Name: 小鼠肠间充质分离导致端细胞高产量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: 学习小鼠肠道间充质分离技术，高效获取端细胞用于类器官共培养。该方法通过酶解消化和流式分选，可获得高活力端细胞，为研究肠道稳态与疾病中的细胞间相互作用提供可靠平台。

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本工作得到了以色列科学基金会（MSC个人资助）以及以色列科学基金会与中国国家自然科学基金委员会联合项目的资助。

以下所述所有操作程序均经耶路撒冷希伯来大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 试剂与缓冲液的准备
<ol>
	<li>将水浴锅预热至 37 °C。</li>
	<li>配制 表 1 中的所有溶液。</li>
</ol>
2. 肠道间充质的分离
<ol>
	<li>通过吸入 CO2 处死小鼠，随后立即进行颈椎脱位。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，用 70% 乙醇喷洒腹部。提起腹侧皮肤，沿中线纵向剪开，暴露腹膜腔（见图 1 I,II）。</li>
	<li>找到胃部，从食管处剪断，并缓慢将肠道拉出腹膜腔。用镊子清除多余的脂肪和结缔组织。将小肠从十二指肠起剪至距离盲肠约 0.5 cm 处（图 1 III,IV）。</li>
	<li>将肠道放入含有冷的无菌 PBS 的培养皿中清洗。使用圆头剪刀纵向剪开肠管，冲洗出粪便（图 1 V）。将肠道转移至另一含有新鲜冷 PBS 的培养皿中再次清洗。</li>
	<li>将小肠切成 1 cm 长的片段，转移至含有 8 mL PBS 的 15 mL 圆锥形离心管中。手动振荡离心管，频率为每秒 1–2 次，持续 1 分钟。</li>
	<li>用镊子将肠段转移至含有 20 mL 新鲜配制溶液 A 的 50 mL 圆锥形离心管中（见表 1）。将离心管置于 37 °C 的摇床培养箱中孵育 20 分钟。孵育后，用手剧烈振荡离心管，频率为每秒 4–5 次，持续 1 分钟，以解离上皮层。</li>
	<li>重复步骤 2.6 一次。</li>
	<li>用镊子将肠段转移至另一含有 10 mL 无菌 PBS 的 50 mL 离心管中，倒置离心管，以每秒 1–2 次的频率振荡 1 分钟。</li>
	<li>用镊子将肠段转移至另一含有 10 mL 无菌 PBS 的 15 mL 离心管中，轻轻倾斜上下振荡，频率为每秒 1–2 次，持续 2 分钟。</li>
	<li>在生物安全柜中，用镊子将肠段放置于无菌实验擦拭纸上使其干燥。干燥后，进一步将肠段切成 0.5 cm 的小段。</li>
	<li>用镊子将小肠片段转移至 6 孔板中，每孔加入 4 mL 预热的消化液。37 °C 孵育 50 分钟。每 20 分钟手动轻轻振荡培养板一次。</li>
	<li>用巴斯德吸管将肠段转移至含有 4 mL DMEM 的 15 mL 圆锥形离心管中。手动振荡离心管，频率为每秒 4–5 次，持续 1 分钟，以获得单细胞悬液。</li>
	<li>将悬液通过 100 µm 滤网过滤至 50 mL 圆锥形离心管中。在 4 °C 条件下，以 700 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>通过抽吸弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 5 mL 含 2% FBS 的 PBS 中。在 4 °C 条件下，以 700 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>通过抽吸弃去上清液，将细胞沉淀用 12 mL 培养基重悬，并每孔接种 1 mL 至两个 6 孔板中。次日，清洗并吸除死亡细胞，更换为新鲜培养基。 
	注意：为最佳维持培养状态，建议每 2 天更换一次培养基。根据小鼠品系、遗传背景和年龄的不同，成纤维细胞通常需要 4 天至 2 周时间才能准备好用于共培养实验。进行进一步共培养实验时，成纤维细胞应达到汇合状态，呈现扁平且充分伸展的细胞形态，如图 2 所示。通常，呈圆形形态的细胞不具备活力或功能。</li>
</ol>
<img alt="解剖过程示意图；小鼠解剖结构、肠道提取、实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：小鼠解剖。（I）将小鼠置于仰卧位，用70% EtOH喷洒腹部。提起腹侧皮肤。（II）沿腹中线纵向切开腹膜腔。（III）轻轻牵拉胃部的同时，切断食管。（IV）捏住胃部，缓慢将肠道拉出。（V）将圆头剪刀的尖端插入肠腔，纵向剪开肠管。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 传代或共培养的间充质细胞重悬
<ol>
	<li>在6孔板中，用2 mL 0.25%胰蛋白酶-0.5 mM EDTA重悬间充质细胞。37 °C孵育5分钟。孵育后，若仍有较多细胞未从培养皿脱落，可额外再孵育2分钟。</li>
	<li>使用细胞刮轻轻刮取孔板表面。将细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中。每孔加入2 mL DMEM-F12培养基，并轻轻吹打混匀。 
	注意：切勿使离心管中液体体积超过其总容量的50%。因此建议每两个孔使用一个15 mL离心管，其中盛放8 mL悬液。</li>
	<li>进行细胞计数。 
	注意：一个完全汇合的孔通常可获得2 × 106 至 2.5 × 106 个细胞。</li>
