Name: 从成年非洲绿松石鳉鱼的脑组织中温和分离细胞核，这是一种自然短暂的衰老研究模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学习从非洲绿松石鳉鱼脑组织中温和分离高质量细胞核的方法，用于单核RNA测序和ATAC-seq分析。该技术有助于在单细胞水平研究脑衰老机制，为衰老研究提供重要的实验基础。

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部分图示使用 BioRender.com 生成。本实验室的研究工作获得了以下资助：B.T. 获得美国国家衰老研究所 T32 AG052374 博士后培训项目资助，西蒙斯基金会“衰老大脑可塑性合作项目”资助，Navigage 基金会试点项目资助，以及 Hanson-Thorell 家庭奖对 B.A.B. 的支持。

动物护理和动物实验均依照南加州大学动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案 #21215 进行。对于使用本方案的任何工作，在开展涉及脊椎动物的研究工作之前，必须获得所在机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：从闪冻脑组织开始（从步骤3开始）完成整个实验流程，六个样本大约需要2.5小时（图1）。
1. 解剖鳉鱼大脑
<ol>
	<li>使用系统水中含1.5 g/L甲磺酸三卡因（MS-222）的溶液人道处死鳉鱼。
	<ol>
		<li>待所有身体和鳃部运动停止后，使用锋利的剪刀迅速将鳉鱼断头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在洁净的培养皿中解剖已断头的头部，操作步骤如前所述19。
	<ol>
		<li>将培养皿置于解剖显微镜下（使用8x–35x放大倍数），调整头部位置，使鳃盖软骨射线清晰对焦。</li>
		<li>使用剪刀剪开齿骨，暴露鳃盖软骨射线和颅骨。</li>
		<li>用镊子固定颅骨两侧的鳃盖软骨射线，再用另一把镊子清除颅骨上残留的组织碎片。连接脑与眼睛的V形视交叉应变得可见。</li>
		<li>用剪刀切断视交叉，使双眼与脑分离。用镊子轻轻松解颅骨。</li>
		<li>将颅骨翻转，用镊子刮除颅骨背侧的肌肉。</li>
		<li>用一把镊子固定颅骨，另一把镊子轻轻去除颅骨骨片，暴露脑组织。</li>
		<li>脑组织呈白色且质地柔软。一旦暴露，无需完全去除所有颅骨骨片。使用洁净的镊子轻轻提起并刮取，将脑组织取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脑组织放入置于干冰上的微量离心管中进行速冻。 
	&#8203;注意：冷冻的脑组织可在-80 °C下保存，直至收集完所有需一同处理的样本，以减少文库构建过程中的批次效应。尽管在-80 °C下保存的样本不能无限期储存，但本方案已成功应用于保存长达12个月的鳉鱼脑组织，质量未见明显下降。</li>
</ol>
2. 准备新鲜的缓冲液
<ol>
	<li>配制细胞核洗涤缓冲液（含2%牛血清白蛋白[BSA]的1×PBS磷酸盐缓冲液，pH 7.4，以及0.2 U/µL RNase抑制剂），并置于冰上保存。每处理最多八个样本，需准备250 mL细胞核洗涤缓冲液。配制250 mL缓冲液时，加入50 mL 10% BSA储存液、25 mL 10×PBS储存液、1.25 mL 40 U/µL RNase抑制剂储存液，最后用无RNase的ddH2O定容至250 mL。</li>
	<li>配制细胞核裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MgCl2，0.01875% v/v NP-40，以及0.2 U/µL RNase抑制剂），并置于冰上保存。每处理最多八个样本，需准备10 mL细胞核裂解缓冲液。配制10 mL缓冲液时，加入100 µL 1 M Tris-HCl pH 7.4储存液、20 µL 5 M NaCl储存液、30 µL 1 M MgCl2储存液、18.75 µL 10% NP-40储存液、50 µL 40 U/µL RNase抑制剂储存液，最后用无RNase的ddH2O定容至10 mL。</li>
</ol>
3. 分离细胞核
<ol>
	<li>若使用冷冻样品，需将其置于冰上解冻10分钟。若使用新鲜解剖的脑组织，则直接进入步骤3.2。 
	注意：尽管本方案适用于单个脑组织，但来自幼鱼（5–6周龄）的小样本获得的产量较低。无论鱼类年龄和性别如何，通过将两个脑组织作为一个样本进行处理，总能获得足够的产量（表1）。本方案已成功从5至26周龄的鱼类中分离出高质量细胞核，包括GRZ和ZMZ1001品系的个体。将本方案应用于其他品系时预计不会出现问题。</li>
	<li>在2 mL Dounce匀浆器中，用1 mL预冷的细胞核裂解缓冲液对脑组织进行匀浆。保持匀浆器置于冰上，并在裂解过程中避免产生气泡。以大约每下冲0.5秒、每上提0.5秒的速度进行Dounce匀浆，每个循环施加180°扭转。先使用松配合研杵匀浆15次，或根据需要增加次数，直至组织与裂解缓冲液混合物呈现均一状态。 
	注意：Dounce匀浆器应在每次使用后清洗，并用蒸馏水冲洗，再通过标准干式高压灭菌循环进行灭菌。
	<ol>
		<li>使用紧配合研杵匀浆30次，每10次之间短暂休息30秒至1分钟。以大约每下冲0.5秒、每上提0.5秒的速度进行，每个循环施加180°扭转。匀浆完成后，将样品在Dounce匀浆器中置于冰上静置2分钟。 
		注意：此孵育时间可确保充分裂解，但如果观察到细胞核过度裂解，应缩短孵育时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品通过70 µm细胞滤网过滤至已预先用5% BSA包被的15 mL锥形管中。</li>
	<li>用移液器将步骤3.3中的70 µm细胞滤网上的4 mL细胞核洗涤缓冲液加入样品中，并轻轻颠倒混匀5次。 
	注意：此步骤有助于回收可能滞留在滤网上的细胞核，从而提高产量。</li>
	<li>使用摆动桶转子在500 ×g、4 °C条件下离心10分钟。小心倾倒上清液至液体废液容器中。将样品管恢复直立位置，并用P1000移液器吸除残留的洗涤缓冲液。 
	注意：当以两个脑组织作为一个样本起始时，通常可见细胞核沉淀。然而，在处理来自幼龄动物（5–6周龄）的单个脑组织时，预期产量较低，沉淀可能不可见。在此情况下，应小心移除上清液，同时假定沉淀位于管底。</li>
	<li>立即使用宽口P1000移液器吸头将细胞核重悬于1 mL细胞核洗涤缓冲液中。</li>
	<li>加入4 mL细胞核洗涤缓冲液，使总体积达到5 mL，并轻轻颠倒混匀5次。使用摆动桶转子在500 ×g、4 °C条件下离心10分钟，弃去上清液。</li>
	<li>使用宽口移液器吸头将细胞核重悬于1 mL细胞核洗涤缓冲液中，并转移至流式细胞术（FACS）管中。</li>
	<li>加入300 µL去碎片溶液（材料表），用宽口吸头反复吹打，充分混匀，直至混合物均匀。</li>
	<li>使用P1000移液器，在步骤3.9制备的细胞核溶液上方轻轻叠加1 mL细胞核洗涤缓冲液，操作时将试管倾斜一定角度（补充图2）。若分层正确，去碎片溶液层与细胞核洗涤缓冲液层之间应形成清晰界面。</li>
	<li>在摆动桶转子中以3000 ×g、4 °C离心10分钟。使用P1000移液器完全弃除上层两相。 
	注意：透明的FACS管可在离心后清晰显示三个不同相（上相、中间相、下相）。为实现最大程度的碎片去除，建议在去除上层两相时采取较为彻底而非保守的策略（即少量损失下相优于任何上相的残留；补充图2）。此外，中间相可能过薄而无法观察。在此情况下，应去除上层（表观）液体，其中包含中间相。保留的下层总体积应约为1 mL。</li>
	<li>将下层液体转移至已预先用5% BSA包被的15 mL锥形管中。</li>
	<li>在锥形管中加入细胞核洗涤缓冲液至总体积达15 mL，并轻轻颠倒混匀3次。</li>
	<li>使用摆动桶转子在1000 ×g、4 °C条件下离心10分钟。小心移除上清液。</li>
	<li>立即使用宽口移液器吸头将沉淀重悬于150 µL细胞核洗涤缓冲液中。</li>
	<li>更换为标准口径移液器吸头，设定体积约为300 µL。吸取全部样品后，将40 µm的吸头滤器连接至移液器吸头末端，注意不要排出样品。 
	注意：吸头滤器对于获得较小体积至关重要，这是为了在后续应用中维持足够的细胞核浓度。例如，在使用微流控技术进行单核RNA测序（snRNA-seq）时，建议最低浓度为&#62;300个细胞核/µL，而最佳范围为700–1200个细胞核/µL18。如需，高浓度细胞核也可轻松稀释。</li>
