Name: 优化经食管心房起搏以评估小鼠心房颤动易感性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学习经食管心房起搏技术以评估小鼠心房颤动易感性。该方法支持同一动物重复测试，优化实验参数并识别副交感神经刺激引起的伪影，提高电生理研究结果的可重复性。

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图2 使用 BioRender.com 制作。本研究由美国国立卫生研究院下属的国家心肺血液研究所（HL096844 和 HL133127）、美国心脏协会（2160035、18SFRN34230125 和 903918 [MBM]）以及美国国立卫生研究院转化科学促进国家中心（UL1 TR000445）的资助项目支持。

该实验程序已获得范德堡大学机构动物护理和使用委员会的批准，并符合《实验动物护理和使用指南》的要求。本方案采用遗传性9和获得性10（如高血压）两种房颤易感小鼠模型进行开发。操作人员对所研究小鼠的表型保持盲态。
1. 动物选择
<ol>
	<li>对于遗传模型，按照以下所述方法（见步骤6）对小鼠进行双周一次（即每隔一周）的心房起搏，以确定房颤易感性的最佳时期。
	<ol>
		<li>从8周龄开始进行双周起搏。使用同窝野生型小鼠作为对照组以减少变异性。应同时研究雄性和雌性小鼠，因为其中一种性别可能不会表现出房颤表型9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于获得性模型，在小鼠达到生理成熟后（约12周龄）10进行起搏。如上所述，应同时研究雄性和雌性小鼠。</li>
	<li>在这些初步研究中，应同时进行短阵快速起搏8（使用固定的起搏周长[CL]）和递减性起搏7（起搏周长逐步缩短），以确定最佳起搏模式。每次操作之间至少间隔24小时。 
	注意：随着研究的小鼠数量逐渐增加，应定期回顾累积数据，以确定最适宜的年龄、性别和起搏模式，这些条件应能在房颤易感小鼠中诱导房颤，但在对照组中不诱导。
	<ol>
		<li>采用多种房颤易感性定义来分析数据（例如房颤发作次数8、总房颤持续时间9、房颤发生率4以及持续性房颤发生率，通常定义为持续10秒11或15秒12，甚至长达5分钟13,14），因为某些模型可能仅在部分定义下表现出房颤表型，而在其他定义下则不表现9。 
		注意：不同已发表研究中对房颤发作和房颤易感性的定义存在差异4,7。房颤发作8通常定义为持续至少1秒的快速心房电活动，并伴有不规则的不规则&#160;心室反应（图1）。除房颤外，心房起搏还可能诱发心房扑动，其心室反应可为规则或不规则。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在后续对更多小鼠的研究中，使用已优化的模型特异性参数及房颤易感性定义。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>使用1 L/min的100%氧气携带3%异氟烷（见材料表）在诱导室中对小鼠进行麻醉。 
	注意：异氟烷有害，可能刺激皮肤或眼睛，并可引起头晕、疲劳和头痛等中枢神经系统毒性。应在通风良好的区域使用，并配备适当的废气清除装置（例如活性炭罐）。</li>
	<li>待小鼠脚掌反射消失后，将其仰卧置于可维持体温约37 °C的加热垫上，并用胶带将后肢固定于垫面。</li>
	<li>在小鼠眼部涂抹润滑眼膏，以防角膜干燥。</li>
	<li>将&#160;麻醉面罩牢固地覆盖在小鼠鼻部，使用1 L/min的100%氧气携带1%异氟烷维持麻醉。确保鼻孔无阻塞，因为小鼠为 obligate nose breathers（必须经鼻呼吸）。</li>