	<li>将细胞悬液稀释至接种密度为3–5 × 105 个细胞/mL。在4 °C条件下，以500 × g离心5分钟，小心吸除上清液。 
	注意：应尽可能彻底去除液体。</li>
	<li>用预热的培养基重悬细胞沉淀，并进行接种。</li>
</ol>
4. 通过流式细胞术分析纯化端细胞
<ol>
	<li>获取间充质细胞沉淀（步骤 2.14）。将细胞沉淀用 1 mL FACS 缓冲液重悬，并通过 40 µm 滤器过滤。</li>
	<li>将细胞悬液与别藻青蛋白（APC）标记的 CD326（1:100）、CD45（1:400）和 CD31（1:250）抗体在 400 µL FACS 缓冲液中混合，室温孵育 15 分钟，以分别排除上皮细胞、免疫细胞和内皮细胞。</li>
	<li>加入 1 mL FACS 缓冲液洗涤细胞，于 4 °C 下以 700 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于 400 µL FACS 缓冲液中，并加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，5 mg/mL，1:1,000）用于流式细胞术分析。根据 SSC-高度对 SSC-面积设门，圈选单细胞；根据 DAPI− 染色圈选活细胞，并排除 CD45+/CD31+/CD326+ 细胞，以分选 GFP+ 捕索细胞，如图 3所示。</li>
</ol>

<ol><li>Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., Näthke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+intestinal+stem+cells+reside+in+an+unlicensed+G1+phase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase.</a> The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).</li>
<li>Kinchen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+remodeling+of+the+human+colonic+mesenchyme+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease.</a> Cell. 175 (2), 372-386 (2018).</li>
<li>Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TELOCYTES+-+a+case+of+serendipity%3A+The+winding+way+from+Interstitial+Cells+of+Cajal+%28ICC%29%2C+via+Interstitial+Cajal-Like+Cells+%28ICLC%29+to+TELOCYTES%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).</li>
<li>Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telocytes+in+endocardium%3A+electron+microscope+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Telocytes in endocardium: electron microscope evidence.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).</li>
<li>Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telocytes+in+human+skin%E2%80%94are+they+involved+in+skin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Telocytes in human skin—are they involved in skin regeneration.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).</li>
<li>Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telocytes+in+pleura%3A+two-+and+three-dimensional+imaging+by+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy.</a> Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).</li>
<li>Popescu, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telocytes+in+human+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Telocytes in human epicardium.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).</li>