	<li>用力将样品通过滤器推出，过滤至低DNA结合力的1.5 mL微量离心管中。最终洗脱体积应为120–150 µL。 
	&#8203;注意：过滤过程中可能出现少量泡沫，但这似乎不影响细胞核质量。</li>
</ol>
4. 通过显微镜评估细胞核质量
<ol>
	<li>在另一个微量离心管中，通过轻柔移液将 10 µL 过滤后的样品与 10 µL 0.4% 台盼蓝溶液混合。样品无需长时间孵育，与台盼蓝溶液混合后可立即用于观察。</li>
	<li>将 10 µL 染色后的细胞核加入计数板载玻片的一个计数室中。 
	注意：也可将 10 µL 染色后的细胞核样品滴加到血细胞计数板或显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。</li>
	<li>通过光学显微镜评估细胞核的质量。 
	注意：应仅使用较低倍镜定位细胞核，因为细胞核的缺陷仅在较高倍数（即 60x 或更高）下才可被清晰观察到。此步骤可快速完成，用于评估细胞核制备是否成功，无需进行除目视检查以外的二次分析。高质量且完整的细胞核应具有清晰分明的边界20（图 2A）。质量较差的细胞核则表现为核膜破裂、核膜附近出现斑块状台盼蓝染色（提示可能存在核酸泄漏）和/或出泡现象20（图 2B）。健康的细胞核直径通常为 10–15 µm。</li>
</ol>
5. 通过流式细胞术定量单核细胞核、碎片和多重体比例
注意：流式细胞仪软件的具体术语和界面可能因仪器品牌而异，但如有需要，这些步骤可轻松适配到其他系统。
<ol>
	<li>在FACS管中，将10 µL过滤后的细胞核样品重悬于90 µL推荐用于流式细胞术的缓冲液中，以实现1:10稀释。本研究中使用的缓冲液为含2 mM EDTA和0.5% BSA、经0.22 µm滤膜过滤灭菌的PBS（pH 7.2）。 
	注意：尽管此稀释比例适用于大多数细胞核制备样本，但对于得率较低的样本（即细胞核数量较少的情况），可能需要更低的稀释比例（例如 1:5），以确保获得足够数量的细胞核用于质量评估 &#60;稀释样品中每微升含30个细胞核（30 nuclei/µL）。</li>
	<li>用碘化丙啶（PI）对样品进行染色，终浓度为1 µg/mL。无需孵育，可立即分析细胞核。 
	注意：也可使用终浓度为 0.1 µg/mL 的 DAPI 对样品进行染色。需注意，DAPI 的检测应使用与 PI 不同的荧光通道（Vioblue-A V1-A 通道；激发波长 405 nm，发射波长 450/50 nm）。</li>
	<li>在流式细胞仪上按如下步骤分析样品：
	<ol>
		<li>设置工作区：
		<ol>
			<li>将流式细胞仪设置为采集模式。点击 文件，然后选择 新工作区 从下拉菜单中。在 实验 左侧面板中的标签，输入 项目名称 和 样本编号 进入各自的研究领域。</li>
			<li>在左上角工具栏中，单击 新建分析窗口 按钮（散点图图标）。点击包含三个图表的方框（绘制 4t）从弹出菜单中。屏幕上将出现三个图表。单击 分析模式 左上角工具栏中的按钮（A 图标）使其呈现灰色而非橙色。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置分析图：
		<ol>
			<li>将三个图的坐标轴按以下顺序分别更改为：X轴和Y轴。 
			图1： X轴FSC-A， Y轴SSC-A 
			图 2： X轴HDR-T Y轴SSC-A 
			图3： X轴PerCP-Vio700-A B3-A Y轴SSC-A</li>
			<li>通过点击更改坐标轴 坐标轴标签 从下拉菜单中选择所需通道。</li>
			<li>将图设置为按密度进行颜色编码，方法是单击方形灰色区域 &#34;i&#34; 位于每个图表右上角旁边的图标。A 特性 窗口左侧显示一排按钮面板。在 特性 窗口，单击 散点图 图标（面板左侧从上往下第二个）。点击 好的. 
			注意：PerCP-Vio700-A B3-A 荧光通道对应 488 nm 激发，发射波长范围为 650–730 nm。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置仪器参数：
		<ol>
			<li>点击 通道 左侧面板中点击标签，所有通道的列表将显示在右侧三个框中。将 B3、FSC-A 和 SSC-A 设置为 Hlog 通过点击右侧各自第一个框上的下拉箭头并选择 Hlog 从下拉菜单中选择。在右侧对应的中间输入框中分别输入 640 V、300 V 和 480 V，将 SSC 电压设为 640 V，FSC 电压设为 300 V，B3 电压设为 480 V，然后按下 进入 关键。注意右侧第三个方框为切换键，可交替用于输入。</li>
			<li>在……之下 触发 头部，通过点击向下箭头，从左侧下拉菜单中选择 FSC 触发设为 4，SSC 和 B3 触发设为 0，在右侧框中输入数值，然后按压 输入 关键。请注意，右侧有一个切换框，可用来替代输入。 
			注意：每个流式细胞仪的光电倍增管（PMT）电压需针对具体仪器进行优化，但细胞核的触发阈值必须低于通常用于细胞的设置。此外，坐标轴应设置为h-log尺度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在文本框中输入 100 µL 样品体积 以及文本框中的 50 µL 摄取体积 在流式软件窗口的左侧。确认 混合样品 参数设置为 轻柔混匀 以避免在此步骤中裂解细胞核。按下圆圈内的三角形（播放 右下角的图标以启动流式操作。</li>
		<li>验证流体质量：
		<ol>
			<li>使用侧向散射面积（SSC-A）对 HDR-T 作图，以检查样本中是否存在气泡或细胞团块。确保该图呈现为连续平滑的点分布。气泡或细胞团块会导致 SSC-A 对 HDR-T 图中出现空白区域。</li>
			<li>检查侧向散射（SSC-A）与前向散射（FSC-A）图，以确认所用的电压设置是否适合该样品。 
			注意：与细胞不同，细胞核在侧向散射与前向散射图中无法完全与碎片分离。然而，图中应出现一个位于中央区域的高密度事件簇，对应于细胞核（颜色较暖），背景中则分布着较低密度的事件（颜色较冷），对应于碎片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>分析细胞核数量和质量：
		<ol>
			<li>双击 SSC-A 与 PerCp-Vio-700A 图 以查看放大图像。点击左上角工具栏中带有垂直线条的按钮（象限) 以选择一个象限门。然后，单击任意位置以 SSC-A 与 PerCp-Vio-700A 散点图 图中将显示象限。</li>
			<li>单击象限分隔线上的任意位置并滑动光标以调整象限位置。调整象限，使左上象限包含最左侧的群体（碎片），右上象限包含多个泪滴状簇（细胞核）（参见 图3 用于门控设置及典型样本（包括或不包括碎片去除步骤）流式结果的示例。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>碎片与细胞核计数：
		<ol>
			<li>点击方形灰色区域 &#34;i&#34; 图表右上角的图标以打开 特性 窗口。单击 区域功能 标签；绘图区域和函数的列表将出现。</li>
			<li>在……之下 区域 列表中，确保顶部项目旁显示绿色对勾标记，表示已选中整个图表。在下方 功能 列表，点击 计数/µL 生成绿色对勾标记。单击 好的，每个象限将显示每微升的细胞计数（counts/µL）。</li>
			<li>要查看原始计数和百分比，请选择 计数 和 %-T 来自 区域功能 如需要，可按 Tab 键。左上和右上象限的计数/µL 分别对应碎片和细胞核的产量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>单重态计数：
		<ol>
			<li>右上象限下部最左侧的泪滴形细胞群代表单细胞群体。通过点击多边形工具按钮，在此细胞群周围绘制一个多边形门多边形位于左上角工具栏。</li>
			<li>单击一次，滑动鼠标以开始绘制门控区域的线性片段，再次单击以完成该线段并开始下一段。双击以完成整个门控区域的绘制。单击门控区域的边界并滑动鼠标，可重新定位门控区域。</li>
			<li>点击门控区域的顶点以调整其形状。门控群体（单细胞）的计数/µL将显示出来。此数值为经过初始稀释后细胞核悬液的浓度。 
