工业化、人工智能引导的激光显微切割，用于肿瘤微环境的微尺度蛋白质组学分析

该协议集成了用于组织分割的AI驱动的图像分析。通过组织学通过激光显微切割选择性收获，使我们更接近Pathomics的现实。使用AI预定义组织ROI，限制组织载玻片在环境温度下的停留时间，减少执行这些收获的人力，并减少操作员的可变性。

该技术广泛适用于任何涉及从组织标本中收集或富集特定细胞群的基于疾病或病理学的研究。对于具有基本组织病理学知识和LMD经验的用户，此方法非常简单。关键是要确保为细胞切割干净的校准器，并很好地训练分类器。

首先，在切割参考校准基准之前，请确保载玻片完全干燥。打开激光显微切割软件，然后在导入形状选项下打开默认校准点 sld 文件。装载载玻片时，纸巾朝下，标签面更靠近操作员。

进入激光显微切割载物台上的载玻片支架，选择切割前自动对焦选项。使用激光显微镜和默认的校准点sld文件，将校准基准切割到PEN膜中。仅对于激光显微切割丰富集合，请打开图像分析软件。

选择打开的图像，然后从弹出窗口中选择扫描幻灯片生成的点svs图像文件。导航到"批注"选项卡，选择并使用矩形批注工具在组织周围绘制一个框。选择框注释，然后右键单击图像。

选择高级下拉菜单，然后单击分区选项。将磁贴大小和间距分别设置为 500 和 40，然后选择"确定"以生成磁贴。选择并删除用于生成切片的外围框批注。

选择图层操作下拉菜单，然后单击导出以将切片批注另存为点注记文件。放置 Python dapa 算法的已保存副本，该算法旨在将 AI 分类注记图层合并到与平铺批注文件相同的文件夹中。复制平铺批注文件的名称。

使用空闲的集成开发环境打开 Python 程序，并将平铺注释文件的名称粘贴到程序底部的引号之间。选择运行下拉菜单，然后单击运行模块。等待生成几个文件，这些文件将所有平铺批注合并到单个图层下。

打开影像分析软件并导航到注释选项卡。选择图层操作下拉菜单，然后单击删除所有图层以从图像中删除所有注记。选择图层操作下拉菜单，然后单击导入本地注记文件。

在弹出窗口中，选择由脚本生成的合并点批注文件。确保所有导入的切片都位于同一注记图层下。从分类器选项卡中，按照制造商的说明突出显示肿瘤，基质和空白载玻片背景ROI的代表性区域。

在运行分类器之前，单击高级分类器选项，通过选中 ROI 框或注记选项卡上的框来选择所需的注记图层。使用分类器操作菜单中的注记图层选项运行分类器。分类器分析完成后，导航到注记选项卡，然后选择从分析生成的注记图层。

选择图层操作下拉菜单，然后单击删除除当前图层之外的所有图层以从图像中删除所有其他注记图层。接下来，选择图层操作下拉菜单，然后单击导出以将注记另存为点注记文件。为会话或项目创建一个文件夹，并将点注释文件保存在子文件夹中。

标有幻灯片的唯一标识符。导航到注记选项卡，选择图层操作下拉列表，然后单击删除所有图层以从图像中移除所有注记。选择钢笔工具，然后从每个校准基准绘制一条短线。

按以下顺序从标记中绘制线条。左上角、右上角、右下角。选择图层操作下拉菜单，然后单击导出以将切片批注另存为 do 注记文件。

将下划线 calib 添加到文件名中，并将文件放在包含平铺形状坐标的子文件夹中。复制主项目的地址。使用空闲集成开发环境打开 XML 导入生成脚本切换器，然后将项目文件夹地址粘贴到脚本底部的引号之间。

选择运行下拉菜单，然后单击运行模块以执行脚本。将标记的膜载玻片装入激光显微镜载物台上的载玻片，使组织朝下，标签侧更靠近操作员。从文件下拉菜单中选择导入形状。

选择为幻灯片生成的点 XML、LMD 导入文件。在弹出窗口中选择"否"以避免从文件加载参考点，在第二个弹出窗口中选择"否"以避免使用任何先前存储的参考点进行校准。按照激光显微解剖应用中的提示进行操作，并将校准十字与载玻片上的三个校准基准中的每一个对齐。

查找显示在幻灯片图像的左上角、右上角和右下角的校准基准。在图像分析软件中，将对应于显微镜载物台上倒置激光显微切割载玻片的参考点。在使用 5x 主观镜头进行定位和使用 63x 主观镜头对齐每个校准基准之间进行切换。

在弹出窗口中选择"否"以避免将参考点保存到文件，在第二个弹出窗口中选择"否"以确认插入了幻灯片。将 5 倍主观镜头移动到适当的位置，然后在弹出窗口中选择"是"以使用实际放大倍率。导入的形状出现后，将相机对焦于纸巾上。

突出显示并选择形状列表窗口中的所有形状。使用视野中的一个或两个注释作为参照将它们拖动到位，并对齐垂直 z 轴以使用激光进行切割。将管子加载到专为PCT微管设计的通用管架中。

查看导入的形状，并将它们指定到适当的管位置以进行收集。按开始切割以启动激光。用LMD纸巾卸载并关闭样品管，然后放在干冰上。

在热循环和离心之后，将LMD收集组织样品，从PCT微管中取出并丢弃微胶囊。加入胰蛋白酶，每30毫米见方的组织加入一微克的比例。并使用微帽工具将微杵插入微管中。

将微管转移到桶循环盒中并组装整个墨盒。将滤芯放入桶循环压力室并盖上盖子。桶在 45， 000 PSI 下循环 50 秒，大气压在 50 摄氏度下循环 10 秒，循环 60 次。

对于LC-MS MS分析，将自动进样器小瓶加载到适当的位置，放入液相色谱自动进样器中。关闭自动进样器，使用适当的梯度和质谱方法分析单个级分。使用100种最可变的蛋白质进行无监督分层聚类。

导致高级别浆液性卵巢癌和卵巢透明细胞癌组织型与激光显微切割富集和全肿瘤样本分离。相比之下，激光显微解剖丰富了来自高级别浆液性卵巢癌和卵巢透明细胞癌的基质样本。聚集在一起并独立于激光显微切割的肿瘤和整个肿瘤样本。

在5， 971个定量蛋白质中，215个在高级别浆液性卵巢癌和卵巢透明细胞癌标本的整个肿瘤集合之间发生了显着变化。在Hughes量化的76种特征蛋白中，有57种在该数据集中被共量化，并且高度相关训练分类器是最具挑战性的部分。按照籼稻实验室软件说明并改进分类器，可再现最准确的结果。

其他一切都是标准化的。使用这种AI驱动的LMD工作流程收获的组织与各种下游分析应用兼容，包括此处描述的基于质谱的蛋白质组学或基因组，转录组学或其他组学分析。