Name: 在蛋 和 卵外 研究中研究鸟类内耳发育的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 了解鸟类内耳发育与毛细胞再生的分子机制，使用鸡胚模型进行卵内电穿孔和离体培养实验。该方法为听力损失治疗研究提供重要见解，并可用于评估药物的耳毒性效应。

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我们衷心感谢印度科学培育协会（NCBS）、塔塔基础研究院（TIFR）、Infosys-TIFR前沿研究资助项目、印度科学技术部-科学与工程研究委员会（DST-SERB）以及皇家国家聋人研究所提供的支持。我们感谢位于班加罗尔Hesaraghatta的中央家禽发展组织与培训研究所。我们对CIFF和EM设施以及NCBS实验室的支持深表感谢。我们感谢Yoshiko Takahashi和Koichi Kawakami提供Tol2-eGFP和T2TP质粒，感谢Guy Richardson提供HCA和G19 Pcdh15抗体。我们感谢Earlab团队成员对本实验方案持续的支持和宝贵的反馈意见。

涉及获取、培养和使用受精鸡卵及未孵化胚胎的实验方案已获得卡纳塔克邦班加罗尔国家生物科学中心机构动物伦理委员会的批准。
1. 在卵内 鸡听觉前体细胞的电穿孔
<ol>
	<li>CRISPR/Cas9 基因敲除的 sgRNA 设计与克隆
	<ol>
		<li>为实现基因敲除，设计引导 RNA 以破坏基因的外显子区域，优先选择靠近编码区 5' 端的位置。</li>
		<li>使用网络工具 CRISPOR23 筛选潜在的引导 RNA。将浏览器数据设置为 Gallus gallus ，并将原间隔序列邻近基序（PAM）序列设为 5'- NGG -3'。该程序根据输入序列确定引导 RNA，并基于靶上和脱靶活性赋予不同评分。选择评分最高的前四个引导序列用于后续研究。</li>
		<li>为设计用于引导（g）RNA 合成的特异性模板寡核苷酸，需从 gRNA 设计工具的输出结果中去除 PAM 序列（5′- NGG -3′）。该序列在靶向过程中不需要，但包含 Cas9 切割识别序列。为每个潜在 gRNA 合成两条在两端均含有 BsmBI 限制性酶切位点的 HPLC 纯化的互补寡核苷酸。</li>
		<li>将引导序列克隆至所选载体（此处使用 pcU6_1sgRNA 载体24）的 tracrRNA 支架中，保持阅读框一致。</li>
		<li>用无 DNase/RNase 的水将 sgRNA 寡核苷酸溶解至浓度为 100 µM。使用下列参数在热循环仪中进行正链与反链寡核苷酸的退火：95 °C 保持 3 分钟，然后 37 °C 保持 15 分钟，最后降温至 4 °C。</li>
		<li>按照文献25中描述的标准分子生物学技术，使用 BsmBI 酶对退火后的寡核苷酸和 pcU6_1sgRNA 克隆载体进行过夜限制性酶切消化。将凝胶纯化的线性化 BsmBI 消化的 pcU6_1sgRNA 载体与消化后的 sgRNA 寡核苷酸进行连接反应。转化至 DH5-alpha 感受态细胞中，并通过测序验证所获得的克隆。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>鸡蛋处理与开窗
	<ol>
		<li>获取新鲜产出的鸡蛋，并用 70% 乙醇擦拭表面以防止污染。在 37–38 °C、45% 湿度条件下孵育 3.5–4 天。</li>
		<li>孵育完成后，将鸡蛋侧放至少 5 分钟后再打开。这有助于胚胎重新定位至卵黄顶部。使用镊子在鸡蛋顶部和钝端打小孔，使 21G 针头能够穿过。</li>
		<li>为防止开窗过程中损伤胚胎，需移除部分蛋清以使胚胎远离蛋壳。操作时使用 5 mL 注射器和 21G 针头，从钝端小孔小心抽出约 2 mL 蛋清。用透明胶带封住钝端小孔。</li>
