Name: 确定热水洗涤的病毒消毒效果 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: 了解热水洗涤对口罩、牛仔布和棉质手术服的病毒消毒效果。本研究使用Phi6噬菌体作为模型生物，建立了可重复的标准化消毒方案，为公共卫生紧急情况下的个人防护装备清洁提供科学依据。

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美国环境保护署（EPA）通过其研究与发展办公室，在与雅各布斯技术公司（Jacobs Technology Inc.）签订的EP-C-15-008项目下主导了本文所述的研究工作。本研究已通过该机构的审查，但未必反映该机构的观点，不应推断出任何官方认可。EPA不认可购买或销售任何商业产品或服务。作者谨向EPA合同人员Denise Aslett致谢，感谢其对EPA RTP微生物学工作的监督；感谢Brian Ford、Rachael Baartmans和Lesley Mendez Sandoval在EPA RTP微生物学实验室为本项目所做的工作；感谢Ramona Sherman提供EPA质量保证审查；并感谢Worth Calfee和Shannon Serre提供EPA技术审查。

Phi6 由合作实验室提供，为约 1 mL 的冷冻等分试样，保存于 -80 °C 直至使用。最初用于扩增更多病毒储备液，随后也储存于 -80 °C 以备后续使用。选择 Phi6 作为示范病毒，是因为它常被用作包膜病毒的模型，能够扩增至高滴度，且检测时仅需较低生物安全级别的实验室22,23,24。
1. 准备病毒储备液
<ol>
	<li>使用下述改良的胰蛋白胨大豆琼脂培养基制备方法和软琼脂覆盖法，在细菌宿主Pseudomonas syringae中扩增噬菌体Phi6。
	<ol>
		<li>通过称量并混合表1中的成分于去离子水中，制备改良胰蛋白胨大豆琼脂培养基。</li>
		<li>取1 mL光密度（OD600）在0.9至1.5之间的P. syringae菌液，加入100 mL改良胰蛋白胨大豆肉汤（表1）中，于室温（20–26 °C）下在摇床中约260 rpm振荡培养，制备P. syringae的过夜培养物。</li>
		<li>将约6 mL改良胰蛋白胨大豆琼脂分装至试管中，盖上可高压灭菌的盖子，制备软琼脂管。4 °C保存备用。使用前于121 °C高压灭菌15分钟以融化琼脂，随后置于48 °C水浴中保温待用。保持48 °C平衡至关重要，否则病毒在实验过程中可能失活。</li>
		<li>将1 mL未稀释的浓缩病毒样品与100 µL对数生长期（OD600为0.9至1.5）的P. syringae培养物加入软琼脂中，混匀后倾注于已凝固的直径100 mm改良胰蛋白胨大豆琼脂平板表面。为防止产生气泡或溢出，轻轻旋转平板使软琼脂均匀覆盖于固体琼脂表面，随后于室温下过夜培养。</li>
		<li>用无菌细胞涂布器轻轻刮取三个平板的内容物，收集至含有15 mL SM缓冲液的无菌50 mL锥形管中25。在最大转速下涡旋震荡1–2分钟以充分打碎琼脂，随后在7,000 ×g离心15分钟。</li>
		<li>移除上清液，并通过0.2 µm注射器滤器过滤。将1 mL分装至冻存管中，于-80 °C保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 对个人防护装备物品进行使用前视觉检查
<ol>
	<li>将每件个人防护装备（PPE）放置在清洁、平整的表面上（例如，覆盖一次性纸垫的实验台）。每件PPE需重复检测三次。</li>
	<li>确保PPE检查过程中有适当的照明。在不同位置测量并记录未清洗物品的长度和宽度（图1）。</li>
</ol>
<img alt="服装尺寸示意图；裤子、衬衫、袜子的测量部位；前幅宽度、领围、挂环等。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1．个人防护装备（PPE）预测试评估的测量位置。 牛仔布、刷织布和面部覆盖物上用于记录长度以追踪洗涤过程中材料变化的测量位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 准备试件
<ol>
	<li>通过裁剪个人防护装备（PPE）制备尺寸为 2 cm × 4 cm 的测试样片，每种面部遮挡物准备两个样片（共测试三种面部遮挡物），每条牛仔裤准备五个样片（共测试三条牛仔裤），每件刷手服准备三个样片（共测试三件刷手服）。</li>
	<li>为每种材料类型准备一组未接种但将进行洗涤的 2 cm × 4 cm 程序空白样片（每组对应一件完整尺寸的 PPE 产品）。面部遮挡物实验的每一天准备两个空白样片，牛仔裤实验的每一天准备五个空白样片，刷手服实验的每一天准备三个空白样片。</li>
	<li>准备一组 2 cm × 4 cm 的阳性对照样片，该组样片将进行接种但不洗涤。面部遮挡物实验的每一天准备两个样片（共测试三种面部遮挡物），牛仔裤实验的每一天准备五个样片（共测试三条牛仔裤），刷手服实验的每一天准备三个样片（共测试三件刷手服），另加三个不锈钢样片。 
	​注：根据物品尺寸的不同，选择的重复样片数量也不同。例如，在面部遮挡物上粘贴五个样片在物理上存在困难，而两个样片在牛仔裤上所覆盖的面积有限。样片位置的选择旨在最大化覆盖范围，并包括在洗涤过程中可能被折叠、更难清洁的区域。</li>