			注意：前向散射面积与高度之间的1:1线性关系常用于流式细胞时确定单细胞率，但该关系不适用于细胞核，可忽略。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据稀释后细胞核悬液的浓度和稀释倍数，反推初始悬液的浓度（例如，对于1:10的稀释，将测得的浓度乘以10）。来自 &#62;300 个核/µL 适用于 snRNA-seq。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yankner, B. A., Lu, T., Loerch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">The aging brain.</a> Annual Review of Pathology. 3 (1), 41-66 (2008).</li>
<li>Hu, C. K., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+African+turquoise+killifish%3A+A+research+organism+to+study+vertebrate+aging+and+diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The African turquoise killifish: A research organism to study vertebrate aging and diapause.</a> Aging Cell. 17 (3), 12757(2018).</li>
<li>McKay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+feeding+system+for+the+African+killifish+reveals+effects+of+dietary+restriction+on+lifespan+and+allows+scalable+assessment+of+associative+learning%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An automated feeding system for the African killifish reveals effects of dietary restriction on lifespan and allows scalable assessment of associative learning.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Valenzano, D. R., Terzibasi, E., Cattaneo, A., Domenici, L., Cellerino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+affects+longevity+and+age-related+locomotor+and+cognitive+decay+in+the+short-lived+fish+Nothobranchius+furzeri%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Temperature affects longevity and age-related locomotor and cognitive decay in the short-lived fish Nothobranchius furzeri.</a> Aging Cell. 5 (3), 275-278 (2006).</li>
<li>Vanhunsel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+killifish+visual+system+as+an+in+vivo+model+to+study+brain+aging+and+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Aging+and+Mechanisms+of+Disease%22%5BJournal%5D)">The killifish visual system as an in vivo model to study brain aging and rejuvenation.</a> NPJ Aging and Mechanisms of Disease. 7 (1), 22(2021).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), 0209648(2018).</li>
<li>Ziffra, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+epigenomics+reveals+mechanisms+of+human+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell epigenomics reveals mechanisms of human cortical development.</a> Nature. 598 (7879), 205-213 (2021).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Kalish, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA+sequencing+of+mouse+auditory+cortex+reveals+critical+period+triggers+and+brakes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA sequencing of mouse auditory cortex reveals critical period triggers and brakes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (21), 11744-11752 (2020).</li>
<li>Slyper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+and+single-nucleus+RNA-Seq+toolbox+for+fresh+and+frozen+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors.</a> Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).</li>
<li>Ayhan, F., Douglas, C., Lega, B. C., Konopka, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+surgically+resected+human+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from surgically resected human hippocampus.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100844(2021).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
<li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+isolation+from+fresh+frozen+brain+tumors+for+single-nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Nuclei isolation from fresh frozen brain tumors for single-nucleus RNA-seq and ATAC-seq.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61542(2020).</li>
