Name: 体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学习使用双光子激光扫描显微镜检测小鼠下颌下腺的体内血管通透性。该方法通过荧光示踪剂评估内皮屏障功能，为研究生理和病理条件下的血管通透性提供了重要的实验手段。

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本研究由国家自然科学基金（项目编号 31972908、81991500、81991502、81771093 和 81974151）以及北京市自然科学基金（项目编号 7202082）资助。

所有实验程序均经北京大学医学部动物研究伦理委员会批准，并符合《实验动物护理与使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）。本研究采用 8 至 10 周龄的雄性野生型（WT）小鼠。实验动物均得到妥善处理，以尽量减少其疼痛与不适。
1. 动物实验操作
<ol>
	<li>准备并施用麻醉剂和示踪剂。
	<ol>
		<li>在整个研究过程中保持无菌条件，并通过高压灭菌对器械进行消毒。将小鼠分为两组。 
		注意：对照组不做任何处理，另一组则进行单侧颌下腺导管结扎1天，作为实验组。分组时应选择体重和年龄相近的小鼠，以减少体重和年龄对血管通透性的影响。</li>
		<li>选择合适的示踪剂，例如异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（分子量：4 kDa；FD4）和罗丹明B标记的葡聚糖（分子量：70 kDa；RD70）（见材料表），其激发/发射光谱不同，以便在通透性检测中最小化荧光信号之间的干扰（分别使用FITC或罗丹明B滤光片）。 
		注意：FD4和RD70的激发波长分别为488 nm和594 nm，所选发射波长分别为511–564 nm和617–669 nm。</li>
		<li>将示踪剂用无菌磷酸盐缓冲液（1× PBS）稀释成100 mg/mL的储备液，并将分装样品避光保存于−20 °C。 
		注意：分子量为4&#160;kDa的葡聚糖即使在无病理状态下也会迅速从小鼠颌下腺的血液中渗出10。</li>
		<li>通过腹腔注射三溴乙醇（25 g小鼠的剂量约为600 µL）以麻醉小鼠。根据当地动物伦理委员会的建议提供镇痛措施。 
		注意：麻醉诱导后，使用兽用眼膏涂抹眼睛以防止干燥。应妥善护理动物11。等待小鼠对机械刺激（如脚趾夹捏）无运动反应时再进行后续操作。</li>
		<li>通过眶后静脉注射两种不同分子量的细胞旁路通透性示踪剂混合物（FD4和RD70）（0.5 mg/g体重）。每只小鼠注射100 µL示踪剂混合溶液，其中每种染料各50 µL，按1:1比例混合。
		<ol>
			<li>麻醉后，轻轻固定小鼠的头部和颈部，使一侧眼球略微突出。将装有荧光示踪剂的胰岛素注射器（注意避免注射器内混入空气）沿眼角垂直于眼球方向插入。 
			&#8203;注意：若正确插入眶后静脉，染料溶液可顺利注入静脉，注射过程中无明显阻力。此外，小鼠尾静脉注射也可作为静脉给予示踪分子的替代方法。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行颌下腺的分离。 
	注意：手术中使用无菌器械，包括组织剪和分离镊。
	<ol>
		<li>在体视显微镜下小心分离单侧腺体，避免损伤周围血管和神经。
		<ol>
			<li>注射细胞旁路通透性示踪剂后，迅速将小鼠置于纸板上，仰卧固定四肢和头部。在颈部皮肤涂抹脱毛膏去除小鼠毛发，并在手术前用75%乙醇对皮肤进行消毒。</li>
			<li>然后在体视显微镜下，用普通组织剪剪开颈部表皮，暴露双侧颌下腺（本实验处理右侧腺体）。接着使用钝头组织分离镊（见材料表）轻轻将被膜与腺体表面分离，注意避免损伤腺体组织和血管。</li>
			<li>在不损伤腺体结构的前提下，将被膜从腺体表面完全分离。此外，应确保小鼠固定和腺体分离的整个过程在10分钟内完成。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 双光子显微镜设置
<ol>
	<li>将定制的持物架连接至负压装置，并预先检查负压效果是否正常实现。 
	注：该持物架形状类似于微型放大镜，中心为一片圆形平面玻璃（直径：4.32 mm，图1）。负压装置为实验室自行设计，持物架通过橡胶管与引流瓶相连，引流瓶再通过一段短橡胶管连接至负压控制器。通过此方式，负压控制器可调节压力，确保组织被吸入持物架内。
	<ol>
		<li>将持物架一端连接至负压装置。为测试负压装置是否完好且功能正常，将持物架倒置，滴加一滴水，并将负压值设定为20单位。若水滴被迅速且完全吸走，则表明负压装置与持物架已成功安装。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠暴露的颌下腺轻柔地放置于定制持物架上，并通过负压吸引将组织尽可能远离小鼠身体吸起，以减少由呼吸及其他因素引起的运动伪影。</li>
	<li>使用25倍/数值孔径1.0的水浸物镜（专用于近红外成像）对附着在腺体上的支撑材料进行成像。 
	&#8203;注：本实验使用直立式双光子显微镜（见材料表）。示踪剂注射后，血管必须立即呈现明显荧光并可见。</li>