</ol>
4. 进行接种
<ol>
	<li>配制10%牛肉浸膏溶液：将1 g牛肉浸膏溶解于终体积10 mL的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用滤器对全部溶液进行过滤除菌 0.2 µm 注射器滤器.</li>
	<li>将第1节制备的病毒储存液在室温下解冻。使用当天，加入 100 µL 解冻后的Phi6病毒储备液 900 µL 10% 牛肉浸膏溶液</li>
	<li>接种测试样本片和阳性对照样本片，接种量约为107 每样本空斑形成单位（PFU）通过移液操作 10 µL 将一滴溶液滴加到个人防护装备（PPE）物品上，并用移液器吸头尖端铺展液滴。根据PPE材料的不同，液滴会以不同方式发生分离和再聚集。</li>
	<li>在生物安全柜中使接种后的试片干燥。确定干燥时间 通过 根据您特定材料的实际情况进行观察。本文所呈现结果采用的时间如下： scrub（刷手服）= 干燥30分钟；face-covering（面部遮盖物）= 干燥60分钟；denim（牛仔布）= 干燥30分钟；stainless steel（不锈钢）= 干燥120分钟。</li>
	<li>根据以下步骤将接种后的试件固定到完整尺寸的个人防护装备物品上 图2 使用安全别针和无菌技术。</li>
</ol>
<img alt="显示牛仔裤、衬衫和口罩在制造过程中标签位置的服装示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2．牛仔布、刷手服和面部遮盖物上的测试样片位置。 字母 A-D 对应于所有洗涤实验中唯一的样片标识符。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
5. 进行洗涤
<ol>
	<li>按如下方法配制洗涤剂。
	<ol>
		<li>将用于洗衣机的自来水灭菌，并收集10 mL经高压灭菌的水样用于无菌检测。本实验方案中，将7 L自来水在液体循环模式下高压灭菌60分钟。</li>
		<li>根据制造商的稀释说明配制洗涤液。本实验方案中，将1.54 mL洗涤剂溶解于3.5 L无菌自来水中。将洗涤液加热至 50 °C 使用加热板和搅拌子进行搅拌。测量并记录洗涤溶液的pH值和温度。取10 mL溶液用于无菌检查。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将洗涤液倒入已灭菌的清洗机中（3.25 L）。每次测试之间，使用250 ppm过氧化氢蒸汽处理4小时对清洗机进行预灭菌。</li>
	<li>将个人防护装备放入已灭菌的洗衣机中。每台洗衣机加入一条牛仔裤和一件刷手服上衣。每台洗衣机加入一个接种了污染物的面部覆盖物和四个未受污染的填充口罩；填充口罩未附着试样片。</li>
	<li>用常规振荡方式对个人防护装备（PPE）进行清洗，每次清洗9分钟，共清洗两次，总计18分钟. 排空洗衣机，并用室温自来水（每次5 L）彻底漂洗三次，以去除泡沫。向洗衣机中加入室温灭菌自来水（3.25 L），运行一次时长为9分钟的漂洗程序。</li>
	<li>将个人防护装备（PPE）移至洗衣机的甩干侧，甩干5 min。将个人防护装备（PPE）转移至烘干机，在高温设置下烘干80 min。93 °C).</li>
	<li>将个人防护装备从干燥器转移至无菌工作区，无菌操作取出每件物品上的试样片，放入锥形管中。预先在管中加入10 mL 10% Dey-Engley肉汤提取缓冲液，并用铝箔覆盖。</li>
</ol>
6. 从样本片中提取并定量病毒载量
<ol>
	<li>使用10 mL含10% Dey-Engley中和肉汤的溶液，将试样在设备最大转速下涡旋振荡2分钟进行洗脱。</li>
	<li>采用传统的软顶层琼脂覆盖法进行提取物涂布26。
	<ol>
		<li>按照第1节所述方法准备软质改良胰蛋白胨大豆琼脂管和P. syringae菌种培养物。测试当天，在121 °C条件下高压灭菌琼脂管15分钟以融化琼脂。将软琼脂保持在48 °C直至涂布使用。保持48 °C的平衡温度至关重要，否则病毒在检测过程中可能因热失活。</li>
		<li>针对洗涤研究中使用的每个测试样品，用1×磷酸盐缓冲液制备十倍系列稀释液。涂布时同时使用连续稀释的（100 µL）以及未稀释的（1 mL和100 µL）等分试样。</li>
		<li>将测试样品的等分试样加入含有6 mL软琼脂和100 µL对数生长期P. syringae菌液（OD600介于0.9–1.5之间）的软琼脂管中。将软琼脂倾注至已凝固的改良胰蛋白胨大豆琼脂平板表面，并通过轻轻旋转平板使软琼脂均匀分布于底层琼脂表面。</li>
		<li>将平板在室温下孵育过夜，次日通过计数各平板上的噬菌斑形成单位进行人工计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 对个人防护装备（PPE）进行使用后的视觉检查
<ol>
	<li>记录测试中使用的各种个人防护装备（PPE）的以下情况：褪色、变色和/或损坏迹象（例如撕裂、拉伸）；异味；小孔、切口或撕裂（可使用小手电筒检查损坏）；分层、缺线、封边损坏的区域；缝线或拉链损坏；测量并记录弹性材料的拉伸程度。</li>
</ol>