		<li>为制作蛋窗，先在蛋壳顶部贴上透明胶带。使用弹簧弓剪刀切开一个长约 2 cm、宽约 1.5 cm 的窗口，暴露胚胎。用镊子打开覆盖在胚胎上的绒毛膜，以便接触胚胎。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒显微注射
	<ol>
		<li>在基因敲除实验中，准备两种溶液：包含 SpCas9 蛋白和引导质粒 pcU6_1sgRNA 的敲除混合液，以及示踪质粒混合液 T2K-eGFP（该质粒含鸡 β-actin 启动子驱动的 GFP 表达盒，两侧为 Tol2 转座子位点）与 T2TP（Tol2 转座酶克隆于 Tol2 载体中26,27）。示踪质粒用于监测电转效率。</li>
		<li>当电转多个质粒时，确保 DNA 的终浓度至少为 4 µg/µL。将三种质粒——引导质粒 pcU6_1sgRNA、T2K-eGFP 和 T2TP，按 1:1:1 比例混合，并加入 1 µg SpCas9 蛋白、30% 蔗糖和 0.1% 快绿染料，最终体积为 10 µL。</li>
		<li>使用垂直拉针仪从标准玻璃毛细管（长度 3 英寸，外径 1.0 mm）制备显微注射针。拉制后用精细镊子折断毛细管尖端，获得直径约 50 µm、呈锥形的尖端。</li>
		<li>将 E3.5 期胚胎左侧朝下放置，头部朝右。此体位仅使右侧耳泡可被注射。将敲除混合液显微注射至耳泡内，注入约 200 nL 的 DNA 溶液以充满耳泡。</li>
		<li>使用 T7 核酸内切酶检测法28评估引导序列的编辑效率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔
	<ol>
		<li>电穿孔前，在胚胎表面滴加数滴 0.719% 生理盐水，以降低电阻并防止胚胎过热。</li>
		<li>将正极电极经之前去除蛋清时在蛋钝端所打的小孔插入，调整电极位置使其位于卵黄下方。将负极电极置于已注射的耳囊上方。</li>
		<li>使用方波脉冲发生器进行电穿孔，将质粒转染入胚胎细胞。施加 5 次脉冲，每次 25 V、持续 100 ms，脉冲间隔 50 ms。具体条件应根据各自的电穿孔装置通过实验优化确定。</li>
		<li>电穿孔后滴加数滴 0.719% 生理盐水以保持胚胎湿润。用蒸馏水彻底冲洗电极表面以清除变性的蛋清。用透明胶带密封鸡蛋，并放回 37–38 °C 的湿润培养箱中继续孵育。 
		&#8203;注意：电穿孔后胚胎可继续培养至孵化，但存活率显著下降。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基底乳头解剖
<ol>
	<li>使用70%乙醇对手术台、显微镜载物台及周围区域进行消毒。对显微解剖器械（包括弹簧剪、微型刮匙和两对精细镊子）进行加热或酒精灭菌。</li>
	<li>准备以下解剖培养皿：底部为黑色硅胶的玻璃培养皿、90 mm塑料培养皿和60 mm培养皿。将磷酸盐缓冲液（PBS）或Hanks平衡盐溶液（HBSS）预冷，用于解剖操作。</li>
	<li>轻柔地将鸡蛋敲入90 mm培养皿中。识别鸡胚的外耳结构。用剪刀在下颌下方水平切断颈部，将胚胎头部离体，并转移至盛有冰冻PBS的60 mm培养皿中。</li>
	<li>将胚胎头部调整为喙部顶端朝向操作者，并用一把#5镊子夹住喙部固定。用另一把#5镊子挖出眼球。从头侧向尾侧方向，沿颅骨中线剪开颅骨，取出脑组织。</li>
	<li>加入更多冰冻PBS或HBSS，寻找位于耳廓水平附近、靠近中线的两个有光泽的结构，即位于耳蜗导管末端的球囊耳石器官（lagena的耳石）。</li>
	<li>在两个球囊之间大致切割，并在该区域上下方充分切除周围组织，以分离出两个内耳结构。在斜向照明下观察内耳轮廓，去除多余组织及前庭结构。</li>
	<li>将分离出的耳蜗转移至带有冰冻PBS的黑色硅胶底培养皿上。使用#5镊子剥离软骨性耳蜗囊，获得耳蜗导管。找到耳蜗导管上的波浪状结构（tegmentum），用#55镊子将其去除，暴露基底膜（BP）。再用#55镊子去除盖膜，暴露毛细胞（HCs）和支撑细胞（SCs）。</li>
</ol>
