小鼠肠道间充质的分离获得高产量的端细胞

我们分离肠间质的实验方案可获得高产量的端足细胞。该方法为研究端足细胞在稳态及疾病状态下所参与的细胞间相互作用提供了初步平台。端足细胞是一类独特的细胞，对现有的组织解离方案具有较高的敏感性。

因此，该技术的主要优势在于能够分离出间充质组织，其中包括富含的活性端足细胞。含有端足细胞的间充质可作为信号分子和生长因子的来源，支持体外有序生长所需的微环境。首先，将从小鼠体内分离出的肠道组织置于含有冰冷无菌PBS的培养皿中进行清洗。

将肠道置于培养皿中，使用圆头剪刀沿纵轴切开肠管，清洗出粪便内容物。随后将肠道转移至另一含有新鲜冷PBS的新培养皿中。

再清洗一次肠道后，将小肠切成1厘米长的片段，转移至含有8毫升PBS的15毫升锥形管中。手动振荡管子，每秒1至2个循环，持续1分钟。将溶液倒入培养皿中。

用镊子将组织段转移至含有20毫升溶液A的50毫升锥形管中。将锥形管置于37摄氏度的摇床培养箱中孵育20分钟。孵育结束后，用手剧烈振荡管子，每秒4到5个循环，持续1分钟，以解离上皮组织。重复此步骤一次。

按照先前演示的方法切割并清洗片段后，将其转移至一个装有10毫升无菌PBS的新50毫升离心管中，以每秒一到两个循环的速度倒置混匀1分钟。将溶液倒入培养皿中。将组织片段转移至另一个装有10毫升无菌PBS的新15毫升离心管中，以每秒一到两个循环的速度轻轻上下倾斜振荡2分钟。

在生物安全柜中，使用镊子将组织片段置于无菌实验纸巾上以使其干燥。待干燥后，进一步将组织片段切割成小块。使用镊子将切割后的组织块转移至六孔板中，每孔加入四毫升预热的消化液。

将培养板在37摄氏度下孵育50分钟，每20分钟手动轻轻振荡一次。然后，用巴斯德吸管将组织块转移至含有4毫升DMEM的15毫升锥形管中。手动振荡管子，每秒4至5个循环，持续1分钟，以获得单细胞悬液。

将悬浮液通过100微米滤网过滤至50毫升锥形管中。在4摄氏度下以700 ×g离心5分钟。用抽吸法弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5毫升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（2%FBS/PBS）中。

将悬液在700 g条件下再次离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于12毫升培养基中。最后将细胞悬液接种至6孔板中。在间充质解离后，端细胞失去其细胞特征，呈现圆形细胞形态，并且与后续几天相比，第1天观察到的GFP阳性细胞数量较少。

几天后，端足细胞表现出较小的、伸展的细胞形态，并具有较短的细胞突起。接种后七到十天，端足细胞恢复其细胞特征，呈现出较大、伸展的细胞形态以及较长的细胞质突起。流式细胞术用于分析细胞组成。

总体而言，基于 DAPI 染色，分离的细胞中存活率为 69%。其中，60.9% 为上皮污染细胞以及免疫细胞和内皮细胞。端细胞（telocyte）组分分别散落在 FSC 100k 以上和 SSC 70k 以上区域，约占门控间充质细胞的 10%。

FACS 分析显示，端细胞的一个亚群可通过 CD201 和 GP38 的阳性染色来定义。使用这些标志物对培养一天的间充质进行免疫染色，结果显示这些分子标志物有表达，尽管细胞尚未表现出典型的形态特征。该方法可获得具有活性的单细胞悬液，可用于二维培养，也可用于类器官三维共培养或生物打印等其他应用。