<li>Saunders, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+diversity+and+specializations+among+the+cells+of+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular diversity and specializations among the cells of the adult mouse brain.</a> Cell. 174 (4), 1015-1030 (2018).</li>
<li>Genomics, X. Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing & Tissues for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k">https://support.10xgenomics.com/permalink/1dlB6Z91VqClgUmSC2OM8k</a> (2021).</li>
<li>Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+nuclei+extraction+%28for+10xV3+snSEQ%29+V.2%5BTitle%5D)+AND+%22protocols.io%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue nuclei extraction (for 10xV3 snSEQ) V.2.</a> protocols.io. , (2020).</li>
<li>Nuclei Isolation from Adult Mouse Brain Tissue for Single Cell RNA Sequencing. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-adult-mouse-brain-tissue-for-single-cell-ma-sequencing</a> (2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>What are the best practices for working with nuclei samples for 3' single-cell gene expression. 10xGenomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-">https://kb.10xgenomics.com/hc/en-us/articles/360050780051-What-are-the-best-practices-for-working-with-nuclei-samples-for-3-single-cell-gene-expression-</a> (2022).</li>
<li>Rocks, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+chromatin+accessibility+analysis+in+the+mouse+and+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific chromatin accessibility analysis in the mouse and human brain.</a> Epigenetics. 17 (2), 202-219 (2022).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可用于从鳉鱼大脑中稳定地制备高质量细胞核。由于常规基于哺乳动物的脑细胞核分离方案在应用于鳉鱼大脑时，在我们实验中始终导致细胞核质量较差，因此本方案专门针对鳉鱼大脑进行了设计。我们推测，这可能是由于鳉鱼大脑的相对髓鞘含量低于哺乳动物，而在适用于哺乳动物脑细胞裂解的较剧烈条件下，鳉鱼脑组织容易发生裂解并形成团块。本方案推动了衰老研究和鳉鱼研究领域的发展，使得在脊椎动物脑衰老的低成本且高效的时间模型中，能够在单细胞水平上探索脑衰老过程。
该方案适用于新鲜或冷冻样品，但在使用新鲜或冷冻组织时需考虑后续应用。冷冻组织通常较为方便，因其可在收集样品期间采集并储存数月。此类样品可安全用于如单核RNA测序（snRNA-seq）等应用。然而，冷冻样品可能破坏核结构，从而影响通过ATAC-seq准确检测染色质可及性的能力21。因此，对于后续应用为批量ATAC-seq或单核ATAC-seq的情况，建议使用 freshly dissected brains 而非冷冻脑组织。此外，由于脑组织匀浆后的所有步骤均可并行操作，该方案可在合理时间内处理多个样品，从而限制因长时间冰上孵育导致的RNA降解。
此外，必须在进行细胞核提取前数小时内新鲜配制缓冲液。我们发现，缓冲液中必须添加去垢剂以及 BSA 立即 在开始本方案之前。仅含盐类的缓冲液（如 PBS、NaCl 等）可配制成浓缩液，经滤膜除菌（0.22 µm）后，于室温长期保存。BSA 储存液可在核提取前数日内配制、灭菌并保存于 4 °C（若由粉末配制），但应在开始本方案前立即加入本方案所用缓冲液中。然而，我们建议在实验当天新鲜配制 BSA 溶液。若使用第三方提供的预配 BSA 溶液，建议使用新鲜未开封的瓶装试剂。使用新鲜的 BSA 通常可减少核制备物中的碎片含量。
无论使用新鲜样本还是冷冻样本作为起始材料，在完成细胞核分离后，评估细胞核的质量都至关重要。尽管本方案专门设计用于避免过度裂解，但过度裂解仍是导致细胞核质量下降的最常见原因。过度裂解可能由以下因素引起：在裂解缓冲液中孵育时间过长、对细胞核操作过于剧烈（例如使用标准孔径移液器吸头进行过度吹打），或细胞核分离与下游应用之间的间隔时间过长（&gt;1 小时）。过度裂解的细胞核通常会出现核周结构损伤，导致DNA泄漏并引发聚集（图2B）。这将增加多重体（multiplets）的数量，并引入背景核酸，干扰下游应用，尤其是单核RNA测序（snRNA-seq）。这两种质量问题均可在细胞核分离后通过显微镜观察进行评估。若观察到明显的细胞核聚集现象，我们建议尝试缩短裂解步骤的孵育时间，以降低过度裂解的风险。作为提高单细胞核比例的替代方法，可采用荧光激活细胞分选（FACS）在本方案的后续步骤中富集单细胞核。然而需要注意的是，当处理来自冷冻组织的本已脆弱的细胞核时，分选过程中产生的剪切应力可能导致细胞核破裂增加，从而导致环境RNA/DNA水平升高。此外，当同时处理多个样本时，完成一次FACS产量分选所需的时间将导致所有细胞核样本在冰上放置数小时，而其他样本仍在等待分选。因此，采用FACS方法并行处理多个样本时，延长的等待时间也可能导致细胞核整体质量下降，并增加RNA降解的风险。因此，若希望使用FACS降低双细胞核（doublet）比例，我们建议在完成产量分选后再次检查碎片含量，并在进行单细胞RNA测序应用时，将可能存在的RNA质量下降作为潜在的注意事项予以考虑。
准确估计细胞核数量及单核比例对于几乎所有下游“组学”应用都至关重要。由于流式细胞术能够根据细胞核大小轻松设门并进行计数，因此在我们评估的方法中，这是最准确的细胞核计数方法。此外，也可使用细胞计数仪进行细胞核定量，例如 Invitrogen 的 Countess 2 FL 全自动细胞计数仪或 DeNovix CellDrop 全自动细胞计数仪。需要注意的是，Invitrogen 的 Countess 2 FL 全自动细胞计数仪（DeNovix 的情况则轻微得多）倾向于将碎片误判为细胞核，从而高估细胞核数量，因此可能需要手动按大小设门。此外，流式细胞仪还能方便地评估细胞核纯度。通过该方法可定量分析单核与多聚核细胞核的相对比例，而这种定量能力是显微镜难以实现的。这一点对于单核 RNA 测序（snRNA-seq）和单核 ATAC-seq 尤为关键，因为这些实验方案容易产生过多的多聚体样本，而这些样本必须在下游分析中被排除。除了多聚体外，流式细胞术还可量化“碎片”（破碎的细胞核、细胞碎片）的相对比例，该比例应尽可能低，因为此类物质通常含有污染性核酸，可能产生背景信号，从而干扰单核“组学”数据的准确性。
与先前报道的细胞核分离方案类似，原始组织中的细胞类型比例可能无法在细胞核制备物中被真实还原19，因此结果应谨慎解读。需要注意的是，与其他所有硬骨鱼类一样，非洲青鳉鱼具有带细胞核的红细胞，这些红细胞的细胞核也预期会出现在细胞核制备物中。在单核RNA测序（snRNA-seq）和单核ATAC测序（snATAC-seq）数据集中，这些细胞核可通过血红蛋白基因的较高表达或染色质可及性进行识别，并可根据需要在计算分析中予以排除。