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<li>Fedorenko, A., Grinberg, M., Orevi, T., Kashtan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+the+enveloped+bacteriophage+Phi6+%28a+surrogate+for+SARS-CoV-2%29+in+evaporated+saliva+microdroplets+deposited+on+glass+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Survival of the enveloped bacteriophage Phi6 (a surrogate for SARS-CoV-2) in evaporated saliva microdroplets deposited on glass surfaces.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).</li>
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</ol>

已知不存在需要披露的利益冲突。

本方案旨在通过系统的实验室测试，评估对全尺寸个人防护装备（PPE）或服装进行洗涤后病毒消毒效果的有效性。文中所述步骤详细说明了病毒的制备、测试材料的接种、洗涤（机洗和烘干）过程对物品影响的评估，以及洗涤后病毒载量减少程度的定量分析。此外，本方案还列出了必要的质量控制样本，以确保实验不受污染干扰，并明确了应在多次洗涤循环后记录的测量值和观察项，用于追踪PPE物品的材料完整性。使用Phi6病毒的实验结果表明，本方案中采用的热水洗涤工艺可使所有测试样品（面部覆盖物、刷手服和牛仔裤）的病毒载量降低超过3个对数级。病毒载量的减少在PPE/服装的不同位置均表现出一致性。为实现3个对数级的减少效果，本方案需使用高病毒载量及稳定剂（牛肉提取物），但这些条件可能无法代表所有实际场景中的污物负荷情况。
选择小型洗衣机和紧凑型烘干机，旨在在空间受限的环境中优化可进行的重复实验次数，同时便于实验室人员管理设备灭菌和实验过程中所用水量。由于使用了小型洗衣机，漂洗步骤需手动完成，而大多数家庭洗衣程序则为全自动操作。还需注意的是，机器洗涤在发达国家占主导地位，但手洗在全球范围内仍普遍存在15。此外，部分人群可能无法获得用于洗涤的热水，另一些人则倾向于自然晾干衣物而非使用机器烘干。本实验方案未涵盖这些洗衣方式的差异，但可通过简单修改进行研究，例如将洗涤和烘干步骤替换为使用水桶和晾衣绳。
在科学文献中，针对病毒污染的面部遮挡物和日常衣物的大规模清洁/消毒研究极为有限。更常见的研究是评估面部遮挡物在反复洗涤和干燥后的过滤性能，但并未评价其病毒灭活效果27,28。例如，Clapp 等人评估了布口罩和改良手术口罩的贴合过滤效率，发现其性能差异较大，而简单的改进可提高密合度和过滤效率29。另一项研究考察了四种不同材质布口罩的过滤效率30，同样聚焦于传染源控制或个人防护。这可能是由于同一实验室中难以同时具备微生物学检测和机械性能测试的专业能力。本文所提出的方案不仅评估了消毒效果，还同时考察了材料的降解情况。
近期，科学文献中已发表多种针对一次性呼吸防护用品（主要是N95口罩）的去污/消毒方法31,32,33。之所以主要关注过滤式面罩呼吸器（FFR，例如N95口罩），是因为其为医护人员及其他一线工作人员提供了关键的呼吸防护。用于呼吸器去污的主要技术包括气化过氧化氢（VHP）、紫外杀菌辐射（UVGI）以及湿热（蒸汽）以灭活病毒。Viscusi等人评估了五种FFR去污方法，发现UVGI、环氧乙烷和VHP是最具前景的去污方法31。Fischer等人则评估了四种不同的去污方法——紫外光、干热、70%乙醇和VHP——在降低SARS-CoV-2污染方面的效果及其对N95呼吸器功能的影响32。此外还有大量关于FFR有效去污技术的研究，这些研究已在2020年被系统总结并发表33。然而，这些专业方法并不适用于普通家庭用户或小型企业主安全操作，也未针对此类人群设计。
本实验方案采用Phi6进行所有测试，Phi6是一种包膜噬菌体，与SARS-CoV-2相似，具有刺突蛋白，大小也相近（80–100 nm）34。由于Phi6并非已知病原体，可在普通的微生物生物安全一级（BSL-1）实验室中操作。对Phi6有效的消毒方法可能对其他包膜病毒也有效，但针对每种目标病毒仍需进行实证验证35。通过使用一种与病原病毒相似但无致病性的病毒作为替代物，期望本方案可在其他地方重复使用，并用于研究未来的病毒性流行病或大流行病。未来的研究可进一步包括在洗涤剂之外使用消毒剂（如漂白剂），以及建立标准化的手部清洗和晾干操作流程。