	<li>将27 G心电图针状电极（见材料表）皮下插入前肢，并连接至生物放大器和数据采集硬件，以获取体表心电图（ECG，I导联）。将另一针状电极插入左后肢作为接地电极以完成信号接地。</li>
</ol>
3. 导管置入
<ol>
	<li>短暂移除小鼠的异氟烷面罩。</li>
	<li>将连接至刺激器和刺激隔离器（参见材料表）的2-F八极电极导管（电极宽度和间距 = 0.5 mm）插入食管（图2）。
	<ol>
		<li>插入深度应大致等于从口腔（颈部伸展状态下）至剑突稍上方的距离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重新将异氟烷面罩置于小鼠鼻孔处。</li>
	<li>使用分析软件（参见材料表）开始数据采集，持续记录I导联心电图。</li>
	<li>将刺激隔离器模式调整为双极模式。刺激时使用最远端的一对电极。</li>
	<li>在食管内正确放置导管以实现有效捕获。具体操作：施加1.5 mA、脉宽2 ms的刺激，刺激周长（CL）略短于窦性周长（例如，若窦性周长为120 ms，则使用100 ms的周长）。仔细调整导管位置，直至获得稳定的心房捕获。</li>
</ol>
4. 阈值的确定
<ol>
	<li>为确定心房舒张期起搏阈值（TH），在用于心房起搏的周长（CL）下，以1.5 mA的电流强度和2 ms的脉宽开始起搏。以0.05 mA为递减步长逐步降低刺激幅度，直至心房起搏消失，随后再逐步增加刺激幅度直至恢复起搏。 
	注意：能够稳定获得心房起搏的最低刺激幅度即为心房TH。由于高刺激幅度可能引起副交感神经兴奋，表现为起搏过程中出现明显房室传导阻滞并诱发伪性心房颤动9，因此可接受的最大TH为0.75 mA。如有必要，可重新调整导管位置，以确保TH ≤0.75 mA。</li>
	<li>将刺激幅度调整为TH的两倍。</li>
</ol>
5. 电生理特性的测定
<ol>
	<li>在快速心房起搏诱发房颤之前，测量电生理参数，包括窦房结恢复时间（SNRT）、文氏周期长度（WCL）和房室有效不应期（AVERP）15。</li>
</ol>
6. 心房心律失常易感性
<ol>
	<li>根据初步研究结果（步骤 1.1.–1.4.）确定采用不同周长（CL）的短阵快速刺激或递减刺激，以两倍阈值强度（TH）和 2 ms 脉宽进行起搏。</li>
	<li>对于短阵快速刺激，初始周长为 50 ms，持续起搏 15 秒，随后依次以 40 ms、30 ms、25 ms、20 ms 和 15 ms 的周长进行起搏8,10。每次起搏序列后暂停 30 秒，以允许组织恢复后再继续。若某次起搏序列后发生心房颤动（AF），需在心律转复后等待 30 秒再进行下一次起搏。</li>
	<li>对于递减刺激，以 40 ms 周长开始起搏，每 2 秒减少 2 ms，直至周长达到 20 ms 时终止7。每种起搏序列重复进行三遍16或五遍17，每次序列后暂停 30 秒以供恢复。同上，若出现心房颤动，需在心律终止后等待 30 秒再继续后续起搏。 
	注意：在初步实验中优化方案参数时（即步骤 1.1.–1.5.），应使用五次起搏序列。随后进行事后分析，以确定三遍或五遍重复是否具有更高的敏感性。</li>
	<li>在最后一次起搏序列结束后，若出现持续 30 秒的窦性心律，或发生持续 10 分钟的心房颤动，则终止实验，以先发生者为准。</li>
</ol>
7. 术后处理
<ol>
	<li>停止数据采集。</li>
	<li>轻柔地移除导管和心电图电极。</li>
	<li>停止麻醉。</li>
	<li>将麻醉状态的小鼠放入笼中，观察10分钟，确保其恢复。</li>
	<li>保存数据文件。若需进行连续测试，需至少等待24小时后方可重复起搏操作。</li>
</ol>

