Name: 工业化、人工智能引导的激光显微切割，用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: 了解人工智能引导的激光显微切割技术，用于肿瘤微环境微尺度蛋白质组学分析。该方法通过AI图像分割减少操作差异，提高组织处理效率，适用于病理学研究中的特定细胞群富集。

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本项目部分资金由国防健康计划（HU0001-16-2-0006 和 HU0001-16-2-00014）提供给统一服务大学妇科癌症卓越中心。资助方在研究的设计、实施、结果解读或论文撰写过程中未发挥任何作用。免责声明：本文表达的观点仅为作者个人观点，不代表美国陆军/海军/空军部、国防部或美国政府的官方政策。

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T.P.C. 是赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific, Inc）科学顾问委员会成员，并获得艾伯维公司（AbbVie）的研究资助。

尽管已有大量研究致力于开发和/或优化从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和/或新鲜冷冻组织中富集目标细胞亚群的工作流程，以及在处理过程中维持样本质量的方法9,12,13,14,15，但仍迫切需要开发自动化策略，以制备用于分子分析的临床组织样本，从而降低变异性和提高可重复性。本工作流程描述了一种标准化的半自动化方案，该方案整合了现有的图像分析软件工具（见材料表），可从临床组织样本中通过激光显微切割（LMD）实现组织学分辨下的特定细胞群体的分离获取。
通过激光显微切割（LMD）对捕获特定细胞群体的感兴趣区域（ROI）进行空间分辨的富集，是多组学分析前的一项新一代组织处理步骤，可提升分子特征的表征与鉴定能力，并促进细胞选择性生物标志物的发现。本方案改进了现有方法，减少了组织切片因由组织学家手动分割ROI而长时间暴露于环境中的情况（在LMD收集前此类操作通常耗时&#62;1–2小时）。该工作流程改由人工智能引导的分类与分割预先确定ROI。缩短组织在环境中的停留时间，将降低对高度不稳定的分子靶标（如磷酸化肽段和mRNA）检测时的非特异性变异，也有利于依赖靶蛋白保持天然构象才能检测的基于抗体的分析技术。
将清晰可见的整齐校准标记切割到PEN膜载玻片上，使其在扫描的载玻片图像中清晰可辨，是实现图像分析软件整合的关键步骤之一（参见 材料表)与LMD工作流程相结合。确保校准品具有精确的（&#34;清洁&#34;）位于底部的点 &#34;V&#34; 形状可用于在图像分析软件中选择一个精确的点，以便从中绘制校准线，具体操作如步骤 5.1.6 和 5.2.13 所述。在导入 LMD 软件时，这些点的对齐对于正确叠加注释至关重要（通过生成兼容的 .xml 文件来实现） &#34;锤子&#34; 和/或 &#34;Dapọ" 算法）应用到物理 LMD 载玻片上相应的组织 ROI 区域。必须突出显示所有形状，并进行整体 &#34;拖放&#34; 即使在导入LMD软件时对齐精确，也需将其固定到位，以记录载玻片在激光显微切割仪上的垂直（z平面）位置。如有需要，此步骤中也可对组织ROI上标注的位置进行微调。
当前版本的 Malleator 算法存在一个局限性，即其与图像分析软件提供的预定义注释形状工具不兼容（参见材料表），尽管未来对该算法的更新版本将致力于改善此兼容性问题。使用这些工具绘制的形状所生成的 .annotation 文件中，每个注释仅包含两组配对的 x 和 y 坐标，缺乏围绕这些点的完整空间方位信息。目前使用这些工具会导致在导入过程中注释被转换为仅由两个点定义的直线。为成功转换为 XML 格式并导入 LMD，必须手动定义组织 ROI 片段。这可以通过针对目标区域使用单独的手绘多边形注释逐一手动定义每个 ROI 来实现；或者，如有需要，也可在整个组织 ROI 片段上应用近似的圆形或矩形注释，这两种方式均适用于本工作流程。
尽管本文展示的工作流程是针对新鲜冷冻的人类癌症组织样本的蛋白质组学分析，但这种由人工智能驱动的激光显微切割（LMD）工作流程同样适用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、非癌性组织类型以及非人类来源的组织。该工作流程还可支持其他下游分子分析流程，包括转录组学、基因组学或磷酸化蛋白质组学分析。此工作流程亦可利用图像分析软件的其他功能（参见材料表），例如细胞计数或其他分析模块，包括&#34;Multiplex IHC&#34;模块或&#34;Tissue Microarray (TMA) Add-on&#34;。未来对该工作流程的应用还可通过预先定义每个感兴趣区域（ROI）片段中的细胞数量，以确保多次采集之间的细胞输入量一致；或通过其他方法定义感兴趣的细胞ROI，例如免疫组织化学或细胞社会学方法。

肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，包含多种多样的细胞类型，如肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞、内皮细胞、其他间充质细胞类型以及脂肪细胞，同时还包含复杂的细胞外基质1。该细胞生态系统在不同疾病器官部位内部及之间均存在差异，导致肿瘤异质性复杂化2,3。近期研究表明，具有高度异质性或肿瘤细胞含量较低（低纯度）的肿瘤通常与较差的疾病预后相关2,3。
为了在大规模上理解肿瘤微环境（TME）中肿瘤细胞与非肿瘤细胞群体之间的分子相互作用，需要标准化且高通量的策略，以选择性地分离出特定的细胞群体，用于后续的多组学分析。定量蛋白质组学是一种快速发展的、日益重要的技术，有助于进一步揭示癌症生物学机制。迄今为止，大多数采用蛋白质组学的研究均基于从完整肿瘤组织样本（如冷冻粉碎组织）中提取的蛋白质，导致对TME中蛋白质组水平异质性的理解仍然十分有限4,5,6。
开发能够无缝整合并利用临床病理工作流程信息的样本采集策略，将推动新一代组织学解析蛋白质组学的发展，这类蛋白质组学与作为金标准的诊断病理工作流程高度互补。激光显微切割（LMD）技术可通过显微镜对组织学染色的薄切片进行观察，直接且选择性地采集特定的细胞亚群或感兴趣区域（ROIs）7。近年来，数字病理学和人工智能辅助分析取得了重大进展，已证明能够以自动化方式识别肿瘤微环境（TME）中独特的组分特征和感兴趣区域，其中许多特征与分子改变及临床疾病特征（如治疗耐药性和疾病预后）相关8。
本方案所述的工作流程利用商业软件在数字组织病理学图像中选择性地标注肿瘤感兴趣区域（ROI），并采用自主研发的软件工具将这些肿瘤ROI转移至激光显微切割系统，以自动采集特定的细胞群体，且可无缝衔接下游的多组学分析流程。该整合策略显著减少了激光显微切割操作人员的工作时间，并最大限度缩短了组织在常温环境下的暴露时长。通过针对两种代表性上皮性卵巢癌组织学亚型——高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和卵巢透明细胞癌（OCCC）——的肿瘤微环境（TME）进行差异分析，验证了自动化特征筛选与激光显微切割采集联合高通量定量蛋白质组学技术的整合应用。