2019冠状病毒病（COVID-19）大流行导致全球供应链出现前所未有的中断，造成许多物品严重短缺，包括基本的个人防护装备（PPE）1,2,3。处于高风险职业的人员不得不采用推荐的危机应对策略，公众也转而使用非专业物品（如布料制成的面部遮挡物），主要用于传染源控制，同时也为佩戴者提供一定程度的呼吸防护。在美国，专业呼吸防护设备（即过滤式面罩呼吸器（FFRs），如N95）在供应短缺期间被保留给部分高风险职业（例如医疗卫生行业）使用4。在严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）传播途径尚不明确的初期，其他多种类型的服装材料也曾被考虑作为屏障防护手段5。随着用于防护的织物种类日益多样，关于这些物品的使用、重复使用以及消毒/去污的问题随之出现。尽管在美国普遍认为，常规的家庭洗衣机清洗口罩及其他衣物可使表面病毒失去感染性，但支持这一观点的数据十分有限，且缺乏已发表的实验室操作规程。本文所呈现的研究方案旨在提供一个实验室操作流程的范例，用于开展洗涤研究并获取有关病毒消毒效果的数据。该方案虽为应对COVID-19大流行期间的研究需求而制定，但其设计意图是作为可适用于其他病毒消毒研究的通用框架。
衣物在疾病传播中的作用是一个难以量化的概念。国际家庭卫生科学论坛试图通过综述衣物在传染病传播中的作用，并结合家庭卫生实践的风险评估，来完成这一具有挑战性的任务6。该工作包括对多项科学研究的综述，这些研究考察了不同病毒株（如痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、呼吸道合胞病毒、疱疹病毒和流感病毒）在羊毛、棉布等不同类型织物上的存活情况7,8,9,10,11。不同病毒在织物上的存活时间因病毒与材料的组合而异，范围从30分钟到5个月不等。其中一些研究还证明了病毒污染可从织物转移到手上。作为该出版物的一部分，研究讨论了有效洗涤作为减少传播的重要管理手段，但也指出洗涤在降低疾病负担方面的影响程度取决于特定的病毒污染物，且难以量化7,8,9,10,11。
洗涤过程通过化学、物理和热处理方法来灭活微生物。例如，肥皂和洗涤剂可以去除污垢，并可能产生一定的化学介导抗菌作用。从物理角度来看，稀释和搅动有助于降低病毒载量。一项研究考察了人冠状病毒HCoV-OC43在棉布片上的存留情况，在使用工业和家用洗涤程序时，无论是否加热或添加洗涤剂，结果发现：在未加热且不使用洗涤剂的水中洗涤时，病毒无法被检出；但在存在污垢负荷（人工唾液）的情况下，家用洗涤程序需要添加洗涤剂才能使样本中的病毒载量降至不可检出水平12。热水本身也可有效灭活部分微生物13,14。
在最近一篇总结当前洗衣实践现状的出版物中，织物成分、储存条件、污垢负荷、洗涤温度和时间以及干燥温度等多种因素被确定为全球洗衣实践中存在差异的因素15。尽管洗衣是大多数人群常用的清洁方法，但现有实践中的巨大差异使得在物品可能被病毒污染的情况下，制定关于如何安全有效地进行洗衣的详细指导变得困难且稀少。在新冠疫情期间，美国疾病控制与预防中心（CDC）发布了针对家庭用户的洗衣指导建议16,17。这些洗衣建议主要基于几项较早的关于细菌消毒的研究18,19，并得到若干台式实验研究的支持，这些研究表明包膜病毒在含有洗涤剂的水中可被灭活20,21。该建议可概括为：1）遵循洗涤剂制造商的说明；2）使用适宜的最高水温；3）将物品彻底干燥。这些建议的理论依据是，在尽可能高的温度下使用洗涤剂洗涤，并结合彻底干燥（如有条件可加热），能够灭活SARS-CoV-2病毒。
洗涤过程中可能存在的变量数量极为庞大，因此必须采用统一的实验方案（例如本文所述方案），以隔离变量并测试特定洗涤流程的病毒灭活效果。本方案结合教学视频，旨在展示一种可在其他研究中复制的基于实验室的热水洗涤流程。此外，该病毒灭活效果测试的结果应有助于增强消费者对病毒大流行期间家庭洗涤有效性的信心。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;-80℃冰箱 &amp;deg;C)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>FDE30086FA</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;加热板</td><td>VWR</td><td>97042-714</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;安全别针（钢制）</td><td>辛格</td><td>319921</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;沙克尔</td><td>Lab-Line Instruments, Inc.</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;SM 缓冲液</td><td>Teknova&amp;nbsp; 霍利斯特，加利福尼亚州</td><td>S0249</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;注射器滤器（0.2 &amp;mu;m)</td><td>康宁，纽约州，康宁</td><td>PES 注射器滤器，431229</td><td></td></tr><tr><td>1X 磷酸盐缓冲液</td><td>Teknova，加利福尼亚州霍利斯特</td><td>P0196，10倍浓度 PBS 溶液</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌帽盖</td><td>DWK生命科学公司，新泽西州米利维尔</td><td>KIM-KAP 胶囊，73663-18</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌</td><td>Steris</td><td>AMSCO 250LS 蒸汽灭菌器 型号 20VS</td><td></td></tr><tr><td>牛肉浸膏</td><td>Sigma-Aldrich，Millipore Sigma，美国密苏里州圣路易斯</td><td>货号 