<li>Shoshkes-Carmel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subepithelial+telocytes+are+an+important+source+of+Wnts+that+supports+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts.</a> Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%E2%80%99s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Vonk, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+application%2C+standardization+and+validation+of+the+forskolin-induced+swelling+assay+in+cystic+fibrosis+human+colon+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids.</a> STAR Protocols. 1 (1), 100019(2020).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP3K2-regulated+intestinal+stromal+cells+define+a+distinct+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche.</a> Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).</li>
<li>Bahar Halpern, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%2B+are+a+signaling+source+at+the+intestinal+villus+tip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip.</a> Nature Communication. 11 (1), 1936(2020).</li>
<li>Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells+in+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells in colon cancer.</a> Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究建立了一种利用FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG小鼠模型从小鼠小肠中分离间质组织的实验方案，该模型可使研究人员区分特络细胞与其他间质细胞。本方案中包含若干关键步骤。首先，在分离间质组织过程中，必须以每秒四到五次的频率剧烈振荡离心管，以去除大部分上皮细胞。酶消化的孵育时间应根据消化效率进行优化。孵育期间，每20分钟需将培养板水平轻轻振荡数秒。一旦组织呈现丝状，应立即停止孵育，并进入方案第2.12步。组织消化时间过长可能导致细胞活力和得率降低。酶消化完成后，必须对离心管进行机械振荡，以释放更多单细胞进入悬液；理想状态下，溶液应呈浑浊状，且无可见组织碎片。若未达到此状态，可将酶消化时间延长至60分钟。
保持无菌条件并避免潜在的细菌污染是在进行原代组织培养时的关键步骤之一。必须使用无菌的解剖器械、试剂和缓冲液；在完成动物操作后，必须更换手套并清洁工作区域。一旦获得细胞悬液，操作应在层流生物安全柜中进行。接种后，细胞应静置培养过夜，避免任何干扰，因为扰动可能影响细胞贴壁。此外，接种后一天更换培养基非常重要，因为未贴壁的细胞可能影响培养物的存活率。
本方案中使用的表面标志物与其表位结合反应强烈；然而，酶消化可能影响其结合活性，从而影响流式细胞术（FACS）分析结果。本方案的另一个局限性在于肌层细胞的代表性不足。为提高肌层细胞分离的效率，我们建议通过机械方法将肌肉层与黏膜层分离，并对各层分别进行酶消化。对于上皮与间质的分离，可采用机械分离或螯合剂（如EDTA或DTT）处理；但本方案已针对获得单细胞悬液的酶消化步骤进行了优化。
此前已有描述分离肠道间质的方法8；使用盖玻片刮除绒毛会导致部分间质细胞随绒毛丢失，尤其是绒毛顶端的间质细胞，例如 Lgr5+ 绒毛顶端端细胞13。在本方案中，我们采用胶原酶VIII型，而非dispase II与胰蛋白酶联合DNase I，因为胶原酶能更有效地将间质细胞从基质中释放出来。尽管该方法延长了处理时间（&#62;90 分钟 vs. 35 分钟），但两种方案获得的细胞活力相似；本方案总体上提高了间质细胞的得率，尤其是端细胞组分的得率。本方案获得的细胞中约有10%为GFP+端细胞，通过显微观察和FACS分析均得到了证实，而早期方案仅获得2%的GFP+端细胞。当前方案与两个参考方案之间的主要差异列于补充表S1中。
FOXL1 的鉴定+GFP+ 基于亚上皮端细胞作为间质细胞的特征 体内 研究。为了获得更高产量的端细胞，需要开发和改进现有的间充质分离方案，而实现这一目标的方法基于我们对FOXL1结构与功能的理解+ 端粒细胞 体内，为体积较大的细胞，具有较长的细胞突起，紧密附着于上皮细胞。
有趣的是， 离体 GFP+ 端粒细胞表现出与其特征相似的细胞特性 体内 在肠道中，因此被认为可作为类器官生长的理想支持细胞。尽管本实验方案主要讨论从小肠中分离端足细胞，但经过少量修改后，类似的方案也可轻松应用于结肠间充质细胞，例如近期报道的受MAP3K2调控的肠道基质细胞（MRISC）。12.