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<li>McCauley, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channel+and+structural+remodeling+in+obesity-mediated+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Arrhythmia+and+Electrophysiology%22%5BJournal%5D)">Ion channel and structural remodeling in obesity-mediated atrial fibrillation.</a> Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 13 (8), 00896(2020).</li>
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<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abstract+B-PO01-017%3A+RyR2+hyperactivity+promotes+susceptibility+to+ventricular+tachycardia+in+structural+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Abstract B-PO01-017: RyR2 hyperactivity promotes susceptibility to ventricular tachycardia in structural heart disease.</a> Heart Rhythm. 18, Suppl_8 57(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

经食管心房起搏不仅能够在同一动物体内进行系列研究，而且其持续时间通常比心内电生理研究更短（约20分钟），从而减少了麻醉药物的使用及其对电生理参数的影响。
对于每种小鼠模型，最初都必须优化方法。在正常小鼠中，衰老会增加心房颤动（AF）的可诱导性18,19，而不同的遗传模型可能仅在有限的时间段内表现出AF的可诱导性。每隔一周进行预实验，可以确定一个年龄窗口，在此期间AF表型小鼠可被诱导，而对照组小鼠则不能。性别可能是一个决定性因素，因为一种或两种性别的小鼠都可能表现出可诱导的AF9。此外，特定小鼠可能仅对一种起搏模式表现出AF易感性，而其他小鼠则对另一种模式或多种模式表现出AF易感性9。
快速心房起搏期间，小鼠可能出现过度的房室传导阻滞，这种情况常与心房颤动（AF）的诱发同时发生。该现象是由于意外刺激了位于左心房后壁的神...

心房颤动（AF）是多种获得性和遗传性危险因素共同作用的最终通路。在研究AF基质的病理生理机制时，小鼠模型具有优势，因为小鼠易于进行遗传操作，且通常能够重现人类不同临床表型下观察到的AF易感性1,2,3。然而，小鼠极少发生自发性心房颤动4，因此需要采用激发性心房起搏研究。
程序性电刺激（PES）可用于评估小鼠心房电生理特性及心房颤动（AF）易感性，可通过心内电极5或经食管电极6起搏实现。尽管经食管方法作为可存活手术具有显著优势，但其应用因大量已发表的实验方案7,8以及可能影响可重复性的多种变异来源而变得复杂9。此外，现有文献中对不同方案的比较报道有限，使得选择合适的起搏方案具有挑战性。
本方案旨在采用系统性策略，建立针对特定模型的小鼠房颤易感性评估经食管程序性电刺激（PES）方法，以提高实验的可重复性。重要的是，需首先开展初步的预实验，通过考虑年龄、性别及起搏模式的差异来优化起搏方案，所设计的起搏程序应尽量减少意外的副交感神经刺激，以免干扰实验结果9。

<table><tbody><tr><td>27 G 心电图电极</td><td>ADInstruments</td><td>MLA1204</td><td></td></tr><tr><td>2-F 八极电极导管</td><td>NuMED</td><td>CIBercath</td><td></td></tr><tr><td>活性炭罐</td><td>VetEquip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>分析软件</td><td>ADInstruments</td><td>LabChart v8.1.13</td><td></td></tr><tr><td>生物放大器</td><td>ADInstruments</td><td>FE231</td><td></td></tr><tr><td>数据采集硬件</td><td>ADInstruments</td><td>PowerLab 26T</td><td></td></tr><tr><td>眼药膏</td><td>MWI Veterinary</td><td>NC1886507</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Braintree Scientific</td><td>DPIP</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>刺激器</td><td>Bloom Associates</td><td>DTU-210</td><td></td></tr><tr><td>刺激隔离器</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model A365</td><td></td></tr></tbody></table>

优化经食管心房起搏评估小鼠心房颤动易感性

Optimization of Transesophageal Atrial Pacing to Assess Atrial Fibrillation Susceptibility in Mice