B4888-100g</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>细胞涂布棒</td><td>布塞医院一次性用品</td><td>23600894</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004271</td><td>Heraeus MegaFuge 16R 离心机</td></tr><tr><td>认证计时器</td><td>https://nist.time.gov/</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 一次性锥形离心管</td><td>康宁生命科学</td><td>352098</td><td>Falcon 50 mL 高透明度聚丙烯锥形离心管</td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>AY509X33</td><td></td></tr><tr><td>牛仔布</td><td>驯马者</td><td>Rustler 常规合身直筒牛仔裤 四口袋牛仔裤，配圆口前袋，PN:87619PW</td><td></td></tr><tr><td>去垢剂</td><td>宝洁公司</td><td>Tide 原香型液体洗衣液 产品编号（PN）：003700023068</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>Dey-Engley 中和肉汤</td><td>Becton Dickinson</td><td>DF0819172</td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>魔术厨师</td><td>MCSDRY15W</td><td></td></tr><tr><td>口罩</td><td>猫科</td><td>可重复使用有机棉口罩，货号：990121P4</td><td></td></tr><tr><td>培养箱（顶层琼脂）</td><td>交响曲</td><td>414004-596</td><td></td></tr><tr><td>实验记录本</td><td>Scientific Notebook Company</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>培养基灭菌与分装系统</td><td>Integra</td><td>Media Clave/Media Jet</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 mm）</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Orion/Oakton</td><td>STARA1110/EW-35634-35</td><td></td></tr><tr><td>pH探针</td><td>Orion</td><td>8157BNUMD</td><td></td></tr><tr><td>pH 标准</td><td>奥克顿</td><td>00654-(00/04/08)</td><td></td></tr><tr><td>Phi 6 和丁香假单胞菌</td><td>巴特尔纪念研究所，俄亥俄州哥伦布市</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>移液器 &amp;和技巧</td><td>瑞宁</td><td>（移液器）17014391、17002921；（移液器吸头）30389239、17014382</td><td></td></tr><tr><td>冰箱</td><td>True Manufacturing Co., Inc.</td><td>GDM-33</td><td></td></tr><tr><td>手术服</td><td>Gogreen cool</td><td>PN: WS19100PT</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57656</td><td></td></tr><tr><td>搅拌棒</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-512</td><td></td></tr><tr><td>卷尺</td><td>Lufkin</td><td>PS3425</td><td></td></tr><tr><td>软琼脂试验用试管（14 mL）</td><td>康宁，纽约州，美国</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>温度计</td><td>Fisherbrand</td><td>14-983-19B</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9410</td><td></td></tr><tr><td>气态过氧化氢灭菌袋</td><td>STERIS</td><td>62020TW</td><td></td></tr><tr><td>涡旋（在铺板过程中）</td><td>Daigger Scientific, Inc</td><td>3030A</td><td>Vortex Genie 2</td></tr><tr><td>涡旋振荡器（用于样品提取）</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>58816-115</td><td>多管涡旋振荡器</td></tr><tr><td>洗涤器</td><td>Kuppet</td><td>KP1040600A</td><td></td></tr><tr><td>清洗机灭菌</td><td>Steris</td><td>STERIS VHP ED1000 发生器</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