<table><tbody><tr><td>1260 Infinity II 系统</td><td>安捷伦科技公司</td><td></td><td>离线液相色谱系统</td></tr><tr><td>96个微型胶囊（150 μL）散装</td><td>Pressure Biosciences Inc</td><td>MC150-96</td><td></td></tr><tr><td>96个微型研磨杵（散装）</td><td>Pressure Biosciences Inc</td><td>MP-96</td><td></td></tr><tr><td>96 根微型管（无管盖），散装</td><td>Pressure Biosciences Inc</td><td>MT-96</td><td></td></tr><tr><td>9mm MS 认证透明螺纹套件</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-060-058</td><td>用于离线液相色谱分离和质谱分析的样品瓶</td></tr><tr><td>乙腈，Optima LC/MS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>A995-4</td><td>流动相溶剂</td></tr><tr><td>Aperio AT2</td><td>Leica Microsystems</td><td>23AT2100</td><td>切片扫描仪</td></tr><tr><td>Axygen&amp;nbsp;0.5 mL 平盖 PCR 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-292</td><td>样品管；尺寸适配PCT管和PCR仪</td></tr><tr><td>Barocycler 2320EXT</td><td>Pressure Biosciences Inc</td><td>2320-EXT</td><td>Barocycler</td></tr><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>P123225</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete，Mini，无EDTA蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Easy-nLC 1200</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>液相色谱法&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>EasyPep Maxi 样品制备试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>NCI5734</td><td>标记后样品纯化柱</td></tr><tr><td>EASY-SPRAY C18 2 μm 50 cm × 75</td><td>Fisher Scientific</td><td>ES903</td><td>分析柱</td></tr><tr><td>伊红Y水溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HT110216</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，99+%</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>28905</td><td>流动相添加剂</td></tr><tr><td>ggplot2 版本 3.3.5</td><td>CRAN</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/ggplot2/</td><td></td></tr><tr><td>HALO</td><td>Indica Labs</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>空闲&amp;nbsp;（集成开发与学习环境）</td><td>Python 软件基金会</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iheatmapr 版本 0.5.1</td><td>CRAN</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/iheatmapr/</td><td></td></tr><tr><td>iRT 试剂盒</td><td>Biognosys</td><td>Ki-3002-1</td><td>LC-MS 质量控制标准</td></tr><tr><td>limma 版本 3.42.2</td><td>Bioconductor</td><td>https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html</td><td></td></tr><tr><td>LMD 扫描台 Ultra LMT350</td><td>徕卡显微系统</td><td>11888453</td><td>配备PCT管架的LMD载物台型号</td></tr><tr><td>LMD7（软件版本 8.2.3.7603）</td><td>徕卡显微系统</td><td></td><td>LMD装置（显微镜、激光器、相机、PC、平板电脑）</td></tr><tr><td>Mascot Server</td><td>矩阵科学</td><td></td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>质谱兼容的人源蛋白提取物与消化</td><td>Promega</td><td>V6951</td><td>LC-MS 质量控制标准</td></tr><tr><td>迈耶&amp;rsquo;苏木精溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MHS32</td><td></td></tr><tr><td>PEN膜玻片</td><td>Leica Microsystems</td><td>11532918</td><td></td></tr><tr><td>多肽保留时间校准混合物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88321</td><td>LC-MS 质量控制标准</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂混合物3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0044</td><td></td></tr><tr><td>Pierce LTQ Velos ESI 正离子校准溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88323</td><td>仪器校准溶液</td></tr><tr><td>PM100 C18 3UM 75UMX20MM NV 2PK</td><td>Fisher Scientific</td><td>164535</td><td>柱前</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>OPTON-31040</td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>Python</td><td>Python 软件基金会</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF-X</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>质谱仪</td></tr><tr><td>R 版本 3.6.0</td><td>CRAN</td><td>https://cran-archive.r-project.org/bin/windows/base/old/2.6.2/</td><td></td></tr><tr><td>RColorBrewer 版本 1.1-2</td><td>CRAN</td><td>https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/</td><td></td></tr><tr><td>可溶性智能消化试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3251711</td><td>消化试剂</td></tr><tr><td>TMTpro 16重标记试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A44520</td><td>等压TMT标记试剂</td></tr><tr><td>Veriti 60孔热循环仪</td><td>应用生物系统公司</td><td>4384638</td><td>PCR仪</td></tr><tr><td>水，Optima LC/MS 级</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td>流动相溶剂</td></tr><tr><td>ZORBAX Extend 300 C18，2.1 × 12.5 mm，5 &amp;micro;m，保护柱（ZGC）</td><td>安捷伦科技公司</td><td>821125-932</td><td>离线液相色谱捕获柱</td></tr><tr><td>ZORBAX Extend 300 C18，2.1 × 150 mm，3.5 &amp;micro;m</td><td>安捷伦科技公司</td><td>763750-902</td><td>离线液相色谱分析柱</td></tr></tbody></table>

工业化的、人工智能引导的激光显微切割技术用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

Industrialized, Artificial Intelligence-guided Laser Microdissection for Microscaled Proteomic Analysis of the Tumor Microenvironment

肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，包含数十种不同的细胞类型，包括肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞群体。为了在大规模条件下表征蛋白质组水平的变异性和肿瘤异质性，需要高通量方法以选择性地分离实体瘤恶性组织中的特定细胞群体。本实验方案描述了一种由人工智能（AI）驱动的高通量工作流程，该流程可将苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色的薄组织切片图像分割为经病理学确认的兴趣区域，进而通过激光显微切割（LMD）技术选择性获取组织学分辨率下的特定细胞群体。该策略包含一种新型算法，能够将使用数字图像软件标注的、代表目标细胞群体的区域直接转移至激光显微镜，从而实现更便捷的样本采集。该工作流程已成功实施，证明了该标准化方法在从TME中选择性获取肿瘤细胞群体用于高分辨率质谱进行定量、多重蛋白质组学分析方面的实用性。该策略可完全整合到常规组织病理学评估中，利用数字图像分析支持目标细胞群体的富集，且具有完全通用性，可实现从TME中标准化获取细胞群体用于多组学分析。

采用本研究整合的人工智能驱动组织感兴趣区域（ROI）识别、分割、激光显微切割（LMD）及定量蛋白质组学分析流程，对两名高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和两名卵巢透明细胞癌（OCCC）患者的冰冻新鲜组织薄切片进行了分析（图1）。每例肿瘤的代表性苏木精-伊红（H&amp;E）染色组织切片均由经认证的病理学专家进行评估，肿瘤细胞含量介于70%至99%之间。将组织薄切片转移至聚萘膜（PEN膜）载玻片上（补充文件2），并使用校准标记物进行预切割（补充文件1），从而实现图像分析软件（见“材料表”）生成的注释中所包含的位置方向信息与LMD软件中笛卡尔坐标方向的整合。H&amp;E染色后，采集含有组织及校准标记物的PEN载玻片的高分辨率图像（20倍）。
使用图像分析软件（参见材料表）对显微图像中的肿瘤细胞和间质细胞群体进行分割，以便通过激光显微切割（LMD）进行选择性采集，同时采集代表整个组织薄切片的样本（例如，全肿瘤组织）（图1）。对于全肿瘤组织的非选择性标注，通过将整个组织切片划分为500 µm2的区域块进行生成，区域块之间保留40 µm的间隙，以维持PEN膜的完整性，并防止在LMD过程中膜发生卷曲。在用于组织学解析LMD富集的切片上，图像分析软件（参见材料表）中的AI分类器被训练以区分肿瘤细胞、间质细胞以及空白玻璃载片背景。代表性肿瘤区域、间质区域和空白玻璃区域被手动高亮标注，并使用分类器工具在整个组织切片中对这些感兴趣区域（ROI）进行分割。代表全组织、肿瘤上皮和间质的分割图层被分别保存为独立的.annotation文件（补充文件3和补充文件6）。在另一份图像文件副本（不含分区ROI标注）中，从三个基准校准标记物各自最中心的端点处绘制一条短线，并以与各LMD标注图层文件相同的文件名保存为.annotation文件，文件名后附加后缀“_calib”（补充文件4）。这些线用于将PEN膜上的校准标记物位置与图像分析软件中绘制的标注形状列表数据进行共定位配准。
本研究提供了两种基于 Python 的算法——“Malleator”和“Dapọ”，以支持这一由人工智能驱动的激光显微切割（LMD）工作流程，相关代码可在 https://github.com/GYNCOE/Mitchell.et.al.2022 获取。Malleator 算法从成对的 .annotation 文件中提取所有独立标注（组织 ROI 和校准标记）的特定笛卡尔坐标，并将这些信息合并为一个可扩展标记语言（XML）导入文件（补充文件 5）。具体而言，Malleator 算法以父级文件夹的目录名称作为输入，搜索其所有子文件夹，并为尚未生成 .xml 合并文件的子文件夹生成相应的 .xml 文件。该算法将图像分析软件（见材料表）中的所有标注图层合并为单一图层，并将人工智能生成的形状列表数据（以专有的 .annotation 文件格式保存）转换为与 LMD 软件兼容的 .xml 格式。在完成标注文件与校准标记文件的合并后，由算法生成的 .xml 文件将被保存并导入至 LMD 软件中。此时需进行轻微的手动调整，以校准标注的位置，这一过程同时也用于注册激光显微镜载物台在垂直方向（z 平面）的位置。Dapọ 算法则专门用于 LMD 富集样本的处理。图像分析软件会自动将分割后的图像块分配至各个独立的标注图层，而 Dapọ 算法则在使用分类器（Classifier）工具前，将所有分割图像块合并为单一标注图层，从而减少针对 LMD 富集样本的分类器分析运行时间。
将整个肿瘤组织和LMD富集的组织样本进行消化，用TMT试剂标记，多重混合后离线分级，并进行分析 通过 定量质谱法蛋白质组学，如前所述9. 平均肽产率（43-60 µg）和回收率（0.46-0.59 µg/mm2采用此人工智能驱动工作流程采集的样本，其结果与先前报道相当。9,10共在所有样本中共同定量了 5,971 种蛋白质（补充表 S1）。利用差异最大的100种蛋白质进行无监督层次聚类分析，结果显示高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和卵巢透明细胞癌（OCCC）组织学亚型在经激光显微切割富集及全肿瘤样本中得以分离图 2A），类似于先前所述的情况11相比之下，来自HGSOC和OCCC的LMD富集间质样本各自聚为一类，并与LMD富集的肿瘤样本及全肿瘤样本分开。在定量的5,971种蛋白质中，有215种蛋白质显著改变（LIMMA校正p值 < 0.05）。 &lt; 0.05），来自HGSOC与OCCC样本的全肿瘤集合之间补充表 S2）。这些改变的蛋白质与Hughes等人鉴定出的用于区分HGSOC和OCCC肿瘤组织的蛋白质进行了比较。11在 Hughes 等人定量的 76 种标志蛋白中，本数据集共同定量了其中 57 种，且两者高度相关（Spearman Rho = 0.644，p < 0.0001）。 &lt; 0.001) (图2B).
