韧带（MMTL），该韧带将内侧半月板的前角固定于胫骨平台前部图1B).</li>
	<li>避免对胫骨平台或股骨髁的软骨造成损伤及长时间暴露。</li>
	<li>使用小型2 mm刀片的Vannas弹簧剪仔细切断内侧半月板胫骨韧带（MMTL），保留内侧半月板及其他韧带完整。至此，DMM模型的手术操作已完成。图1C).</li>
	<li>使用3 mm的显微外科刀，在胫骨关节软骨上从后部向前部方向标记三个等距的压痕。 
	注意：划痕长度约为1毫米，仅损伤软骨表面图2D).
	<ol>
		<li>不要对软骨施加过大的刀片压力（即确保划痕为表浅性）。此附加步骤会造成软骨损伤，从而诱导形成DCS模型。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用两到三个小型7 mm伤口闭合金属夹或可吸收的6-0皮下缝合线闭合皮肤（参见 材料表). 
	注意：皮下缝合线更优，因其可避免二次干预，但会延长手术时间。外部缝合线因小鼠啃咬而增加伤口裂开的风险。</li>
	<li>为假手术识别内侧半月板的内侧半月板胫骨韧带，但不切断。</li>
	<li>对于仅接受软骨划痕的小鼠，制作三条浅表划痕，但不要切断韧带。 
	&#8203;注意：每只小鼠之间需更换手套并对接仪器进行消毒 通过 高压灭菌。请记住，在重新使用前检查仪器是否已冷却。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>如果发生出血（&#62;50 µL），皮下注射500 µL温热的无菌生理盐水（注射部位为小鼠背部）。 
	注意：根据我们的经验，尽管小鼠可能会有轻微出血，但出血量从未超过一滴，因此无需补充液体。</li>
	<li>手术后，将小鼠置于恢复笼中，笼内铺有干净的纸巾，使其从麻醉状态中恢复（5-10 分钟）。</li>
	<li>手术后将完全清醒的小鼠转移至铺有新鲜垫料的清洁笼具中。</li>
	<li>术后72小时内，密切观察动物是否出现任何疼痛或痛苦的迹象。需重点关注：
	<ol>
		<li>体重变化。尽管体重可能在术后第一天和第二天有所下降，但通常不会超过术前体重的5%。</li>
		<li>切口周围普遍出现梳理毛发行为减少或过度梳理。</li>
		<li>出现总体健康状况恶化的迹象，例如弓背姿势、面部痛苦表情和/或呼吸异常。</li>
		<li>伤口感染，表现为任何肿胀、渗出或伤口裂开。 
		注意：如果手术伤口裂开，可能发生感染。由于手术伤口修复（例如，更换缺失的金属夹或重新缝合）属于受监管的程序，因此在进行修复前，必须获得相关批准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>术后5至7天内移除金属夹。</li>
	<li>根据研究设计，术后通常维持小鼠 2-52 周。</li>
	<li>在研究过程中的任意时间点评估疼痛/步态。 
	注意：本研究采用第5.1步所述的动态负重方法。</li>
	<li>根据国家许可协议、当地指南和实验审批，采用批准的方法对动物实施安乐死。 
	&#8203;注意：在本研究中，动物被实施安乐死 通过 在终末麻醉下经心脏穿刺放血后行颈椎脱位14.</li>
</ol>
5. 骨关节炎疾病的评估
<ol>
	<li>以动态负重测量作为替代指标&#160;按照以下步骤进行操作。 
	注意：由于小鼠属于被捕食动物，通常会隐藏疼痛行为，这使得疼痛的测量较为困难。目前有多种方法可用于测量诱发性疼痛，例如 von Frey15 步态分析16本研究在小鼠处于笼内时，使用压力垫测量了手术侧骨关节炎后肢与未手术对照侧后肢之间的负荷差异（参见 材料表, 图2A).