确定热水洗涤对病毒消毒效果的有效性

Determining Viral Disinfection Efficacy of Hot Water Laundering

本方案提供了一个实验室操作流程的示例，用于开展可生成病毒消毒数据的洗涤研究。尽管该方案是在2019冠状病毒病（COVID-19）大流行期间为科研工作而制定，但其设计为通用框架，可适用于其他病毒的消毒研究；方案展示了制备测试病毒、接种测试材料、评估洗涤过程对物品外观及完整性造成的影响，以及量化病毒载量减少程度的具体步骤。此外，本方案还列出了必要的质量控制样本，以确保实验不受污染因素干扰，并明确了应在多次洗涤循环后记录的测量值和观察结果，用于追踪个人防护装备（PPE）物品的材料完整性。本方案所展示的代表性结果采用Phi6噬菌体接种于棉质刷布、牛仔布和棉质面部覆盖材料，结果表明，热水洗涤和干燥过程使所有样本的病毒载量均降低了3个对数级以上（即99.9%以上）（3个对数级的减少是美国环境保护署产品性能测试指南810.2200中规定的消毒剂效能评价指标）。病毒载量的降低在PPE物品的不同位置上表现一致。该病毒消毒效果测试方案的结果将有助于科学界进一步探索家庭洗涤对其他类型测试病毒及不同洗涤程序的有效性。