阐明脊椎动物大脑衰老的机制对于应对阿尔茨海默病和痴呆等与年龄相关的神经退行性疾病至关重要1。非洲 turquoise 鳉（Nothobranchus furzeri）是可在人工饲养条件下繁殖的寿命最短的脊椎动物，因其寿命短且伴随年龄增长出现认知功能障碍，是研究大脑衰老的优良模型2,3,4,5。近年来，单细胞&#34;组学&#34;技术（如单核RNA测序（snRNA-seq）和基于测序的转座酶可及染色质单核检测（snATAC-seq））的发展，使研究人员能够以前所未有的分辨率解析衰老大脑的分子特征6,7,8。这些方法依赖于细胞核的分离，因为大脑细胞（如神经元）的完整细胞分离通常过于困难6,7,8,9,10。然而，目前大多数已发表的细胞核分离方案均针对哺乳类模式生物进行优化11,12,13,14,15。因此，鉴于在衰老研究领域，非洲鳉鱼作为一种新兴模式生物，目前尚缺乏适用于其脑组织细胞核分离的有效方法2，本实验方案的目标是建立一种从冷冻保存的非洲鳉鱼脑组织中分离高质量细胞核的技术方法。
本文建立了一种简化且稳健的工作流程，利用常规可得的材料从鳉鱼大脑中分离高质量细胞核。该方案改编自10x Genomics公司用于小鼠大脑的方案，针对非洲 turquoise 鳉鱼大脑较低的髓鞘含量、冷冻组织的脆弱性以及降低环境碎片含量以满足测序相关应用的需求进行了优化16。事实上，先前为哺乳动物脑组织优化的方案17,18在用于冷冻的鳉鱼脑组织时，会导致细胞核质量差（即过度裂解）和/或碎片含量过高，根据基于微流控技术的单细胞核RNA测序（snRNA-seq）推荐标准，这些方案不适用于snRNA-seq（补充图1）。
除了细胞核的分离外，我们还展示了如何通过显微镜和流式细胞术评估细胞核的质量和得率。本文提供了最佳和非最佳结果的示例，并讨论了问题排查方法。该方案最初针对冷冻的鳉鱼脑组织设计并优化，但也可在无需重大修改的情况下用于新鲜解剖的鳉鱼样本。利用本方法分离的鳉鱼脑细胞核已针对单细胞核RNA测序（snRNA-seq）这一下游应用进行了优化，同时也适用于单细胞核ATAC测序（snATAC-seq）和批量ATAC测序（bulk ATAC-seq）。