3. 基底乳头外植体的培养
<ol>
	<li>基底乳头的膜培养
	<ol>
		<li>取一个六孔组织培养板，每孔放置一个培养膜插件。</li>
		<li>用200 µL移液器吸取含有1x HBSS缓冲液的解剖后基底乳头（外植体），并将其转移至培养膜上。为防止组织粘附在移液器管壁上，在吸取组织前应先吸入部分培养基。</li>
		<li>调整外植体方向，使基底乳头朝上，以便从上方可观察到毛细胞和支持细胞29。外植体定位后，缓慢从培养膜表面吸除HBSS缓冲液。在此过程中，外植体会附着于培养膜上。</li>
		<li>在膜插件与孔壁之间加入1.2 mL的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），以填满六孔板的各孔。单个30 mm培养膜上最多可培养六个外植体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>耳蜗管的胶原培养
	<ol>
		<li>在组织培养超净台中，通过混合400 µL浓度为3 mg/mL的大鼠尾胶原、50 µL 10x DMEM、30 µL 7.5% NaHCO3和5 µL HEPES配制胶原混合液。</li>
		<li>取一个四孔板，每孔加入三滴胶原混合液。将解剖得到的耳蜗管转移至每滴胶原液中。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育10分钟，使胶原基质固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养物的小分子处理
	<ol>
		<li>配制含药理调节剂或仅含其溶剂（作为对照）的培养基（DMEM、N-2补充剂、青霉素）。用700 µL添加了抑制剂的培养基替换原有培养基。将外植体置于37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养。</li>
		<li>每天更换50%的培养基。经过适当的孵育时间后，移除培养基，并将外植体用于后续检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成像与分析
<ol>
	<li>免疫荧光分析
	<ol>
		<li>从孔中移除培养基，用1×HBSS清洗组织块两次。使用移液器向孔中加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA），室温孵育20分钟。</li>
		<li>去除PFA，用1×PBS在室温下洗涤组织块三次。为从培养膜上收集组织块，使用小型弹簧剪在含有组织片段的膜周围剪开一小口，然后用镊子将组织连同膜一起转移至48孔培养板中。 
		注意：如果组织在固定后漂浮，应用 200 µL 移液器吸取并转移至 48 孔板中进行后续处理。避免用力将组织从膜上剥离。</li>
		<li>进行胶原液滴培养时，使用镊子将整个胶原液滴转移至硅胶板中。加入200 µL 1x PBS，借助镊子去除胶原，然后将组织转移至48孔培养板中。</li>
		<li>用含 0.3% Tween-20 的 1x PBS（PBST）1 mL 在室温下对组织块进行透化处理，持续 30 分钟。随后在室温下用 200 µL 封闭缓冲液（PBST 中含 10% 山羊血清和 1% 牛血清白蛋白）孵育组织块 1 小时。</li>
		<li>将外植体与200 µL一抗溶液（1:300，溶于封闭缓冲液中）于4 °C孵育过夜。移除一抗溶液，用PBST彻底洗涤外植体，每次20分钟，共洗5次。</li>
		<li>将外植体与200 µL鬼笔环肽和二抗溶液（溶于封闭缓冲液中）在室温避光条件下孵育1小时。移除鬼笔环肽和二抗溶液，用PBST彻底洗涤外植体，每次20分钟，共洗5次。 
		注意：每种成像应用所需的二抗浓度和洗涤时间必须单独确定。对于超分辨率显微镜成像，我们通常将二抗浓度从1:500提高到1:200，将鬼笔环肽（phalloidin）浓度从1:400提高到1:200。</li>