完成本方案后，将生成多种不同类型的质控数据和结果。通过噬斑形成单位（PFU）平板计数以及提取的样品体积，可计算出每张测试样片上的PFU数量。表2为系列稀释/涂布结果的数据记录表示例。利用表1中的稀释倍数、样品体积和平板计数，表3展示了口罩类产品测试中具有代表性的病毒回收结果。请注意，这些数据包括测试样片以及接种液、样片和洗涤水（含或不含洗涤剂）的质控样品。程序空白样和无菌质控样对于确认水溶液和PPE材料未被Phi6污染至关重要。若出现污染迹象，将导致消毒效果的计算结果出现偏差，并需重复实验。阳性对照样品用于验证病毒储备液在实验过程中未发生环境或自然降解，从而避免高估洗涤过程对病毒载量的降低作用。为使测试样片的结果有效，这些阳性对照样品的PFU值应与接种液对照组相差不超过1个对数级。若阳性对照样品的PFU值出现大幅下降，还表明应仔细复查样片接种的全部步骤，以确保实验人员正确执行移液和涂布操作。
该方案还提供了有关评估洗涤对服装材料性能影响的信息，以及与该方案相关的质量控制信息。表 4 和 图3）。这些数据具有多方面的用途。记录个人防护装备（PPE）各项测量指标的变化趋势，有助于识别存在制造缺陷的物品，从而帮助解释微生物数据中的异常值，并为产品性能差异提供背景信息。记录气味或损坏情况，也可提示洗衣机或干燥机在实验过程中是否运行不佳，进而判断是否需要重复测试或对设备进行维护。此外，若试验方案要求对同一件PPE进行多次洗涤循环，这些数据有助于确定PPE在洗涤过程中保持使用完整性的持续时间。记录洗涤剂溶液的pH值，可及时发现水源或洗涤剂产品是否发生变化。保留洗涤步骤的时间日志，可确保洗衣机和干燥机的定时器不会导致实验方案出现偏差。
最终，这些数据用于报告热水洗涤程序对病毒病原体替代物的消毒效果。洗涤消毒效果（公式 1）通过从个人防护装备（PPE）阳性对照组的平均 log10 病毒回收量中减去PPE测试样片的平均 log10 病毒回收量来计算（图4）。对于未检出的测试样片结果，在消毒效果计算中使用检测限的 log10 值。通常以对数值报告消毒效果，以便与其他病毒消毒技术及标准进行比较。
消毒效果 = 阳性对照的平均 log10 值 - 测试样本的平均 log10 值（公式 1）
<img alt="不同面部覆盖物、牛仔布和刷手服清洗前后尺寸变化图；重复实验比较。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3。个人防护装备（PPE）不同部位尺寸的变化。 Δ = 测试前测量值 - 测试后测量值。负的Δ值表示在指定位置物品发生拉伸，正值表示收缩。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="消毒效果图表；病毒载量对数 PFU；口罩、牛仔布、刷手服；Phi6 病毒。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64164/64164fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4．热水洗涤对去除口罩、牛仔布和刷手服个人防护材料上 Phi6 病毒的消毒效果。 星号表示完全消毒（测试样本上未检测到病毒）。误差线表示标准差（n = 3）。位置字母对应于图 2中所示的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/64164fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1. 溶液配方。 制备胰蛋白胨大豆琼脂、胰蛋白胨大豆肉汤和牛肉浸膏溶液所需的成分及用量。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table1_Solutions.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2. 连续稀释/涂布结果表的示例部分。 用于报告原始微生物数据的模板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table2_PlatingResultsSheet_RE.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3. 面部覆盖物的微生物检测结果。 处理后的噬菌斑形成单位（PFU）数据示例汇总表。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table%203%20Viral%20Recovery%20Results_Re.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表4. 防护服质量控制与材料评估记录表。 用于报告pH探针校准、洗涤剂溶液pH值、洗涤前后测量结果以及洗涤循环时间的模板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64164/Table%204_scrubs%20log.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）大流行，制定了一项实验室方案，用于检测热水洗涤对织物口罩、棉质刷手服和牛仔裤的病毒灭活效果。实验中采用Phi6病毒（噬菌体）作为检测消毒效果的测试生物体。