<table><tbody><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 组织研磨器</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Dounce 匀浆器</td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M 氯化钠，分子生物学级</td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 冲洗液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>相当于 pH 7.2 的 1x PBS，含 2 mM EDTA（用于流式细胞术）</td></tr><tr><td>去碎片溶液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 管</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve 显微镜（配备 60x 物镜）</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>无目录号；用于核的视觉检查</td></tr><tr><td>Falcon 圆底聚苯乙烯管，5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS 管</td></tr><tr><td>FLOWMI 细胞筛网，40 &amp;mu;M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>在方案中称为加样头过滤器</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>用于将 TRIS 的 pH 从 8.0 降至 7.4</td></tr><tr><td>Leica EZ4 解剖显微镜</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>无目录号</td></tr><tr><td>MACS BSA 储存液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer（70 &amp;mu;M）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 流式细胞仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>无目录号</td></tr><tr><td>氯化镁六水合物，分子生物学级（粉末）</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 16R 离心机</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>微型盖玻片</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 显微载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 替代品</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ 目录号: 983739 P 编码: -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps 去垢剂溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶 HyPure 分子生物学级水</td><td>HyClone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase 抑制剂（50,000 U）</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶溶液</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI 核染色染料</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 移液器吸头（超低吸附，带滤芯），规格为 10 &amp;micro;L、20 &amp;micro;L、200 &amp;micro;L 和 1000 &amp;micro;L</td><td>USA Scientific</td><td>#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S（MS 222）</td><td>Syndel</td><td>Tricaine10G</td><td>Syndel 是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药用级 Tricaine 供应商</td></tr><tr><td>TRIS，1 M，pH 8.0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>宽口移液吸头</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr></tbody></table>