	<ol>
		<li>称量小鼠。根据制造商的具体说明对压力垫进行去皮和校准（参见动态承重设备中的 材料表将小鼠放入笼中。</li>
		<li>记录小鼠在笼内5分钟的运动和足底压力。根据制造商说明，分析采集的数据以验证1分钟内的结果。 
		注意：制造商在DWB软件上的自动分析（参见动态负重设备中的 材料表) 提供每只爪子相对于总体重的承重比例、每只爪子在有效时间内接触垫子的持续时间，以及每只爪子所占据垫子面积的估算值。这使得可以计算两只后爪之间的承重差异、前爪与后爪之间的承重差异、前爪承重的增加情况（若同一只小鼠在不同时间点被多次测量）、患有关节炎（OA）的腿与对侧腿相比抬离垫子的时间，以及爪子的接触表面积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过微型计算机断层扫描（µCT）定量分析钙化组织。 
	注意：尽管软骨下骨硬化和骨赘形成可在组织学切片中进行测量，但微计算机断层扫描（µCT）可实现三维定量分析。µCT成像分辨率达到5 µm已足够，因其可清晰显示骨赘等较小结构，但分辨率越高效果越好。
	<ol>
		<li>将膝关节置于4%多聚甲醛溶液中固定24小时，然后转移至70%乙醇中。</li>
		<li>使用 µCT 扫描仪扫描膝关节。 
		注意：在本研究中，样品使用µCT扫描仪进行扫描（参见 材料表使用0.5铝滤波片，在50 kV和200 µA条件下进行扫描。样品成像时的体素大小为4.5 µm，旋转角度为2 µm、0.2°，定量分析时旋转角度为0.5°。</li>
		<li>重建扫描以实现三维可视化。此处展示的扫描图像使用兼容软件进行重建（参见 材料表).</li>
		<li>分析软骨下骨硬化（图2B）按照以下步骤进行。
		<ol>
			<li>在内侧胫骨平台负荷中心选取一个感兴趣体积（VOI），大小为 0.5 mm × 0.9 mm × 0.9 mm17.</li>
			<li>通过分析未手术侧肢体来校正小鼠固有的骨表型差异。</li>
			<li>通过使用CTan软件，在二维冠状面图像序列中选择感兴趣区域（ROI），界定胫骨骨骺内的松质骨结构、软骨下板或全部软骨下骨，以确定软骨下骨密度及微结构。 材料表). 
			注意：随着疾病进展，软骨下板与软骨下小梁区域之间的界限变得越来越难以区分。此时建议分析从关节腔到生长板所选取的软骨下骨区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>量化骨赘（图2C）按照以下步骤进行。
		<ol>
			<li>使用 CTvol 软件在重建的三维图像序列中识别骨赘（参见 材料表). 
			注意：矿化的骨赘是类似编织骨的突起，可见于软骨下骨内侧。18黄色箭头指示了其中一个示例 图2C.</li>
			<li>手动计数膝关节内侧已识别的骨赘数量。</li>
			<li>使用CT分析仪通过2D连续图像分析测量骨赘体积，手动勾画从软骨下板突出的骨赘边缘，将其定义为感兴趣区域（ROI）进行分析。</li>
			<li>使用CT分析软件，通过骨体积与骨赘体积的比值来计算骨赘骨密度（参见 材料表).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估软骨损伤和滑膜炎图 2D根据OARSI软骨损伤评分19 和滑膜炎评分20 在石蜡包埋的6 µm切片上。
	<ol>
		<li>扫描后，将膝关节在4 °C条件下用10% EDTA脱钙至少2周，每周更换溶液两次。</li>
		<li>将样本包埋于石蜡中。有关处理方法和孵育时间，请参见 补充文件 1.</li>
		<li>在旋转式切片机上对石蜡包埋样品进行5 µm冠状切片（参见 材料表).</li>
		<li>选择胫骨和股骨髁相接区域的切片部位图2D）。在关节的三个等距区域中各选取两个部分。 
		注意：本研究中评分的切片选自相距80-100 µm的区域。</li>
		<li>用番红O和固绿对切片进行染色（参见 材料表）按照以下步骤进行。
		<ol>
			<li>将切片依次浸入二甲苯中5分钟（2次）、100%乙醇中2分钟、95%乙醇中2分钟、80%乙醇中2分钟和70%乙醇中2分钟，以脱蜡。</li>
			<li>用过滤后的苏木精染色（参见 材料表）30 秒。然后用自来水冲洗 5 分钟（冲洗三次）。</li>
			<li>用Scott缓冲液（1 L蒸馏水中含2 g碳酸氢钠和10 g硫酸镁）洗涤2分钟。用自来水冲洗5分钟（重复三次）。</li>
			<li>用0.2%快绿染色4分钟。在1%冰醋酸中浸洗五次（每次使用前新鲜配制）。用自来水快速冲洗。</li>
			<li>用0.5%沙黄-O染色5分钟，用95%乙醇冲洗。在100%乙醇中脱水3分钟，再在二甲苯中处理3分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照 Glasson 等人所述对软骨进行评分19 以及 Jackson 等人关于滑膜炎的研究20. 