本方案提供了一个用于开展洗涤研究的实验室流程示例，以获得有关病毒消毒效果的数据。虽然该方案……

本方案用于测试热水洗涤的消毒效果。该方法有助于评估洗衣机和干衣机是否适用于清洗被病毒污染的衣物。这种洗涤技术的主要优势在于，其操作流程经过质量保证程序，可在其他实验室以较小规模进行重复验证。演示该实验步骤的是本实验室的微生物学家Ahmed Abdel-Hady，以及研究人员Mariela Monge和Jonathan Sawyer等人。首先，按照文中所述，称量并混合改良胰蛋白胨大豆琼脂的各组分于去离子水中。然后，向软琼脂中加入1 mL未稀释的浓缩Phi6等分试样以及100 µL对数生长期的丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）培养物。接下来，将软琼脂倾注到直径为100毫米的已凝固改良胰蛋白胨大豆琼脂平板表面。通过轻轻旋转平板，使软琼脂在固体琼脂表面均匀分布，避免产生气泡或溢出。在室温下过夜培养后，用无菌细胞涂布器轻轻刮取三个平板中的内容物，收集至含有15毫升SM缓冲液的无菌50毫升离心管中。将试管在最大转速下涡旋震荡一到两分钟以破碎琼脂，然后在7,000 × g条件下离心15分钟。收集上清液，并通过0.2微米注射器滤器过滤。将过滤后的上清液分装为每份1毫升，置于冻存管中，在-80摄氏度保存，以备后续使用。通过测量并记录未清洗的个人防护装备（PPE）物品在不同位置的长度和宽度，进行使用前的视觉评估。接种时，通过将1克牛肉浸膏溶解于10毫升1×PBS的总体积中，制备10%的牛肉浸膏溶液。使用0.2微米注射器滤器对溶液的全部体积进行过滤除菌。随后在生物安全柜内，用移液器将10微升该溶液以多个液滴形式加样至PPE样品上，并用移液器吸头将液滴涂布均匀，使每个样品接种量约为每样本10的7次方个噬斑形成单位，完成测试组和阳性对照组样本的接种。使用加热板和搅拌子将洗涤液加热至 50 摄氏度。然后测量并记录洗涤液的 pH 值和温度，并收集 10 毫升溶液用于无菌检查。接着，将 3.25 升洗涤液倒入已灭菌的洗衣机中。将个人防护装备（PPE）物品、一个接种了微生物的面部覆盖物以及四个不含试片的未污染薄膜口罩放入洗衣机中。对PPE物品洗涤18分钟后，排空洗衣机，并每次用5升室温自来水进行三次漂洗，以去除泡沫。向洗衣机中加入3.25升室温灭菌自来水，执行一次持续9分钟的漂洗程序。接下来，将个人防护装备（PPE）物品移入洗衣机的甩干侧，甩干五分钟。在干燥机中，以93摄氏度的高温设置对PPE物品进行80分钟的干燥。然后将PPE物品从干燥机转移至无菌工作区。无菌操作下将接种物品中的试片取出，并置于锥形管中。随后，加入10毫升10% Dey-Engley中和肉汤，使用旋涡振荡器在设备最大转速下振荡两分钟，以提取试片上的微生物。采用传统的软顶层琼脂覆盖法进行提取物涂布时，将测试样品的等分试样加入含有6毫升软琼脂和100微升对数生长期P. syringae的软琼脂管中。接下来，将软琼脂倾注到已凝固的改良胰蛋白胨大豆琼脂平板表面，并通过轻轻旋转平板使软琼脂在固体琼脂表面均匀分布。在室温下过夜培养后，人工计数每个平板上的空斑形成单位。针对完整尺寸的个人防护装备（PPE）或衣物进行病毒消毒洗涤效果的系统性实验室检测表明，通过空斑形成单位（PFU）平板计数及提取样品体积，可计算出每块测试样片上的空斑形成单位数量。本实验获得了面罩测试中病毒回收的代表性结果。洗涤测试提供了有关服装材料特性的信息，例如拉伸或收缩情况，以及该方案的质量控制数据。本图展示了热水洗涤对消除面罩、牛仔布和刷状个人防护装备材料上的Phi6病毒的有效性，其中星号表示完全消毒。在整个操作过程中，必须使用无菌技术，以防止交叉污染。此外，不同材质的样本片接种物干燥时间各不相同，应在测试前确定。其他辅助方法包括显微镜检查和液体渗透试验，用于评估材料降解情况或进一步的尺寸分析，以确保屏障防护性能仍适合佩戴者。该技术为大规模服装和个体防护装备的清洗效果及材料测试提供了基础。在下一次传染病暴发或大流行期间，该技术也可用于建立有效的清洗程序。

determining-viral-disinfection-efficacy-of-hot-water-laundering

Research

科研

JoVE Journal

Engineering

工程

确定热水洗涤的病毒消毒效果

来源：Fout, G. S, Cashdollar, J. L. 美国环保局方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。II. 全可培养病毒检测法。可视实验杂志...

利用体外全可培养病毒检测法定量水样中的感染性病毒

本视频展示了病毒灭活实验，演示了抗病毒药物对病毒颗粒作用效果的评估过程。...

通过病毒灭活实验评估抗病毒测试化合物的有效性

本文描述了一种可视化的方法，用于从噬菌体展示的组合合成抗体文库中，同时针对数百种抗原进行可扩展的高通量筛选。通过这种并行方法，我们分离出的抗体片段对多种抗原具有高亲和力和特异性，并可在标准免疫测定中发挥功能。...

可扩展的高通量噬菌体展示合成抗体文库筛选

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VirWaTest：一种用于水样中病毒检测的即用型方法

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评估结合静态与动态方法的有机过氧酸在清除乳制品生物膜中的功效

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利用新型气溶胶化过氧化氢微滴扩散技术的医院病房自动化消毒

本方案提供了一个系统性框架，通过杀菌活性建模和组合相互作用测定，评估植物化学物质如何增强传统杀菌剂的杀菌效果，旨在鉴定可提高微生物控制效果并减少杀菌剂总体使用量的协同作用混合物。...

体外评估植物源性分子对传统生物杀灭剂的增效作用

了解热水洗涤对口罩、牛仔布和棉质手术服的病毒消毒效果。本研究使用Phi6噬菌体作为模型生物，建立了可重复的标准化消毒方案，为公共卫生紧急情况下的个人防护装备清洁提供科学依据。

确定热水洗涤对病毒消毒效果的有效性

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