从自然寿命较短的成年非洲蓝鳉鱼脑组织中温和分离细胞核

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

在脊椎动物体系中以单细胞分辨率研究脑衰老仍面临成本、时间和技术上的挑战。本文展示了一种从自然寿命较短的脊椎动物——非洲青鳉鱼Nothobranchius furzeri的大脑中制备单核RNA测序（snRNA-seq）文库的实验方案。非洲青鳉鱼的寿命仅为4-6个月，且饲养成本低廉，因而可显著降低研究脊椎动物脑衰老所需的时间与经济成本。然而，为从年轻及年老个体的大脑中分离出适用于后续单细胞实验的高质量细胞核，仍需专门优化的实验流程。本文详细阐述了一种经实证优化的、用于从成年非洲青鳉鱼大脑中分离高质量细胞核的方案，这是构建高质量单核组学文库的关键步骤。此外，我们还证明，减少污染性背景RNA的步骤对于清晰区分不同细胞类型至关重要。综上所述，本方案证实了在非传统脊椎动物模型生物中开展脑衰老研究的可行性。

本文所述的鳉鱼脑核分离方案专为鳉鱼优化，总结见图1。除细胞核提取外，本方案还详细描述了多种评估分离核质量和数量的方法。图2展示了通过光学显微镜评估的健康（图2A）与非健康（图2B）细胞核的示例。适用于后续分析的健康细胞核（图2A）表现为膜结构完整的单个细胞核。如图2B所示，本方案（及其他细胞核分离方案）最常见的失败模式是产生过度裂解的细胞核，其特征为核膜受损。这常导致细胞核聚集，并因破裂细胞核中核酸泄漏而在后续应用中产生背景信号。若观察到明显的聚集现象，建议在Dounce匀浆步骤中操作更轻柔和/或缩短裂解缓冲液中的孵育时间。
本实验方案采用流式细胞术定量测定分离得到的细胞核数量，并确定样本中多重细胞核的相对比例。此外，流式细胞术还可用于评估样本中污染性碎片的相对含量，这些碎片通常为破裂的细胞核片段及其他细胞碎片，可能对细胞核样本的下游检测产生不利影响。典型的流式数据见图3。高质量的细胞核分离应达到以下标准：1）碎片组分较少；2）单细胞核在细胞核组分中占比较高（> 80%）。利用碘化丙啶（PI）染色（可染色核酸）可将单细胞核与碎片及多重细胞核区分开来。图3A为受碎片污染的样本示例，而图3B则为高质量实验的示例。
<img alt="鳉鱼脑组织解剖与细胞核分离示意图；流式细胞术及显微镜分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：鳉鱼脑细胞核分离操作流程。 从冷冻或新鲜的鳉鱼脑组织中分离细胞核的实验流程。细胞核经分离并评估后，可用于多种下游“组学”分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像中显示的细胞分裂过程，细胞形态以10 µM为尺度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：通过显微镜评估细胞核质量。 将细胞核与0.4%台盼蓝溶液按1:1混合，在Echo Revolve显微镜下以60倍明场成像进行观察。（A）高质量细胞核的示例。细胞核以单个形式存在，核膜完整。（B）低质量细胞核的示例。核膜受损，细胞核聚集成双核体，可能是由于黏性DNA泄漏所致，图中可见最上方细胞核顶部有DNA外泄。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术图显示有无去除碎片时的细胞核与碎片检测情况" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3通过流式细胞术进行细胞核定量和纯度评估 细胞核样品用1:100稀释的PI染色后上流式细胞仪检测。细胞核以单体和多聚体形式存在于右上象限A，B）单细胞为事件数最少的群体，随后依次为双联体、三联体等，按升序排列。碎片由最左侧两个象限中的事件标记。A) 一个低质量细胞核制备的示例，其中省略了碎片去除步骤，导致碎片占主导 &gt;40% 的事件。 (B）高质量细胞核样本的示例，包含去除碎片的步骤。在此示例中，碎片所占比例为 &lt;流式细胞仪记录的所有事件的10%。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样本类型（2 个大脑）</td>
			<td>平均得率（4 次独立制备）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 周龄雄性大脑</td>
			<td> 3.59  ± 1.76 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 周龄雄性大脑</td>
			<td> 6.41  ± 1.33 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 周龄雄性大脑</td>
			<td>14.59 ±  2.05 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 周龄雌性大脑</td>
			<td> 2.54  ± 0.75 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 周龄雌性大脑</td>
			<td> 4.66  ± 1.29 x 105</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 周龄雌性大脑</td>
			<td> 7.95  ± 3.51 x 105</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：不同性别和年龄的非洲 turquoise killifish 两枚脑组织的平均预期细胞核产量。 每类样本经四次独立的细胞核制备，产量以105个细胞核 ± 均值标准误表示。
补充图1：使用标准方案与优化方案对冻存鳉鱼脑组织进行细胞核分离的质量比较。（A）通过显微镜评估细胞核质量。将细胞核与0.4%台盼蓝溶液按1:1混合，通过60倍明场成像在显微镜下观察。（B）通过流式细胞术定量分析细胞核与碎片载量。细胞核样品用1:100稀释的碘化丙啶（PI）染色后上机检测。（C）不同基准方案下显微镜与流式细胞术质量评估指标的汇总。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：碎片去除步骤的示意图。（A）离心前碎片去除分层示意图。（B）离心后上清液去除示意图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种从短寿命脊椎动物模型Nothobranchius furzeri的大脑中分离细胞核的实验方案，可用于后续单细胞核RNA测序或单细胞核染色质可及性测序分析（ATAC-seq）等应用。