</ol>
3. 血管成像与通透性检测
<ol>
	<li>选定腺体视野后应立即开始成像。 
	注意：通常根据实验设计，一般会采集20秒或更长时间内的45-50帧图像的时间序列。</li>
	<li>沿Z轴方向以2 µm为步长，从腺体表面向组织内部70-140 µm深度范围内连续采集图像，以构建三维（3D）结构。</li>
	<li>对血管进行延时成像，以测量下颌下腺（SMG）中的血管通透性。 
	注意：运行显微镜软件后（参见材料表），按以下方式设置程序菜单中的参数。
	<ol>
		<li>在“Explorer”对话框中，点击添加新文件夹，并更改文件名。</li>
		<li>返回到采集列。在XY模式下，格式设为512 × 512，速度设为400 Hz，开启双向X扫描。</li>
		<li>将缩放系数（Zoom factor）分别设为0.75和1.5。</li>
		<li>为进行延时成像，在采集模式下选择xyt。根据实验需求将持续时间设为20 s、30 min或更长时间。</li>
		<li>为构建3D图像，将采集模式设为xyz。Z轴步长可根据实际情况进行设置。</li>
		<li>设置完成后，点击Live，在图像成帧窗口中观察两个通道及重叠通道的血管成像，并选择感兴趣区域。</li>
		<li>点击Start开始成像。 
		&#8203;注意：小鼠在麻醉状态下进行成像时，必须全程有人看护，不得无人值守。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>为了评估血管通透性，使用 Image J 软件计算 FD4 和 RD70 在血管外与血管内的荧光强度比值，并将其分别记为血管外和血管内强度4。 
	注意：通过追踪葡聚糖的运输来评估血管通透性的变化，可反映内皮屏障功能的改变。此外，通过计算血管直径和数量变化，观察血管形态和密度。
	<ol>
		<li>运行 Image J 软件（参见材料表）。</li>
		<li>点击 文件，选择 打开，以打开在双光子显微镜下采集的血管图像。</li>
		<li>选择 图像，将 类型 设置为 16 位，以转换图像格式。</li>
		<li>选择 分析，在 设置测量值 中选择 面积、平均值、IntDen，点击 确定 确认。</li>
		<li>在 分析 菜单下选择 工具，打开 ROI 管理器，并勾选 显示全部 和 标签。</li>
		<li>测量血管内荧光强度值：在主界面点击 套索 工具，勾勒出血管的轮廓，然后在 ROI 管理器 中点击 添加。重复此步骤以选择多个血管。选中 ROI 管理器中的所有对象后，点击 测量。</li>
		<li>测量总荧光强度值：勾勒整个图像区域，点击 测量，所得结果即为图像的总荧光强度值。</li>
		<li>计算血管外荧光强度值：将数据复制到 Excel 中进行计算。血管外荧光强度比值 = (1 − 血管内荧光强度值 / 总荧光强度值) × 100%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 下游应用
<ol>
	<li>实验过程中，通过测量红细胞（在双光子显微镜下呈黑色小点）移动的距离来计算血流速度4 经历的时间持续长度。</li>
	<li>为了观察血细胞穿过内皮细胞的运动，可使用荧光标记血细胞。随后，通过小鼠尾静脉注射将荧光标记的细胞与FD4或RD70一同注入。循环5分钟后，追踪目标细胞一段时间。 
	&#8203;注意：总共 2 x 106 通过尾静脉注射，将来自供体小鼠脾脏的CFSE（羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，一种膜通透性荧光染料）标记的淋巴细胞转移至受体动物，并在实验动物模型中研究淋巴细胞向颌下腺的浸润情况4.</li>
</ol>
6. 动物护理与恢复
<ol>
	<li>在整个实验过程中妥善照顾动物。 
	注意：实验过程中，接受手术的动物在完全恢复之前，不得放回与其他动物同处的环境中。</li>
	<li>在动物恢复足够意识之前，不得使其无人看管。 
	注意：持续观察小鼠的呼吸状况，并将其置于动物加热垫上以保持体温。根据建议提供术后镇痛护理和镇痛药物。&#160;当地动物伦理委员会</li>
</ol>

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<li>Vestweber, D., Wessel, F., Nottebaum, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+in+the+regulation+of+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences in the regulation of leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Seminars in Immunopathology. 36 (2), 177-192 (2014).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