		注意：其他定量方法也存在，例如 Pinamont 等人采用的基于计算机的定量方法。21.</li>
		<li>由两名对实验设盲的评分者对评分系统进行验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了进行创伤后骨关节炎（PTOA）的手术诱导，强烈建议有助手协助（例如，在操作者专注于手术时准备小鼠）。这有助于实现无菌手术，从而降低感染风险，并在大规模实验中提高操作效率。手术过程中容易失去焦平面，因此配备脚控调焦装置的显微镜有助于在整个手术过程中维持无菌状态，是一项重要功能。小鼠和膝关节的位置至关重要。膝关节必须朝上，并充分弯曲，以最大程度地打开膝关节腔，便于微刀进入并划伤髁面。识别内侧半月板胫骨韧带（MMTL）可能具有挑战性，尤其是在脂肪垫较大或出现少量出血的情况下。为避免出血，应将脂肪垫向上推移，防止撕裂及继发性出血。如果脂肪垫较大，此步骤可能需要更长时间，但应耐心持续向上推移。
内侧半月板胫骨韧带（MMTL）非常靠近胫骨髁，因此在将弯头弹簧剪刀的下部刀片置于MMTL下方时，必须小心避免损伤软骨。弯曲的刀片应朝向内侧并略微向上，与髁面平行。为了最佳地切开MMTL，应确保剪刀锋利。切断韧带后，检查半月板是否能够向内侧移动，因为有时会残留小的附着点，需要进一步剪切。当引入微刀片划痕髁面时，刀片必须垂直于髁面。第一次划痕应靠近关节中线，但注意不要损伤前交叉韧带。然后向内侧移动，再移至半月板后方。划痕可能在软骨表面呈现为浅白色的线条。由于我们通常使用钉合夹，初始切口位于外侧，这样在关闭伤口后，钉合夹位于腿部侧面，可避免小鼠恢复活动时钉合夹摩擦膝关节。若使用缝线，强烈推荐使用皮下缝合。如果使用体表缝线，小鼠可能会啃咬缝线导致伤口裂开，从而增加感染风险。操作正确时，该手术从切口到伤口闭合不应超过5-10分钟，从而最大限度减少软骨暴露及可能发生的额外非控制性损伤。术后小鼠恢复非常迅速，几乎能立即攀爬回笼并正常活动。若小鼠活动力不佳，应咨询单位内相关专业人员。
在疼痛的行为学评估中，采用了动态承重检测方法。然而，该方法的敏感性可能低于其他诱发性疼痛测试，例如 von Frey 测试15。建议采用多种方法联合监测和评估疼痛。在 DCS 干预后 2 周观察到的变化，尽管是暂时的，但表明与健康肢体相比，骨关节炎（OA）肢体的承重总体减少。因此，DCS 干预后 2 周可用于评估小鼠模型中早期骨关节炎或损伤引起的疼痛。通过 µCT 可对矿化的骨赘进行三维可视化，实现三维定量分析，并可与组织学切片相对应12，从而为研究骨赘的形成与演变提供额外维度。在我们研究组中，DMM 模型中不同操作者之间及同一操作者内部的骨赘出现情况存在差异（2.3 ± 1 vs. 1.2 ± 1，n &#62; 7，P = 0.0183），而 DCS 模型在所有情况下均能稳定诱导骨赘生成，且不受操作者影响（2.6 ± 0.7 vs. 2.4 ± 0.5，n &#62; 7，P = 0.711）。此外，DCS 模型中的骨赘数量显著更多、体积更大，相较于 DMM 模型更为明显。因此，DCS 是研究骨赘形成的理想模型。仅针对软骨下骨承重区域进行骨硬化定量分析，也有助于更灵敏地检测微小变化。将手术侧肢体的内侧间室与对侧肢体进行比较，还可用于校正个体小鼠固有的骨表型差异12。DCS 模型中加入的软骨划痕是一种可控的手术诱导方式，可造成局部软骨损伤，从而加速疾病多个方面的进展。由于实验操作中人为造成软骨本身损伤，这一人为因素造成的损伤需在软骨评分系统中予以排除或校正。鉴于这一局限性，若研究的主要目的是探讨骨关节炎对软骨本身的影响，我们不推荐使用该模型。最后，强烈建议至少由两名经盲法评估的研究人员对软骨损伤和滑膜炎评分进行评分，以验证并提高评分系统的标准化程度。