在脊椎动物系统中以单细胞分辨率研究脑衰老仍面临成本、时间和技术上的挑战。这里，我们……

这是首个针对非洲青鳉鱼冷冻脑组织优化的高质量细胞核分离方案，可用于单细胞核测序实验。非洲青鳉鱼是一种新兴的脊椎动物衰老研究模型。该方案以极其温和的方式分离细胞核，区别于为髓鞘化程度更高的其他生物脑组织优化的较为剧烈的方案；若将后者用于非洲青鳉鱼，会导致细胞核降解。本方法将有助于我们在单细胞水平上深入理解脑衰老过程。该方法可良好地适用于需要更温和细胞核分离的其他组织。本实验方案操作简便，最具挑战性的步骤是用于去除碎片的梯度离心，此步骤宁可缓慢而精确，也不可快速而混乱。演示该实验步骤的是Benayoun实验室的研究技术员Ari Adler和博士后学者Brian Teefy。解剖鳉鱼后，将冷冻的脑组织在冰上解冻10分钟，然后在2毫升的Dounce匀浆器中加入1毫升预冷的细胞核裂解缓冲液，对脑组织进行匀浆。在裂解样品时，需将匀浆器保持在冰上，并避免产生气泡。按照文稿中所述方法用Dounce匀浆器处理组织，将样品置于冰上静置2分钟。随后，将样品通过70微米细胞滤网过滤至已预先用5% BSA包被的15毫升锥形管中。用移液器将4毫升细胞核洗涤缓冲液加至70微米细胞滤网上方，并轻轻倒置管子5次以混匀。使用水平转子，在 4°C 条件下以 500 ×g 离心样品 10 分钟。轻轻将上清液倒入液体废液容器中弃去。保持样品管直立，用 P1000 移液器吸除残留的洗涤缓冲液。立即使用宽口 P1000 移液器吸头将细胞核重悬于 1 毫升细胞核洗涤缓冲液中。然后加入 4 毫升细胞核洗涤缓冲液，使总体积达到 5 毫升，并按照之前的方法混匀。通过离心沉淀细胞核。弃去上清液，用宽口移液器吸头将细胞核重悬于1毫升细胞核洗涤缓冲液中。随后，将细胞核转移至流式细胞术检测管中。向细胞悬液中加入300微升碎片去除溶液，使用宽口吸头反复吹打，充分混匀，直至混合物呈均一状态。将离心管倾斜一定角度，使用 P1000 移液器在细胞核溶液上方轻轻叠加 1 毫升细胞核洗涤缓冲液。在 4 摄氏度下，以 3000 G 的转速使用水平转子离心机离心样品 10 分钟。使用 P1000 移液器完全弃去上层两相。将下层转移至预先用5% BSA包被的15毫升锥形管中。然后用细胞核洗涤缓冲液定容至15毫升，通过倒置混匀管子三次。在4°C条件下，使用水平转子以1000×g离心10分钟。小心移除上清液，并立即使用宽口移液枪头将沉淀在 150 µL 细胞核洗涤缓冲液中重悬。更换为设定为 300 µL 的标准口径移液枪头，吸取全部样品，然后在移液枪头末端安装一个 40 µm 的枪头滤器。用力将样品通过滤膜推入低DNA结合的1.5毫升微量离心管中，对样品进行过滤。在FACS管中，将10微升过滤后的细胞核样品重悬于90微升推荐的流式细胞术缓冲液中。用碘化丙啶对样品染色，终浓度为每毫升1微克。按照文稿中所述设置好工作区后，点击右下角的播放图标以启动流速。使用侧向散射面积与 HDRT 的关系图检查样本中是否存在气泡或团块。同时，通过查看侧向散射与前向散射图，确认事件信号是否在窗口范围内正常累积。若要查看放大图像，请双击侧向散射区域与 PerCP-Vio700-A 图谱。点击左上角工具栏中带有垂直线的按钮以选择象限门控。然后，在侧向散射区域与 PerCP-Vio700-A 图谱中任意位置点击，图谱内将显示象限。单击象限分隔线上的任意位置，然后滑动光标以调整象限的位置。调整象限，使左上象限包含碎片，右上象限包含细胞核。单击方形的灰色“I”图标以打开属性窗口。转到区域函数选项卡，确保顶部项目旁显示绿色对勾，表示已选中整个图谱。在函数列表下，单击“每微升计数”以显示绿色对勾。单击“确定”，每个象限将显示每微升的计数指标。如有需要，可从区域功能选项卡中选择“计数”和“百分比总计”，以查看原始计数值和百分比。通过点击左上角工具栏中的多边形按钮，在此细胞群周围绘制一个多边形门控区域。然后单击一次并拖动鼠标，以绘制门控区域的直线段。再次单击以完成并开始下一个，然后双击以完成设门。单击门的边界并移动鼠标以重新定位门。单击门的顶点以修改其形状，设门区域内细胞群的每微升计数将随之显示。形态完整的单个细胞核表现为具有完整核膜的单核，适用于后续分析。然而，不健康的细胞核其核膜受损，易导致细胞核聚集，并可能在后续应用中产生背景信号。在右上象限中，细胞核以单体和多聚体形式存在，其中单体为事件数最少的群集，双联体和三联体依次增多。在未进行去碎片步骤的低质量细胞核制备样本中，碎片由最左侧两个象限中的事件标记。碎片所占事件比例超过40%。然而，在高质量实验中，碎片占所有事件的比例低于15%。必须在去除碎片的离心步骤后彻底移除中间层，以减少污染性背景RNA。采用本方案分离的细胞核可用于单细胞核RNA测序或ATAC测序，从而获得单细胞水平的转录组和表观遗传信息。该技术将使研究人员能够在非洲 turquoise killifish（一种天然短寿命的脊椎动物衰老研究模型生物）中以单细胞分辨率探索大脑基因调控机制。

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Research

科研

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Neuroscience

神经科学

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一种蓝鳉（Nothobranchius furzeri）实验室饲养方案

我们介绍一种从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞的方案，适用于生理和病理条件。分离后，从这些细胞中提取RNA，以分析其基因表达谱。该方案可获得高质量的RNA，用于后续的qPCR和转录组学等分析。...

从幼年斑马鱼大脑中分离神经元、巨噬细胞和小胶质细胞及其RNA提取

本文介绍一种从转基因生物中简单分离表达绿色荧光蛋白的特定活神经元细胞群的实验方案 秀丽隐杆线虫 线条.

从线虫 Caenorhabditis elegans 中分离特定神经元群体

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。...

使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

本文介绍一种对斑马鱼胚胎大脑进行活体成像的方法，可观察至幼虫期和稚鱼期。该方法借鉴电生理学技术，属于微创操作，能够获取成熟神经元的细胞及亚细胞结构细节，并可与光遗传学及神经药理学研究相结合，用于表征脑功能及药物干预效果。...

通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼虫和幼鱼全脑组织的活体成像

学习从非洲绿松石鳉鱼脑组织中温和分离高质量细胞核的方法，用于单核RNA测序和ATAC-seq分析。该技术有助于在单细胞水平研究脑衰老机制，为衰老研究提供重要的实验基础。

从自然寿命较短的成年非洲蓝鳉鱼脑组织中温和分离细胞核

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