<img alt="由人工智能驱动的组织分区工作流程，包括激光显微切割、蛋白质组学和生物信息学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64171/64171fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：用于激光显微切割下游定量蛋白质组学分析的自动化感兴趣组织区域选择集成工作流程概览。 在PEN膜载玻片上切割校准标记，以将图像分析软件HALO中由人工智能生成的组织感兴趣区域（ROI）的位置数据，与激光显微切割（LMD）显微镜上的水平位置进行共定位注册。Malleator算法用于将一张载玻片上所有注释层的标注分割数据与_calib参考文件合并，并将其转换为与LMD软件兼容的.xml文件。经LMD采集用于蛋白质组学分析的组织随后被消化，并通过高通量定量蛋白质组学方法进行分析，具体步骤如前所述9。缩写：LMD = laser microdissection；ROI = region of interest；TMT = tandem mass tag；Quant. = quantification；Ident. = identification；LC-MS/MS = liquid chromatography-tandem mass spectrometry。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/64171fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因表达热图和散点图，比较肿瘤病例编号，显示对数倍数变化数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64171/64171fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2激光显微切割富集样本与全肿瘤样本中蛋白质的分析 (A) 对高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）和卵巢透明细胞癌（OCCC）的激光显微切割富集样本及全肿瘤样本中丰度变异最大的100种蛋白质进行无监督层次聚类分析。B) log 相关性2 本研究中HGSOC与OCCC全肿瘤样本间蛋白质丰度的变化倍数（Mitchell等.，x轴）以及Hughes等人的一项类似研究. （y轴）11缩写：LMD = 激光显微切割；HGSOC = 高级别浆液性卵巢癌；OCCC = 卵巢透明细胞癌；log2FC = log2转化后的蛋白质组丰度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/64171fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充表 S1：在 HGSOC 和 OCCC 组织样本的全部 LMD 富集样本和全肿瘤样本中共同定量的 5,971 种蛋白质的丰度。 缩写：LMD = 激光显微切割；HGSOC = 高级别浆液性卵巢癌；OCCC = 卵巢透明细胞癌。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/JoVE64171_Supplemental%20Table%201%20JoVE%20Review.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充表 S2：高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）与卵巢透明细胞癌（OCCC）全肿瘤样本中差异表达的蛋白质（215 种）（LIMMA 调整后 p 值 &lt; 0.05）。 缩写：HGSOC = 高级别浆液性卵巢癌；OCCC = 卵巢透明细胞癌。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/JoVE_Supplemental%20Table%202_4%20May%2022%20(1).zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
补充文件 1：包含四个载玻片位置标准校准标记的代表性形状列表数据（.sld）文件。 该文件可导入 LMD 软件中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/Supplemental%20File%201_12%20Apr%2022.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：H 的代表性 .svs 图像文件&amp;E染色高分辨率（20倍）组织切片。 该文件可使用图像分析软件或 LMD 软件打开和查看。缩写：H&amp;E = 苏木精和伊红；LMD = 激光显微切割。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/Supplemental%20JoVE64171_Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件 3：分区全肿瘤片段的代表性 .annotation 文件。 该文件可导入图像分析软件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/Supplemental%20File%203_12%20Apr%2022.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件4：校准器定位标记段的代表性_calib.annotation文件。 坐标信息表示从每个箭头形定位标记引出的短校准线的方向定位。该文件可导入图像分析软件中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/Supplemental%20File%204_12%20Apr%2022.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 5：Malleator 算法生成的代表性可扩展标记语言（.xml）文件。 该文件可导入激光显微切割软件中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/Supplemental%20File%205_12%20Apr%2022.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件6：用于激光显微切割富集样本的分区AI分类片段的代表性.annotation文件。该文件可导入图像分析软件。缩写：AI = 人工智能；LMD = 激光显微切割。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64171/Supplemental%20File%206_12%20Apr%2022.zip" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案描述了一种高通量工作流程，利用人工智能对染色的薄组织切片图像中经病理学确认的兴趣区域进行分割，以通过激光显微切割富集组织学分辨的细胞群体。该策略包含一种新算法，可将标记感兴趣细胞群体的边界直接传输至激光显微镜。