本研究的一个局限性在于，尚未充分评估DCS模型与DMM模型在所有参数上的变异程度。未来将通过更广泛的研究来解决这一问题，这些研究还可包括对来自不同机构的操作人员之间变异性的评估。
总之，当前DCS模型中加速的骨关节炎发病过程能够代表创伤后骨关节炎，并为研究和阐明驱动这种慢性致残性关节疾病的基本病理生理机制提供了一个强大而可靠的科研工具。此外，该模型还能够在更短的时间窗口内探索骨关节炎，重点关注骨赘形成、骨关节炎疼痛以及软骨损伤对整个关节的影响。

骨关节炎（OA）是45岁以上人群中最为常见的肌肉骨骼系统疾病，在英国已有超过875万人寻求治疗1。该疾病患病率不断上升，导致经济和社会负担加重，是致残的主要因素之一，并降低了患者的生活质量1。由于目前尚无有效的治疗方法，迫切需要加快研究以深入理解该疾病的发病机制及进展过程。骨关节炎具有复杂的多因素病因特征。该病的主要临床评估指标是疼痛和关节活动能力2，且OA影响关节内的所有组织，而不仅仅是软骨3。理解骨关节炎的主要挑战之一在于，从最初的症状出现或损伤到发展为具有疼痛和活动受限的临床症状，可能需要数年甚至数十年的时间。
在啮齿类动物中建立骨关节炎模型，使我们能够在更短的时间内深入了解骨关节炎的病理生理机制，并对相关组织进行详细检查，从而加深了对该疾病的认识。目前已有多种小鼠骨关节炎模型，包括基因修饰动物模型和手术干预模型。其中应用最广泛的小鼠创伤后骨关节炎模型是内侧半月板失稳术（DMM）4,5。该模型的一个局限性在于不同操作者之间存在操作差异。经验丰富的外科医生能够以最小的关节损伤完成手术，而经验不足的操作者则会延长关节囊暴露时间，并对软骨造成额外损伤。这种操作上的差异会影响模型的严重程度，初始损伤越大，软骨损伤评分越高，骨赘形成也越明显。为了减少操作者间的变异性，并模拟临床干预所导致的软骨损伤，研究人员开发了一种改良版模型，即在软骨表面人为制造三条浅表划痕，以施加可控的附加损伤6。这种方法还可用于模拟某些临床干预引起的软骨损伤所导致的骨关节炎进展。与标准DMM模型相比，这种直接诱导的软骨损伤在雄性小鼠中可导致更一致且加速的突出性骨赘形成、更严重的软骨损伤和炎症反应，以及可测量的替代性疼痛指标。
该模型特别适用于研究创伤后早期骨关节炎，重点关注骨赘形成、疼痛表现（在雄性小鼠中）、滑膜炎以及骨参数的早期变化。该模型中骨赘形成的稳定性使其成为研究骨修复和软骨内成骨的理想选择，因为骨赘形成本身就是一种修复过程。 通过 软骨内成骨7该模型还可模拟临床干预（如关节镜手术）过程中对软骨造成的直接损伤，因此也适用于研究软骨损伤对整个关节的影响。

<table><tbody><tr><td>#11 手术刀片（及手术刀柄）</td><td>World precision instruments</td><td>500240</td><td>进入关节囊</td></tr><tr><td>15&amp;deg; 切割角显微外科穿刺刀</td><td>MSP</td><td>REF7503</td><td>刮擦软骨</td></tr><tr><td>6-0 Vicryl Rapid缝线</td><td>任意医疗用品供应商</td><td>-</td><td>关闭伤口的替代方法</td></tr><tr><td>麻醉装置</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>抗菌皮肤清洁剂（Hibiscrub）</td><td>Amazon</td><td>-</td><td>用于手术区域皮肤的消毒</td></tr><tr><td>7 mm 夹子施用器</td><td>World precision instruments</td><td>500343</td><td>关闭伤口</td></tr><tr><td>天平</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>称量小鼠体重</td></tr><tr><td>钝头弯镊</td><td>Fine