一旦间充质细胞伸展并达到汇合状态，便可用于多种其他应用，例如使用无生长因子的Matrigel与小鼠或人源类器官进行3D共培养。间充质通常会形成一个完整的网络，能够支持类器官的形成和生长，无需外源性生长因子的补充。肠基质具有固有的3D特性，可为上皮提供机械支持14。因此，本方案也可用于分离间充质，将其整合到3D生物打印支架中，并用于进一步的异种移植实验。

小肠和结肠都是高度再生的组织，这得益于干细胞的存在，这些干细胞能够增殖并促进组织再生1。上皮周围存在的间质通过分泌细胞外基质蛋白和信号分子，为上皮提供结构和功能支持2，从而调节上皮细胞的反应。端足细胞（telocytes）是一类体积较大的间质细胞，目前主要通过电子显微镜描述为具有细长胞质突起（称为端足，telopodes）的细胞，这些突起相互交错，形成迷路样网络结构3,4,5,6,7。最近研究发现，表达转录因子FOXL1的肠道端足细胞是干细胞微环境的重要组成部分，能够提供Wnt蛋白，而Wnt蛋白对干细胞和前体细胞的功能至关重要。肠道端足细胞高表达多种关键信号通路蛋白，如Wnt、Bmp、Tgfb和Shh，以及多种生长因子8。
鉴于端粒细胞是干细胞微环境的关键组分 体内，开发分离和培养它们的方案 离体 将使其可作为信号分子和生长因子的来源，以支持细胞的生长与分化 离体采用成熟的实验方案，可分离结肠或肠道上皮隐窝，并形成称为类器官的三维结构9,10,11三维类器官是研究肠上皮生理学和病理学的有力工具 离体. 在一个 离体 系统，类器官依赖外源性添加的因子以维持存活和生长10分离的间充质可与小鼠和人源类器官共培养，并作为生长因子的来源，替代外源性添加，从而更真实地反映原始组织中的情况。研究端细胞 离体 在深入研究正常或病理条件下的细胞行为、组织稳态机制以及细胞间相互作用方面具有诸多优势。
尽管已有描述如何从小鼠肠道中分离间质组织的实验方案，但这些方法是否能够高效分离出端细胞尚不明确。成功分离端细胞需要对实验方案进行特殊优化，以解离端细胞与其邻近细胞之间牢固的细胞间连接，同时不损害其活性。为克服这些局限性，本文提出了一种经过改进的实验方案，可稳定获得高活性的单细胞悬液，其中含有相对较高数量的端细胞，且其抗原性和功能特性得到充分保留。这些端细胞可用于多种应用，包括与小鼠或人源类器官共培养，以在无需添加生长因子的情况下支持类器官生长，从而更真实地模拟原始组织中的生理状况。
我们采用了FOXL1-Cre: Rosa-mTmG小鼠模型8，其中端细胞（telocytes）被标记为绿色的膜结合型绿色荧光蛋白（GFP），使研究者能够完整地追踪端细胞；其他所有间充质细胞则被标记为红色的膜结合型tdTomato。本实验方案是在分离肠间充质细胞的原有方案12基础上改进而来，旨在提高端细胞的得率和存活率。

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞滤网盖</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>6 孔细胞培养板</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD31</td><td>Biolegend</td><td>102509</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD326</td><td>Biolegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD45</td><td>Biolegend</td><td>103111</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>100&amp;mu;m 尼龙黄色细胞滤网</td><td>Corning</td><td>CLS431752</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 VIII 型</td><td>Sigma</td><td>C2139-500MG</td><td></td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (HAM) 1:1</td><td>Biological Industries</td><td>01-170-1A</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Biological Industries</td><td>01-055-1A</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>D1283-500ML</td><td>10x</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M，pH 8.0</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1B</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma</td><td>G1914-250MG</td><td>100x</td></tr><tr><td>Gluta