肿瘤微环境（TME）是一个复杂的生态系统，包含数十种不同类型的细胞，包括肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞……

该方案结合了由人工智能驱动的图像分析技术，用于组织分割。通过激光显微切割实现组织学选择性采集，使我们更接近病理组学（Pathomics）的实现。利用人工智能预先定义组织感兴趣区域（ROI），可缩短组织切片在常温下的暴露时间，减少执行此类采集所需的人力，并降低操作者间的差异性。该技术广泛适用于任何涉及从组织样本中收集或富集特定细胞群体的疾病或病理学相关研究。对于具备基本组织病理学知识和激光显微切割（LMD）操作经验的用户而言，该方法操作简便。关键在于确保为细胞切割出清晰的校准区域，并对分类器进行充分训练。首先，在切割参考校准标记点之前，确保载玻片完全干燥。打开激光显微切割软件，在“导入形状”选项下打开默认的校准点 sld 文件。将载玻片加载到仪器上，组织面向下，标签侧靠近操作者。 将载玻片放入激光显微切割平台的载片架中，选择“切割前自动聚焦”选项。使用激光显微镜及默认校准点 sld 文件，在 PEN 膜上切割出校准标记。仅针对激光显微切割富集样本的情况，打开图像分析软件。选择打开的图像，在弹出窗口中选择由切片扫描生成的点 svs 图像文件。进入注释标签页，选择并使用矩形注释工具在组织周围绘制一个方框。选中该方框注释后，在图像上单击右键。选择高级下拉菜单，然后点击分区选项。将瓦片大小和间距分别设置为 500 和 40，选择确定以生成瓦片。选中并删除用于生成瓦片的周长框注释。选择图层操作下拉菜单，然后单击导出，将平铺注释保存为点注释文件。将已保存的 Python dapa 算法副本放入与平铺注释文件相同的文件夹中，该算法用于合并人工智能分类的注释图层。复制平铺注释文件的名称。使用 idle 集成开发环境打开 Python 程序，并将平铺注释文件的名称粘贴到程序底部的引号之间。选择运行下拉菜单，然后单击运行模块。等待一段时间，程序将生成若干文件，这些文件会将所有平铺注释合并到单个图层下。打开图像分析软件并进入注释选项卡。选择图层操作下拉菜单，然后点击删除所有图层以从图像中移除所有注释。再次选择图层操作下拉菜单，然后点击导入本地注释文件。在弹出窗口中，选择由脚本生成的合并后的点注释文件。确保所有导入的图块均位于同一注释层下。在分类器选项卡中，按照制造商的说明，标出肿瘤、间质以及空白玻片背景 ROI 的代表性区域。运行分类器之前，单击“高级分类器选项”，在“注释”选项卡中勾选ROI框或多个框以选择所需的注释层。通过分类器操作菜单中的“注释层”选项来运行分类器。分类器分析完成后，转到“注释”选项卡，选择由该分析生成的注释层。选择图层操作下拉菜单，然后单击“删除当前图层以外的所有图层”，以从图像中移除所有其他标注图层。接下来，再次选择图层操作下拉菜单，然后单击“导出”，将标注保存为点标注文件。为会话或项目创建一个文件夹，并将点标注文件保存在该文件夹的子文件夹中。使用载玻片的唯一标识符进行标记。进入注释选项卡，选择图层操作下拉菜单，然后点击删除所有图层，以移除图像中的全部注释。选择画笔工具，并从每个校准标记点绘制一条短线。