		<li>将外植体与DAPI溶液（PBST中1:1000稀释）在室温下孵育15分钟。移除DAPI溶液，用PBST洗涤外植体，每次5分钟，共洗3次。</li>
		<li>使用封片剂将外植体固定在载玻片上，确保基底膜面朝上（朝向盖玻片）。进行共聚焦成像时，使用抗荧光淬灭封片剂。将载玻片置于室温避光环境中过夜，使封片剂充分干燥。随后可直接进行成像，或先将载玻片置于4 °C保存，待成像时取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于扫描电镜分析的OTOTO固定法
	<ol>
		<li>所有溶液均需新鲜配制，并根据当地安全指南进行操作。将膜培养的外植体（来自步骤 4.1.4）用含 3 mM CaCl₂ 的 2.5% 戊二醛溶于 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.3）中固定2在4 °C下固定24至72小时，每24小时更换一次固定液。</li>
		<li>去除固定液，用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液在室温下洗涤组织，每次 5 分钟，共洗 3 次。用 1% OsO₄ 进行后固定4 （从4% OsO₄稀释而来）4 使用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液在室温下固定1小时。从本步骤开始直至脱水步骤均需在通风橱内进行。</li>
		<li>使用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液在室温下清洗3次，每次5分钟。然后使用双蒸水或超纯水在室温下清洗3次，每次5分钟。</li>
		<li>配制0.5%的硫代碳酰肼（TCH）水溶液，使用超纯水溶解。在75 °C下搅拌10分钟，冷却至室温后过滤溶液。 
		注意：TCH 具有极高危险性。使用前必须获得当地安全委员会批准，操作时需格外小心。</li>
		<li>从样品中移除超纯水，逐滴加入0.5% TCH。若溶液变褐色，立即停止操作，用超纯水冲洗样品，然后小心加入0.5% TCH溶液。待溶液变澄清后，更换为新鲜的0.5% TCH溶液。室温孵育20分钟。30,31.</li>
		<li>用超纯水在室温下冲洗样品，每次5分钟，共冲洗3次。重复步骤4.2.2、4.2.3和4.2.5两次，最后以OsO₄结束4 孵育后洗涤。</li>
		<li>将样品经乙醇梯度脱水至100%无水乙醇（EtOH）。依次在25% EtOH中孵育10分钟，50% EtOH中孵育10分钟，75% EtOH中孵育10分钟，95% EtOH中孵育10分钟，最后在100% EtOH中孵育3次，每次10分钟。</li>
		<li>使用液态CO₂进行临界点干燥2立即在载玻片上封片样本&#160;带有双面碳导电胶带的SEM样品台。进行溅射镀膜，使镀层厚度为5-10 nm。若不立即进行成像，应将样品置于真空干燥器中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何竞争利益需要披露。

鸡是一种经济且便捷的模式生物，可用于实验室研究内耳。本文所述方法在我们的实验室中常规使用，并可补充正在进行的哺乳动物内耳研究。In ovo 电穿孔技术用于将基因操作引入鸡的基因组。电穿孔还可用于导入编码靶向特定细胞器或亚细胞结构的荧光蛋白的载体35,36。尽管该操作较为简单，但在 in ovo 条件下对胚胎的操作确实会影响其存活率。为了实现高效的电穿孔，应获取新鲜的鸡蛋（产下后尽快使用）。储存超过5天的鸡蛋常出现死亡率升高和/或发育异常的情况。采用无菌操作技术、确保蛋壳妥善封闭以防止水分流失，并尽量减少对胚胎的操作，均可提高胚胎存活率。
我们发现，在E3.5至E4阶段靶向耳囊可减少胚胎所受的创伤，而使用精确定位的电极能够有效靶向BP的感觉前体细胞。然而，到这一阶段，听觉-前庭神经节的前体细胞已从内耳迁移出去37,38</sup...