science tools</td><td>500232</td><td>将髌韧带移至一侧</td></tr><tr><td>布托啡诺（Vetergesic）</td><td>由单位提供，因其为处方药</td><td>-</td><td>镇痛</td></tr><tr><td>CT 分析软件</td><td>Bruker</td><td>3D.SUITE software</td><td>软件</td></tr><tr><td>Ctvol</td><td>Bruker</td><td>3D.SUITE software</td><td>软件</td></tr><tr><td>数据查看器</td><td>Bruker</td><td>3D.SUITE software</td><td>软件</td></tr><tr><td>动态负重测量设备</td><td>Bioseb</td><td>BIO-DWB-DUAL</td><td>测量肢体负荷，包含笼具、压力垫及分析软件</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>E9884</td><td>在 PBS（或水）中配制成 10% 溶液，用于脱钙骨组织，pH 7.4</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>用于包埋脱钙骨组织</td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Merck</td><td>F7252</td><td>用于切片染色</td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>Merck</td><td>1005706</td><td>用于切片染色</td></tr><tr><td>苏木精溶液</td><td>Merck</td><td>GHS132</td><td>石蜡切片中的细胞核染色</td></tr><tr><td>Hoskins #21 显微镊</td><td>Cameron surgical limited</td><td>PHF1085</td><td>移动脂肪垫</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>由单位提供，因其为处方药</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>Charles river</td><td>-</td><td>C57Bl6/J 雄性，8 周龄（用于在实验单位内适应环境）</td></tr><tr><td>显微计算机断层扫描仪</td><td>Bruker</td><td>SKYSCAN 1272 CMOS</td><td>&amp;micro;CT</td></tr><tr><td>Micropore 外科纸胶带</td><td>FisherScientific</td><td>12787597</td><td>固定腿部位置</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>用于包埋脱钙骨组织</td></tr><tr><td>Reflex 7 mm 不锈钢伤口夹或</td><td>Fine science tools</td><td>12032-07</td><td>关闭伤口</td></tr><tr><td>7 mm 夹子移除器</td><td>World precision