Max-I</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td>100x</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Biological Industries</td><td>02-017-5A</td><td>10x</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100x</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen/Strep）</td><td>Biological Industries</td><td>03-033-1B</td><td>100x</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA 溶液 B</td><td>Sartorius</td><td>03-052-1A</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠肠道间充质的分离获得高产量的端细胞

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

小鼠的小肠或结肠间质具有高度异质性，包含多种不同的细胞类型，如血管和淋巴内皮细胞、神经、成纤维细胞、肌成纤维细胞、平滑肌细胞、免疫细胞，以及最近鉴定出的细胞类型——端足细胞（telocytes）。端足细胞是一类独特的间充质细胞，具有细长的胞质突起，可从细胞体延伸数十至数百微米的距离。近期研究发现，端足细胞是肠道干细胞微环境的重要组成部分，能够提供对干细胞和前体细胞增殖至关重要的Wnt蛋白。
尽管已有从小鼠肠道分离间质组织的实验方案，但尚不清楚这些方法是否能够有效分离出端足细胞。要高效分离端足细胞，需要对实验方案进行特殊优化，以解离端足细胞与其邻近细胞之间牢固的细胞连接，同时保持细胞活性。本文对现有的肠道间质组织分离方案进行了优化，从而成功实现了含有较高比例活单个端足细胞的间质组织的分离与培养。
所获得的单细胞悬液可通过多种技术进行分析，例如免疫染色、细胞分选、成像以及mRNA实验。该方案可获得间充质细胞，其端细胞的抗原性和功能特性得到充分保留，可用于多种应用。例如，这些细胞可与小鼠或人源类器官共培养，以在无需添加生长因子的情况下支持类器官生长，从而更真实地模拟原始组织中的情况。

上述肠道间充质细胞分离方案改编自 Wu 等人12 和 Shoshkes-Carmel 等人8 所描述的方案。Wu 等人描述的方案适用于结肠，而 Shoshkes-Carmel 等人的方案适用于小肠，因此两种方案在消化酶组合、工作浓度和孵育时间上有所不同。本文所述方案已成功用于分离和培养包括端细胞（telocytes）在内的肠道间充质细胞。简言之，我们使用 FOXL1-Cre: Rosa-mTmG 小鼠模型8，从小肠十二指肠至回肠进行解剖，其中端细胞标记为膜定位 GFP（绿色），其他间充质细胞标记为膜定位 tdTomato（红色）。我们使用消化酶对组织进行解离，并将间充质细胞接种于 6 孔板中。解离后，端细胞失去其细胞特征，呈现圆形细胞形态（图 2A），这反映在第 1 天 GFP+ 细胞数量较后续几天偏低（图 2F）。数天后，端细胞呈现具有短细胞突起的小而伸展的细胞形态（图 2B、C）。然而，在接种后 7–10 天，端细胞恢复其细胞特征，呈现具有长细胞质突起的大而伸展的细胞形态（图 2D、E），此时可用于类器官共培养并支持其生长。
<img alt="随时间变化的细胞培养物免疫荧光显微镜图像及GFP表达分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：从FOXL1Cre: Rosa-mTmG小鼠肠道分离的培养间充质细胞。 FOXL1+ 间质细胞以GFP标记，而其他间充质细胞为tdTomato+。(A-E) 采用本实验方案分离并接种于6孔板中的培养间充质细胞的代表性图像，分别在培养第1天(A)、第4天(B,C)和第7天(D,E)进行成像。比例尺 = 100 µm。(F) 培养第1、4、7天每视野中GFP/tdTomato阳性细胞比例的定量分析（百分比）。缩写：FOXL1 = Forkhead box L1蛋白；GFP = green fluorescent protein。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
为了评估该分离方案并揭示细胞组成，我们通过流式细胞术对获得的细胞悬液进行了分析（图3）。总体而言，基于DAPI染色，分离细胞中约69%具有活性（图3 III）；在活细胞中，60.9%为上皮细胞污染以及免疫细胞和内皮细胞（CD326+、CD45+ 和 CD31+；图3 IV）。端细胞组分（GFP+）在FSC和SSC上分别分布在100k和70k以上区域（图3 VI），占门控间充质细胞（活的CD45-、CD326-、CD31-）的近10%（图3 V）。