按以下顺序从标记处绘制线条：左上、右上、右下。选择图层操作下拉菜单，然后点击导出，将拼接注释保存为 do 注释文件。在文件名中添加下划线“calib”，并将文件放入包含拼接图形坐标的子文件夹中。复制主项目的地址。使用 Idle 集成开发环境打开 XML 导入生成脚本 malliator，然后将项目文件夹地址粘贴到脚本末尾的引号之间。选择运行下拉菜单，然后单击运行模块以执行脚本。将标记好的膜玻片加载到激光显微镜载物台的玻片架上，组织面向下，标签侧靠近操作者。从文件下拉菜单中选择导入形状。选择为该玻片生成的点阵XML或LMD导入文件。在弹出窗口中选择“否”，以避免从文件加载参考点；在第二个弹出窗口中也选择“否”，以避免使用任何先前存储的参考点进行校准。根据激光显微切割应用程序的提示，将校准十字依次对准玻片上的三个校准标记点。在载玻片图像的左上角、右上角和右下角寻找校准标记。在图像分析软件中，这些标记对应显微镜载物台上倒置激光显微切割载玻片的参考点。使用5x物镜定位，切换至63x物镜对每个校准标记进行对齐。在弹出窗口中选择“否”，以避免将参考点保存到文件中；在第二个弹出窗口中选择“确定”，确认载玻片已插入。将5倍物镜移至工作位置，并在弹出窗口中选择“是”，以使用实际放大倍数。导入的图形出现后，调节摄像头对准组织样本。在形状列表窗口中高亮并选中所有形状。使用视野内的一个或两个标注作为参考，将它们拖动到相应位置，并将激光切割的垂直 z 轴对齐。将试管装入专为 PCT 微管设计的通用试管架中。检查导入的图形，并将其分配至相应的收集管位置。按下“开始切割”以启动激光。卸下含有LMD组织的样本管并盖紧，置于干冰上。经过热循环和离心后，将LMD收集的组织样本从PCT微管中取出，并移除且丢弃微帽。加入胰蛋白酶，按每30平方毫米组织加入一微克的比例添加。然后使用微帽工具将微型研磨杵插入微管中。将微量离心管放入桶循环卡盒中，并组装完整的卡盒。将卡盒放入桶循环压力室，盖紧盖子。在50摄氏度条件下，以45,000 PSI压力循环50秒，随后在常压下保持10秒，共进行60个循环。进行液相色谱-质谱分析时，将自动进样瓶装载到液相色谱自动进样器的相应位置。关闭自动进样器，并使用适当的梯度和质谱方法分析各个组分。采用变异程度最大的100种蛋白质进行无监督层次聚类分析。通过激光显微切割富集及全肿瘤样本，实现了高级别浆液性卵巢癌与卵巢透明细胞癌组织学类型的分离。相比之下，来自高级别浆液性卵巢癌和卵巢透明细胞癌的激光显微切割富集间质样本则聚类在一起，并独立于激光显微切割富集的肿瘤样本及全肿瘤样本。在定量的 5,971 种蛋白质中，高级别浆液性卵巢癌与卵巢透明细胞癌组织样本的全肿瘤集合之间有 215 种蛋白质发生了显著改变。Hughes 定量的 76 种特征性蛋白质中，有 57 种在此数据集中被共同定量，并显示出高度相关性。训练分类器是最具挑战性的部分。根据 Indica Lab 软件的操作说明优化分类器，可获得最准确的结果。其余所有步骤均实现标准化。利用此由人工智能驱动的激光显微切割工作流程所获取的组织，可兼容多种下游分析应用，包括本文所述的基于质谱的蛋白质组学分析，或基因组学、转录组学及其他组学分析。