instruments</td><td>500347</td><td>移除伤口夹</td></tr><tr><td>旋转式切片机</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>用于切割石蜡包埋组织的切片</td></tr><tr><td>番红-O</td><td>Merck</td><td>S2255</td><td>用于切片染色</td></tr><tr><td>带齿弯镊</td><td>Fine science tools</td><td>15915</td><td>夹持皮肤</td></tr><tr><td>无菌铺巾</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>确保手术区域无菌</td></tr><tr><td>带孔无菌铺巾</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>覆盖小鼠并暴露腿部</td></tr><tr><td>无菌生理盐水</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌外科铺巾</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>维持手术器械的无菌环境</td></tr><tr><td>带孔无菌外科铺巾</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>覆盖小鼠并使腿部通过孔洞露出</td></tr><tr><td>直剪刀</td><td>World precision instruments</td><td>14393</td><td>切开伤口</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>可调焦</td></tr><tr><td>带 2 mm 刀片的 Vannas 弹簧剪刀</td><td>Fine science tools</td><td>15000-04</td><td>切断 MMTL</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>通用（多个不同供应商）</td><td>-</td><td>用于包埋脱钙骨组织</td></tr></tbody></table>

内侧半月板失稳与软骨划痕小鼠加速性骨关节炎模型

Destabilization of the Medial Meniscus and Cartilage Scratch Murine Model of Accelerated Osteoarthritis

骨关节炎是45岁以上人群中最常见的肌肉骨骼疾病，导致日益增加的经济和社会负担。动物模型被用于模拟该疾病的多个方面。本方案描述了一种创伤后骨关节炎的失稳与软骨划痕模型（DCS）。该模型基于广泛使用的内侧半月板失稳（DMM）模型，通过在软骨表面制造三条划痕而建立。本文重点介绍了通过切断内侧半月板胫骨韧带使膝关节失稳，随后在关节软骨表面进行三次有意的浅表划伤的操作步骤。同时展示了通过动态负重检测、显微计算机断层扫描（micro-CT）以及组织学进行可能的分析方法。尽管DCS模型不推荐用于重点研究骨关节炎对软骨本身影响的研究，但它能够在更短的时间窗口内促进骨关节炎发展的研究，特别适用于以下三个方面：（1）骨赘形成；（2）骨关节炎及损伤相关疼痛；（3）软骨损伤对整个关节的影响。

后肢操作侧/OA 腿占总体重的负荷百分比与对侧/对照腿进行比较。尽管其他参数也可能显示显著差异，例如手术干预后前爪负荷增加，但后爪负荷的一致性变化表明小鼠更倾向于使用某一条腿，这是由于 OA 发展导致小鼠明显不适的更直接指标。在 DMM 模型中，诱导后 8 周内后肢负荷无显著变化，而 DCS 小鼠在干预后 2 周即显著倾向于使用对侧/对照腿图 3A).