房颤（AF）的遗传性和获得性危险因素小鼠模型在研究AF的分子决定因素方面已被证明具有重要价值。可通过经食管心房起搏进行程序性电刺激，作为一种可存活的操作，从而实现对同一只动物进行系列检测。然而，目前存在多种起搏方案，这给实验的可重复性带来了困难。本方案旨在提供一种标准化策略，以建立针对特定模型的实验参数，从而提高不同研究之间的可重复性。需先开展初步研究，以优化所考察特定模型的实验方法，包括研究时动物的年龄、性别以及起搏方案的参数（如起搏模式和房颤易感性的定义）。尤为重要的是，应避免使用过高的刺激能量，因为这可能导致神经节丛受到刺激，意外激活副交感神经系统，表现为起搏期间出现明显的房室（AV）阻滞，并常伴随人为假象的房颤诱发。出现此类并发症的动物必须从分析中剔除。

经食管心房起搏研究通过测定窦房结恢复时间（SNRT）和房室结有效不应期（AVERP）以及心房颤动（AF）易感性，来评估窦房结和房室结的电生理特性6（图1）。心电图（ECG）记录可用于测量P波持续时间、PR间期、QRS持续时间和QT/QTc间期。在快速心房起搏期间持续记录心电图，可提供以下心房颤动易损性的指标：研究期间诱发的心房颤动发作次数、发作的累积持续时间和平均持续时间，以及持续性心房颤动的发作次数。起搏过程中出现明显房室传导阻滞的发作，可反映起搏诱导的副交感神经兴奋状态（图3），提示相关的心房颤动为此现象的人工假象，而非模型本身的病理生理机制所致9。
<img alt="显示窦性心律与心房颤动波形对比的心电图示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp...

本实验方案描述了在使用经食管心房起搏评估小鼠心房颤动易感性时，优化实验参数的方法。

遗传性和获得性房颤（AF）危险因素的小鼠模型在研究房颤分子决定因素方面已被证明具有重要价值。

采用经食管心房起搏进行程序性电刺激，可测定小鼠的心电生理特性及其对心房颤动的易感性。本文介绍了一种标准化的方案制定流程，可优化实验的可重复性。经食管心房起搏通常为可存活手术，因而能够在同一动物个体中进行多次连续检测。开发实验方案的重要组成部分包括初步的参数研究，以优化所研究模型的实验条件，并识别由起搏诱导的副交感神经刺激所引起的心律失常。对于遗传模型，从小鼠八周龄开始，每两周进行一次心房起搏，以确定心房颤动（AF）易感性的最佳时期，同时需对两种性别的小鼠进行研究，因为其中一种性别可能不会表现出AF表型。对于获得性模型，则应在小鼠达到生理成熟后进行起搏操作。尽管通常在12周时达到成熟，但应根据实验模型的需要调整年龄。进行猝发和递减性起搏，以确定最佳起搏模式。每项操作之间至少间隔24小时。使用多种房颤易感性定义对数据进行分析。在后续针对其他小鼠的研究中，采用已优化的模型特异性参数及房颤易感性的定义。在足底反射消失后，将麻醉小鼠仰卧置于加热垫上，该加热垫用于维持小鼠体温在约 37 摄氏度，用胶带将后肢固定在垫面。通过将27号针式心电图电极经皮插入前肢，并连接至生物放大器和数据采集硬件，同时在后肢放置接地电极，获取体表心电图I导联信号。将一根连接至刺激器和刺激隔离器的2F八极电极导管插入食管，插入深度应接近从口腔至剑突上方的距离，操作时保持颈部伸展。使用分析软件开始连续记录 I 导联心电图，启动数据采集。将导管在食管内准确定位以实现信号捕获。具体操作为：采用略短于窦性周期长度的周长，以 1.5 毫安的刺激强度、2 毫秒的脉冲宽度进行刺激。仔细调整导管位置，直至获得稳定的心房夺获。为确定心房舒张期夺获阈值，以心房夺获所用的周期长度，从1.5毫安、脉宽2毫秒开始起搏。以每次0.05毫安的步长逐步降低刺激幅度，直至心房夺获消失，随后再逐步增加刺激幅度直至恢复夺获。获得尽可能低的起搏阈值，以最大限度减少意外的起搏诱导副交感神经刺激。将刺激幅度调整至阈值的两倍。在快速心房起搏诱发房颤之前，测量电生理参数，包括窦房结恢复时间、文氏周期长度以及房室有效不应期。根据初步研究结果，采用不同周长的猝发起搏或递减起搏方式，以两倍阈值强度和两毫秒脉宽进行起搏。对于猝发起搏，先以50毫秒周长起搏15秒，随后依次以40、30、25、20和15毫秒周长进行起搏序列。对于递减起搏，执行3至5个起搏序列，从40毫秒周长开始，每2秒减少2毫秒，直至终止于20毫秒。在最后一次起搏串刺激后出现窦性心律持续30秒，或出现持续10分钟的房颤（AF）时，以先发生者为准，终止操作。轻柔地移除导管和心电图电极。若需进行系列测试，重复起搏操作前应至少等待24小时。心电图记录可测量P波持续时间、PR间期、QRS持续时间以及QT和QTC间期。在快速心房起搏期间连续记录心电图，可记录研究中每次诱发的房颤事件。根据这些数据，记录房颤事件的累积持续时间、平均持续时间以及持续性房颤事件的次数。起搏过程中出现的过度房室传导阻滞提示存在起搏诱导的副交感神经刺激，表明任何相关的房颤均为该现象的假象，而非模型本身的病理生理机制所致。此现象是由于意外刺激了位于左心房后壁的神经节丛，导致副交感神经激活。此类心律失常诱导方式会增加对照组小鼠房颤的发生率，并导致实验组内心律失常的变异性增大。鉴于这些污染因素，在这些条件下发生心房颤动的动物应从分析中排除。采用此实验策略时，初期的预实验以及识别副交感神经刺激导致意外心房颤动诱导的现象，对于方案优化和研究可重复性尤为重要。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