<img alt="流式细胞术示意图；细胞分选过程；SSC-A 与 FSC-A 图谱；GFP 和 DAPI 分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 3"> 
图 3：从分离的成年小鼠肠间质中分选端细胞的流式细胞术设门策略。 （I）排除低水平侧向散射事件。（II）根据侧向散射高度对侧向散射面积进行单细胞设门。（III）排除 DAPI+ 事件以去除死细胞。（IV）排除 DAPI- CD45+/CD326+/CD31+ 事件，以分别去除免疫细胞、上皮细胞和内皮细胞。（V）GFP+ 端细胞占 DAPI- CD45-/CD326-/CD31- 细胞的 10.3%。（VI）反向设门分析揭示了 GFP+ 端细胞在 FSC-A/SSC-A 图谱中的位置。缩写：SSC-A = 侧向散射峰值面积；FSC-A = 前向散射峰值面积；SSC-H = 侧向散射峰值高度；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GFP = 绿色荧光蛋白；APC = 别藻蓝蛋白。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
同时，我们还从野生型（WT）C57Bl6小鼠肠道中分离出间充质细胞，通过使用先前在FOXL1Cre: Rosa-mTmG小鼠模型中分离的间充质细胞上分析过的表面标志物组合，对该模型中特异标记为GFP的端细胞组分进行评估。我们发现，端细胞的一个亚群可通过CD201和podoplanin（GP38）的阳性染色来定义（图4）。此外，在分离后1天进行免疫染色培养时使用这些标志物证实，尽管这些细胞尚未表现出其典型的细胞形态特征，但已开始表达这些分子标志物，在70%–80%的GFP+端细胞中可见染色信号（图5）。
通过表面标志物定义的端粒细胞组分与使用FOXL1驱动报告小鼠获得的组分并不完全一致；端粒细胞具有高度异质性，并包含多个亚群。因此，有必要将表面标志物与FOXL1标记相结合，以准确定义端粒细胞。在FOXL1Cre: Rosa-mTmG小鼠的小肠中，60%–70%的GFP+细胞为CD201阳性，65%–80%为GP38阳性。使用表面标志物时需注意，抗体保存不当或反复冻融会降低其结合效率。此外，酶消化可能破坏表面标志物的表达。我们观察到，在组织解离过程中，表达于间质细胞上的跨膜蛋白聚糖CD138的表达受到破坏，且显著减少。
<img alt="显示细胞门控、GFP和Tomato阳性群体分析的流式细胞术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：采用本方案分离自FOXL1Cre: Rosa-mTmG小鼠小肠的单细胞间充质悬液的FACS分析。 对（I-II）单细胞、（III）DAPI-、（IV-VI）Lin-（CD45-、CD326-、CD31-）GFP+细胞进行FACS分析，结果显示（VII）65.3%的GFP+细胞和31.2%的Tomato+细胞GP38呈阳性，而（VIII）60.5%的GFP+细胞和22.6%的Tomato+细胞CD201呈阳性。缩写：SSC-A = 侧向散射-峰面积；FSC-A = 前向散射-峰面积；SSC-H = 侧向散射-峰高；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；GFP = 绿色荧光蛋白；APC = 别藻蓝蛋白；PE = 藻红蛋白。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像显示GFP、Tomato、GP38、CD201，附视野图用于分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64169/64169fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图5"> 
图5第1天培养的间充质细胞，经固定后用间充质标记物染色。 (A-D) 培养的间充质细胞经 GP38 染色后的代表性图像。F-I) CD201 染色的培养间充质细胞代表性图像。比例尺 = 100 µm. (E番茄的定量分析+ GP38+ 和番茄+ CD201+ 双阳性占总Tomato阳性细胞的比例+. (J) GFP 定量分析+ GP38+ 和 GFP+ CD201+ 双阳性占总GFP的比例+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>溶液 A：</td>
			<td colspan="4">HBSS 添加 2% FBS、1 mM DL-二硫苏糖醇（DTT）、2 mM EDTA（pH 8.0）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>补充型 1640 培养基（CM1640）：</td>
			<td colspan="4">RPMI 1640 培养基添加 10% FBS、青霉素/链霉素（100 单位青霉素/mL，100 µg 链霉素/mL）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>消化液：</td>