内皮屏障功能的维持与调控对血管稳态至关重要。内皮细胞及其细胞间连接在维持和调控血管完整性方面发挥着关键作用12。血流的剪切力、生长因子以及炎症因子均可引起血管通透性的改变，从而参与高血压、糖尿病和自身免疫性疾病等全身性疾病的發生与发展13,14,15。唾液腺的血管分布和血流量在所有器官和组织中位居前列，但针对唾液腺血管系统的研究尚未广泛开展。对唾液腺血管、特别是内皮屏障功能进行更深入和全面的研究，将为揭示唾液分泌机制提供新的线索，并推动血管生物学的发展。
这 体内 双光子激光扫描显微技术可通过静脉注射荧光染料，在不牺牲动物的情况下定量评估血管通透性。使用不同分子量或尺寸的荧光标记葡聚糖与微球，可更准确地评估内皮损伤程度。同时，通过活体血管通透性评价系统可实时测定血管通透性的动态动力学变化。另一优势在于能够清晰区分不同类型血管，如微动...

多种唾液腺可分泌唾液，唾液主要作为抵御感染的第一道防线，并有助于消化，因此在口腔及整体健康中发挥着至关重要的作用1。血液供应对唾液腺分泌至关重要，因为它持续提供水分、电解质以及形成初级唾液的分子。由紧密连接（tight junction, TJ）复合体调控的内皮屏障功能严格而精细地限制了毛细血管的通透性，而毛细血管通常对水、溶质、蛋白质甚至从循环血管进入唾液腺组织的细胞具有高度通透性2,3。我们先前发现，胆碱能刺激可导致内皮TJ开放，从而促进唾液分泌；而在干燥综合征中，内皮屏障功能受损则与下颌下腺（submandibular glands, SMGs）的分泌减少和淋巴细胞浸润密切相关4。这些数据表明，在多种唾液腺疾病的研究中，应充分重视内皮屏障功能的作用。
双光子激光扫描显微镜是观察完整组织中细胞动态的有力工具 体内该技术的优点之一是，当使用近红外光（NIR）激发样本时，近红外光比可见光或紫外光具有更深的组织穿透能力，并且在适当条件下不会对组织造成明显的光损伤。5,6事实上，唾液腺是一种高度均质且位置表浅的组织，其表面的腺泡细胞距离腺体表面仅约30 µm7,8已证明，活体共聚焦显微镜可在亚细胞分辨率下研究活体小鼠唾液腺的外分泌过程及肌动蛋白细胞骨架8双光子激光扫描显微镜不仅具备传统共聚焦显微镜的优点，还可用于检测更深的组织并获得更清晰的成像。在此，常用作细胞旁通透性示踪剂的荧光标记葡聚糖因其具有不同分子大小的优势，可用于检测紧密连接孔径的大小。9在本研究中，建立了一种活体实时双光子激光扫描显微技术 原位 小鼠SMGs内皮屏障功能的评估。每个工作步骤 体内 本方案描述了小鼠下颌下腺中血管通透性的检测方法。以下是在小鼠下颌下腺导管结扎模型中检测内皮屏障功能的示例。

<table><tbody><tr><td>双光子显微镜（TCS-SP8 DIVE）</td><td>Leica, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 kDa FITC标记的葡聚糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>70 kDa 罗丹明B标记的葡聚糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>钝性组织分离镊（镍制）</td><td>北京华博公司</td><td>NZW28</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌注射器</td><td>志玉公司</td><td></td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Image J 软件</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>0253316</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Leica Application Suite X 软件</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液</td><td>Servicebio</td><td>G4207-500</td><td></td></tr><tr><td>组织剪刀</td><td>北京华博公司</td><td>M286-05</td><td></td></tr><tr><td>三溴乙醇</td><td>JITIAN Bio</td><td>JT0781</td><td></td></tr></tbody></table>

体内 小鼠下颌下腺血管通透性检测

In Vivo Vascular Permeability Detection in Mouse Submandibular Gland

唾液在口腔及整体健康中发挥着重要作用。血管完整的内皮屏障功能能够促进唾液分泌，而内皮屏障功能障碍则与多种唾液腺分泌疾病相关。本方案描述了一种 体内 用于评估小鼠下颌下腺（SMG）内皮紧密连接（TJs）功能的旁细胞通透性检测方法。首先，将不同分子量的荧光标记葡聚糖（4 kDa、40 kDa 或 70 kDa）注射至小鼠眶静脉。随后，取单侧 SMG 组织，置于定制夹持装置中，在双光子激光扫描显微镜下进行固定，并采集血管、腺泡及导管的图像。利用该方法，可实时动态监测不同大小示踪剂从血管泄漏至腺泡基底侧，甚至穿过腺泡上皮进入导管的过程，从而评估生理或病理生理条件下内皮屏障功能的变化。