industrialized-artificial-intelligence-guided-laser-microdissection

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

工业化、人工智能引导的激光显微切割，用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

激光捕获显微技术，又称激光显微切割（LMD），可使用户从冷冻或...

哺乳动物组织的激光显微切割

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激光显微切割：一种从三维类器官培养模型中分离侵袭性结直肠癌细胞的技术

我们介绍了如何使用激光显微切割技术（LCM），从损伤大鼠脑组织的冷冻切片中分离富集的海马神经元或单个神经元，以用于后续通过定量实时PCR和/或全基因组微阵列进行基因表达分析。...

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对合成的组织工程结直肠癌模型中激光显微切割的细胞及其间质进行分子谱分析，代表了一种新颖且可操控的方法，可用于表征和解析肿瘤侵袭前沿的肿瘤细胞与癌相关间质细胞之间界面处独特的生物学特性。...

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SIVQ-LCM 是一种创新性方法，利用计算机算法——空间不变向量量化（Spatially Invariant Vector Quantization, SIVQ）——来驱动激光捕获显微切割（laser capture microdissection, LCM）过程。SIVQ-LCM...

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我们描述了使用激光捕获显微切割技术从大鼠脑部不同区域获取特定细胞群体样本，用于基因和微小RNA分析。该技术可用于研究创伤性脑损伤对大鼠脑内特定区域的差异性影响。...

立体定位图谱引导的激光显微切割技术用于分离受创伤性损伤影响的脑区

本文介绍了一种利用宽场高内涵分析系统（WHCAS）对载玻片上荧光标记组织进行自动分割的实验方案。该方案在涉及生物组织中荧光标记物定量的各个领域均具有广泛应用，包括生命科学、医学工程和健康科学。...

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激光显微切割（LMD）是一种灵敏且高度可重复的技术，可用于揭示介导胶质瘤异质性和侵袭性的分子通路。本文中，我们描述了一种优化的实验方案，通过激光显微切割从胶质瘤组织中分离特定区域，并随后进行转录组学分析。...

激光捕获显微切割胶质瘤亚区域用于肿瘤内异质性、肿瘤微流及侵袭的空间与分子特征分析

采用自动组织切割的数字注释为低肿瘤含量样本中富集肿瘤细胞提供了创新性方法，且适用于石蜡和冷冻两种组织类型。所述工作流程可提高准确性、可重复性和通量，可广泛应用于科研和临床环境。...

低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动化解剖方案

一种用于从人类中分离神经黑色素颗粒的可靠方案 死后黑质致密部 组织 通过...

基于激光显微切割的神经黑色素颗粒蛋白质组学谱LC-MS/MS分析方案

本文描述了一种利用激光显微切割技术分离单个线虫组织用于RNA测序的实验方案。该方案无需物种特异性的遗传工具包，因而能够在单组织样本水平上比较不同物种之间的基因表达谱。...

适用于多种物种的单组织激光显微切割技术

了解人工智能引导的激光显微切割技术，用于肿瘤微环境微尺度蛋白质组学分析。该方法通过AI图像分割减少操作差异，提高组织处理效率，适用于病理学研究中的特定细胞群富集。

工业化的、人工智能引导的激光显微切割技术用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

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