优化经食管心房起搏以评估小鼠心房颤动易感性

程序性电刺激可用于评估心脏的传导特性，并通过不同的起搏方案诱导和终止心律失常。利用经静脉导管，在小鼠中实施程序性电刺激方案后，可获取心内电图记录，以识别致心律失常的基质。...

小鼠程序性电刺激

本文介绍了一种以高空间和时间分辨率对小鼠右心房特别是窦房结的电活动进行光学标测的实验方案。...

小鼠窦房结的高分辨率光学标测

本方案描述了利用具有高时间分辨率和空间分辨率的光学标测系统对小鼠心房进行电生理学评估的方法，包括通过特制电极导管进行程序化刺激，同步记录膜电位和Ca2+瞬变信号。...

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分析长期心电图记录以检测小鼠心律失常

本方案旨在介绍一种利用微电极阵列记录完整窦房结组织以测量内在心脏起搏频率的新方法，用于识别小鼠的起搏功能缺陷。该方法还可引入药理学试剂，以研究其对内在起搏活动的影响。...

利用微电极阵列记录窦房结放电频率以鉴定小鼠固有心脏起搏功能缺陷

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无菌性心包炎在亚琛迷你猪中作为心房心肌病和心房颤动模型的研究

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经食管心房猝发起搏诱导大鼠心房颤动

我们提出一种微创兔类长期心脏起搏模型，可用于临床前研究中的人工起搏及心力衰竭诱导。...

慢性心脏起搏的转化型兔模型

本方案描述了通过经食管起搏获取压力-容积关系的方法，该方法在评估心力衰竭小鼠模型舒张功能方面具有重要价值 。...

一种用于评估小鼠心力衰竭模型中心率依赖性舒张功能的起搏控制方法

右心衰竭（RHF）的特征是右侧心脏扩张和肥厚，导致心室和心房功能障碍。伴有RHF的 cardiopulmonary...

利用肺动脉束带术建立大鼠右心重构与心律失常模型

学习经食管心房起搏技术以评估小鼠心房颤动易感性。该方法支持同一动物重复测试，优化实验参数并识别副交感神经刺激引起的伪影，提高电生理研究结果的可重复性。

优化经食管心房起搏评估小鼠心房颤动易感性

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