按照实验方案，将单侧下颌下腺固定于自制的支架上，并尽可能使腺体远离小鼠身体，以防止呼吸运动引起成像伪影。在显微镜下可观察到血管中红细胞（黑色点状）的快速流动。在通过目镜找到组织视野后，需切换至显微镜软件进行操作。在对照组中，两种示踪剂均存在于小鼠下颌下腺的血管内。特别是由于FD4分子量较小，能够从血管渗出至腺泡和导管的基底侧，从而清晰地勾勒出腺泡和导管的形态（如A和D在图2A中所示）。相比之下，分子量较高的葡聚糖（如40 kDa和70 kDa）则无法清晰区分下颌下腺的形态结构。实际上，RD70主要分布在大血管和微血管中。在导管结扎组中，FD4和RD70均渗出至腺泡的基底侧，表明导管结扎可破坏血管内皮屏障功能，从而增加对大分子物质的通透性。半定量的FD4和RD70荧光强度结果也证实了上述现象（图2B）。此外，血管直径增大，表明结扎导管1天即可诱导血管扩张。进一步地，三维图像显示结扎组血管周围FD4和RD70的荧光信号更加弥散模糊（<strong clas...

在本实验方案中，通过向测试动物模型的面静脉注射不同分子量的荧光示踪剂，评估下颌下腺（SMG）的内皮屏障功能。 体内 在双光子激光扫描显微镜下。

唾液在口腔及整体健康中发挥着重要作用。血管完整的内皮屏障功能能够促进唾液分泌，而……

本实验方案描述了一种体内旁细胞通透性检测方法，用于评估小鼠下颌下腺中紧密内皮细胞连接的功能。双光子激光扫描显微镜不仅具备传统共聚焦显微镜的优点，还可用于检测更深的组织，并实现更清晰的成像。本实验为评估不同组织尤其是动物体表组织和器官的血管通透性提供了一种良好的检测方法。首先选择合适的示踪剂，例如荧光素、异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖和罗丹明B标记的葡聚糖，其激发发射光谱应各不相同，以尽量减少通透性检测中荧光信号之间的干扰。将示踪剂稀释至无菌磷酸盐缓冲液中，配制成100毫克/毫升的储备液，并将分装样品避光保存于-20摄氏度。对8至10周龄的雄性野生型小鼠进行麻醉后，轻轻固定小鼠的头部和颈部，使一侧眼球略微突出。将装有100微升荧光示踪剂溶液混合物的胰岛素注射器沿眼角以垂直于眼球的角度插入。注射后，迅速将小鼠仰卧位固定在纸板上，用胶带固定其四肢和头部。对于下颌下腺（SMG）的分离，在体视显微镜下，使用普通组织剪刀剪开颈部表皮，暴露双侧下颌下腺。接下来，使用钝性组织分离针轻轻将囊膜与腺体表面分离，注意不要损伤腺体组织、血管及腺体结构。将定制的固定装置连接至负压设备，并预先检查负压效果是否正常。将暴露的下颌下腺轻轻放置在定制固定装置上，并通过负压吸引尽可能远离小鼠身体，以减少由呼吸及其他因素引起的运动伪影。在选定腺体位置后尽快开始成像。沿Z轴方向，从腺体表面开始，以每步2微米的间隔，连续采集图像，深度达组织内部70至140微米，以构建三维结构。随后，对血管进行延时成像，以测量下颌下腺（SMG）中的血管通透性。在“Explorer”对话框中，单击“Add New Folder”并更改文件名。然后返回采集列。在XY模式下，格式为512乘以512，速度为400赫兹。打开双向X，将缩放系数设置为0.75和1.5以进行缩放。接下来，在采集模式下选择XYT以进行延时成像。根据实验需要，将持续时间设置为20秒、30分钟或更长时间。设置条件后，单击“Live”以在成像框中观察两个通道及重叠通道的血管成像，并选择感兴趣的区域。单击“Start”开始成像，进行活体血管通透性检测，并获取小鼠血管的三维图像。此处显示下颌下腺。在对照组中，两种示踪剂均存在于下颌下腺的血管内。由于分子量较小，FD4能够从血管渗出至腺泡和导管的基底侧，从而清晰地显示出腺泡和导管的形态。RD70 分布于大血管和微血管中。在导管结扎组中，FD4 和 RD70 均渗出至腺泡的基底侧，表明导管结扎可破坏内皮屏障功能，并增加对大分子物质的通透性。此外，半定量的 FD4 和 RD70 荧光强度结果进一步证实了这些观察结果。三维图像显示，与对照组相比，结扎组血管周围FD4和RD70的荧光信号明显减弱。精细的下颌下腺分离以及显微镜的适当放置和调整是成功检测的必要前提。按照操作步骤，可通过结合红细胞的运动来计算血流速度，并追踪荧光标记血细胞的渗入情况。

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生物学

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体内小鼠下颌下腺血管通透性检测

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