			<td colspan="4">在 4 mL 预热的 CM1640 中加入 100 U/mL VIII 型胶原酶和 75 mg/mL DNase I。注意：在开始消化步骤前立即加入胶原酶和 DNase I。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>培养基：</td>
			<td colspan="4">DMEM-F12 培养基添加 10 µg/mL 庆大霉素、10 mM HEPES、谷氨酰胺、青霉素/链霉素（100 单位青霉素/mL，100 µg 链霉素/mL）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS 缓冲液：</td>
			<td colspan="4">PBS 添加 5% FBS 和 1 mM EDTA。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：本实验方案中所用所有溶液的组成。
补充表 S1：此处列出了当前方案与两个参考方案之间的主要差异。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64169/64169_Supp%20Table%20S1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文介绍了一种分离小鼠肠道间充质组织（包括端足细胞）的实验方案。分离得到的细胞可用于多种实验应用，例如与小鼠或人源类器官进行共培养，以支持类器官生长并更真实地模拟原始组织中的微环境。

小鼠小肠或结肠间质具有高度异质性，包含多种不同的细胞类型，如血管和淋巴管内皮细胞、神经等。

我们分离肠间质的实验方案可获得高产量的端足细胞。该方法为研究端足细胞在稳态及疾病状态下所参与的细胞间相互作用提供了初步平台。端足细胞是一类独特的细胞，对现有的组织解离方案具有较高的敏感性。因此，该技术的主要优势在于能够分离出间充质组织，其中包括富含的活性端足细胞。含有端足细胞的间充质可作为信号分子和生长因子的来源，支持体外有序生长所需的微环境。首先，将从小鼠体内分离出的肠道组织置于含有冰冷无菌PBS的培养皿中进行清洗。将肠道置于培养皿中，使用圆头剪刀沿纵轴切开肠管，清洗出粪便内容物。随后将肠道转移至另一含有新鲜冷PBS的新培养皿中。再清洗一次肠道后，将小肠切成1厘米长的片段，转移至含有8毫升PBS的15毫升锥形管中。手动振荡管子，每秒1至2个循环，持续1分钟。将溶液倒入培养皿中。用镊子将组织段转移至含有20毫升溶液A的50毫升锥形管中。将锥形管置于37摄氏度的摇床培养箱中孵育20分钟。孵育结束后，用手剧烈振荡管子，每秒4到5个循环，持续1分钟，以解离上皮组织。重复此步骤一次。按照先前演示的方法切割并清洗片段后，将其转移至一个装有10毫升无菌PBS的新50毫升离心管中，以每秒一到两个循环的速度倒置混匀1分钟。将溶液倒入培养皿中。将组织片段转移至另一个装有10毫升无菌PBS的新15毫升离心管中，以每秒一到两个循环的速度轻轻上下倾斜振荡2分钟。在生物安全柜中，使用镊子将组织片段置于无菌实验纸巾上以使其干燥。待干燥后，进一步将组织片段切割成小块。使用镊子将切割后的组织块转移至六孔板中，每孔加入四毫升预热的消化液。将培养板在37摄氏度下孵育50分钟，每20分钟手动轻轻振荡一次。然后，用巴斯德吸管将组织块转移至含有4毫升DMEM的15毫升锥形管中。手动振荡管子，每秒4至5个循环，持续1分钟，以获得单细胞悬液。将悬浮液通过100微米滤网过滤至50毫升锥形管中。在4摄氏度下以700 ×g离心5分钟。用抽吸法弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于5毫升含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（2%FBS/PBS）中。将悬液在700 g条件下再次离心5分钟，弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于12毫升培养基中。最后将细胞悬液接种至6孔板中。在间充质解离后，端细胞失去其细胞特征，呈现圆形细胞形态，并且与后续几天相比，第1天观察到的GFP阳性细胞数量较少。几天后，端足细胞表现出较小的、伸展的细胞形态，并具有较短的细胞突起。接种后七到十天，端足细胞恢复其细胞特征，呈现出较大、伸展的细胞形态以及较长的细胞质突起。流式细胞术用于分析细胞组成。总体而言，基于 DAPI 染色，分离的细胞中存活率为 69%。其中，60.9% 为上皮污染细胞以及免疫细胞和内皮细胞。端细胞（telocyte）组分分别散落在 FSC 100k 以上和 SSC 70k 以上区域，约占门控间充质细胞的 10%。FACS 分析显示，端细胞的一个亚群可通过 CD201 和 GP38 的阳性染色来定义。使用这些标志物对培养一天的间充质进行免疫染色，结果显示这些分子标志物有表达，尽管细胞尚未表现出典型的形态特征。该方法可获得具有活性的单细胞悬液，可用于二维培养，也可用于类器官三维共培养或生物打印等其他应用。

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