通过聚焦胫骨髁内侧负重区域下方的体积，对软骨下骨进行分析。在此，通过测定感兴趣区域内矿化骨所占的百分比，评估该区域的骨密度，并计算对侧与同侧肢体之间的比值。该比值表明，在造模后4周，两种模型的患肢骨密度均有所增加（比值大于1）（图3B）。骨赘的形成在DCS模型中更为显著，在干预后2周，其数量和体积均明显高于DMM模型（图3C、D）。在造模后4周，DCS模型在胫骨内侧和股骨内侧 compartment 表现出更严重的软骨损伤以及滑膜炎（图3E、F）。
<img alt="手术步骤：暴露膝关节囊、切断韧带、刮擦软骨。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：在小鼠中诱导创伤后骨关节炎的手术干预。连续图像展示了手术过程的不同阶段。（A）通过在髌韧带内侧、远离韧带的位置插入11号手术刀片，切开膝关节周围的浅层膜，暴露关节囊。此操作将暴露髌下脂肪垫。（B）识别并横断内侧半月板胫骨韧带。为识别该韧带，将髌韧带向侧方移动，然后向上推挤脂肪垫。这可使韧带显现为胫骨髁上方的一条细小横向白线（图中以黑箭头指示）。切断韧带时，将弹簧剪刀的下刃置于韧带下方，注意避免损伤软骨。将半月板向内侧移动，以更好地观察胫骨髁。（C）刮擦暴露的软骨表面并缝合伤口。刮擦软骨时，将微型刀片朝向关节后方插入，接触软骨后向前移动至关节前方。完成刮擦后，将皮肤拉回覆盖膝部，通过皮下缝合或伤口夹闭合切口。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小鼠骨关节炎评估：动态承重分析、骨参数和组织学评分示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：小鼠骨关节炎的评估。（A）动态承重分析通过将压力垫上的负荷与相应足爪匹配实现，负荷以总体重的百分比表示。（B）通过在胫骨内侧髁的承重区域选择感兴趣体积，并选取软骨下板或小梁骨来测量软骨下骨。这些图像的分辨率为 4.5 µm。（C）在获取的 µCT 图像的三维视图中识别并量化骨赘。通过选择划定骨赘边缘的感兴趣区域（ROI）来测量骨赘体积。骨密度计算为骨体积占骨赘总体积的比例。此处展示的图像分辨率为 2 µm，但通常使用 4.5 µm 分辨率进行量化。（D）软骨和滑膜炎评分取自经藏红O-快绿染色的 6 µm 切片。显示小鼠膝关节的冠状切面，其中用黑框标记的所有四个象限均可见用于评分，并展示了内侧的放大图像。膝关节内侧周围的滑膜炎也可见，尤其是在移位的半月板上方和下方。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="动态负重负荷图；骨参数、组织学评分；DMM、DCS 研究结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64159/64159fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：DMM 和 DCS 模型中骨关节炎的代表性评估。（A）由同一位经验丰富的操作者进行实验，诱导后 8 周内的动态负重（DWB）测量结果。负荷以手术侧/骨关节炎侧负荷与对侧/对照侧负荷的比值表示。图中还展示了假手术（灰色）、DMM（蓝色）和 DCS（粉色）模型双侧后肢的配对 t 检验结果。术后 4 周进行 µCT 分析。（B）术后 4 周分析软骨下骨，并以同侧与对侧 %BV/TV 的比值表示。（C）骨赘数量和（D）骨赘体积在诱导后 2 周进行分析。（E）内侧胫骨和股骨关节软骨的软骨损伤以及（F）滑膜炎的组织学评估在诱导后 4 周进行，并采用标准化方法评分19,20。数据以均值 ± 标准差表示，n ≥ 5。采用重复测量方差分析（Šídák 校正）（A）、配对 t 检验（A）或标准 Student's t 检验（B-F）进行组间比较。*P &lt; 0.05，**P &lt; 0.01，***P &lt; 0.001，ns = 无显著性差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：石蜡包埋的处理与孵育条件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64159/64159_Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本实验方案描述了在切断小鼠内侧半月板胫骨韧带以使膝关节失稳后，对关节软骨表面进行可控的微刃划伤操作。该动物模型可诱导骨关节炎（OA）的加速发展，适用于研究骨赘形成、骨硬化以及早期疼痛等病理过程。

骨关节炎是45岁以上人群中最常见的肌肉骨骼疾病，导致经济和社会负担日益增加。动物模型是……

该方法模拟了人类创伤后骨关节炎的多个方面，使我们能够在较短时间内研究该疾病以及潜在疗法的影响。该技术的主要优势在于，短期内（干预后仅两周），小鼠即表现出稳定且可测量的骨赘形成，以及患肢负重改变等提示疼痛的迹象。我们推荐将此模型用于骨赘形成、软骨内成骨以及损伤诱导性疼痛的研究。内侧半月板胫骨韧带的识别与切断可能具有挑战性，因此我们建议在尸体标本上进行练习，直至操作熟练。协助演示该手术步骤的是肌肉骨骼科学中心的研究助理 Lynette Dunning。首先，指定一个无菌手术室以进行手术操作，并确保所有台面均处于无菌状态。将无菌器械摆放在无菌铺巾上。然后称量小鼠体重。使用小型毛发剪，在麻醉小鼠的膝关节区域，从胫骨中段至大腿中段的前侧和外侧，剪除膝关节周围的毛发。使用抗菌皮肤清洁剂对剃毛后的暴露皮肤进行消毒。为镇痛，皮下注射0.05毫克/千克的丁丙诺啡。将小鼠置于背侧卧位，使待手术的膝盖朝上，并将小鼠的鼻部放入连接麻醉装置的鼻管中。用无菌手术巾覆盖小鼠，中央留出一个小的钥匙孔状开口。将待手术的后肢固定，使膝关节弯曲角度小于90度，髌韧带朝上，并用手术胶带固定足部。调节显微镜，使其聚焦于髌韧带。用有齿镊夹住膝关节外侧的皮肤。使用手术剪刀沿髌腱远端平行方向做一个小切口。插入剪刀并将切口扩大至约10毫米。将皮肤移向内侧，暴露髌韧带和近端胫骨平台。使用11号刀片，沿髌韧带内侧从上至下做切口。当到达髌韧带底部时，将刀片转向90度，并将切口从髌韧带向外侧延伸，以进入关节囊。用钝头镊子夹住髌韧带，旋转手腕将其轻轻移向外侧，足以暴露髌下脂肪垫（IFP）即可。在仍轻夹髌韧带的同时，用显微镊子夹住IFP并轻轻提起，稍向上移动。若出现出血，用棉签施加压力止血。确定内侧半月板的胫骨韧带（MMTL），该韧带将内侧半月板的前角固定于胫骨平台前部。使用小型两毫米刀片弹簧剪仔细切断MMTL，保留内侧半月板及其他韧带完整。用3毫米显微外科刀，在胫骨关节软骨表面从后向前方向标记三个等距的压痕。使用两到三个小型的7毫米伤口闭合金属夹关闭皮肤。术后5至7天内拆除金属夹。随后，在研究期间的任何时间点评估疼痛或步态。通过分析膝关节的Micro-CT扫描图像来定量钙化组织。为分析软骨下骨硬化，选择内侧胫骨平台负荷区域中心的体积兴趣区（VOI）。然后，在CT分析软件中，利用二维冠状面图像序列，选择划定胫骨骨骺、软骨下骨板或整个软骨下骨中松质骨结构的感兴趣区域，以确定软骨下骨密度及微观结构。使用 CTVol 软件在重建的三维图像堆栈中识别骨赘。根据 OARSI 软骨损伤评分19和滑膜炎评分20，评估石蜡包埋的5微米切片中的软骨损伤和滑膜炎。在DMM模型中，诱导后八周内后肢负荷无显著变化，而DCS小鼠在干预后两周显著偏好对侧（即对照侧）肢体。对侧腿与同侧腿的比值表明，两种模型在造模后四周，患肢的软骨下骨负荷区域骨密度均有所增加。与DMM模型相比，DCS小鼠的骨赘形成更为明显，在干预后两周骨赘的数量和体积均显著增加。DCS模型在造模后四周表现出内侧胫骨和股骨关节间室的软骨损伤加重，以及滑膜炎。 应将损伤限制在我们有意影响的结构范围内，因此需要特别注意保持所有其他结构的完整性，并尽量减少软骨的暴露。通过引入有意的软骨划痕 modification，我们可以专注于骨赘形成、早期骨关节炎或损伤疼痛等方面来研究骨关节炎，以及软骨损伤对整个关节的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

加速性骨关节炎内侧半月板和软骨划痕鼠模型的不稳定

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建立小鼠手术诱导模型以研究颗粒体蛋白前体在骨关节炎中的保护作用

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实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

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内侧半月板失稳与软骨划痕小鼠加速性骨关节炎模型

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