所有脊椎动物的内耳均起源于一种称为耳基板的简单上皮1,2。耳基板将发育形成内耳中所有结构成分以及转导听觉和平衡感知相关机械感觉信息所必需的各种细胞类型。内耳中的毛细胞（HCs）是一类具纤毛的感觉细胞，周围由支持细胞（SCs）包绕。毛细胞通过第八脑神经的神经元将信息传递至听觉后脑，而这些神经元同样起源于耳基板3。声音的初级转导发生在听觉毛细胞的顶端表面，依赖于一种机械敏感性的纤毛束4。该过程由基于肌动蛋白的特化突起——静纤毛介导，静纤毛呈梯度排列，形成阶梯状结构5。此外，一种特化的初级纤毛，即动纤毛，参与调控纤毛束的形成，并位于最高一排静纤毛的旁边6,7,8。静纤毛的结构对其将声能产生的机械刺激转化为电信号至关重要9。由于衰老、感染、声学创伤或耳毒性损伤等原因导致的听觉毛细胞损伤，可引起部分或完全性听力丧失，而在哺乳动物中，这种损伤是不可逆的10。
已有研究提出，细胞替代疗法可能修复此类损伤11,12。该研究领域的思路是，首先了解哺乳动物毛细胞的正常发育过程，然后探究内耳中可能存在的类祖细胞是否能够重新启动发育程序13。另一种研究策略是将目光投向哺乳动物之外，观察听觉毛细胞具有较强再生能力的非哺乳脊椎动物，例如鸟类14,15。在鸟类中，毛细胞的再生主要通过支持细胞去分化为类祖细胞状态，随后经不对称&#160;有丝分裂，产生一个新的毛细胞和支持细胞16。此外，也已观察到支持细胞直接转分化为毛细胞的现象17。
尽管鸟类听觉发育的机制与哺乳动物存在显著的相似性，但也存在差异18。鸡胚基底乳头（basilar papilla, BP）中的毛细胞（HC）和支撑细胞（SC）的分化从胚胎期第7天（E7）开始显现，并随时间推移逐渐变得明显。到E12时，可观察到结构清晰且极性良好的基底乳头（BP），而到E17时则可见发育成熟的毛细胞19。这些时间点为研究细胞分化、模式形成、极性建立以及毛细胞成熟的相关机制提供了窗口。明确这些机制是保守还是存在差异具有重要意义，因为它们有助于揭示机械感受性毛细胞起源的深层同源性。
本文展示了在胚胎发育早期和晚期阶段采用的一系列技术，用于研究内耳器官发育过程中细胞的增殖、命运决定、分化、图式形成及维持等细胞过程。这些方法可与已有的关于离体培养中内耳发育研究的其他方案相互补充20,21,22。我们首先介绍利用体内电穿孔法（in ovo electroporation）将外源性 DNA 或 RNA 导入 E3.5 期听囊中基板（BP）前体细胞的技术。尽管基因操作能够提供有价值的见解，但由此产生的表型可能具有多效性，从而导致结果解释困难。这一问题在内耳发育后期尤为突出，因为在该阶段，细胞骨架重塑等基本过程在细胞分裂、组织形态发生以及细胞特化中均发挥多重作用。本文还提供了在培养的组织块中进行药物抑制的实验方案，该方法在控制药物剂量、处理时机和持续时间方面具有优势，可实现对发育机制的精确时空调控。
根据小分子抑制剂处理时间的不同，可采用多种器官培养方法。本文展示了两种器官培养方法，可用于研究上皮形态发生及细胞特化过程。其中一种方法是利用胶原作为基质进行耳蜗管的三维培养，可实现耳蜗支持细胞（BP）的稳定培养并进行活体观察。为研究静纤毛的形成，我们介绍了一种膜培养方法，该方法将上皮组织培养在刚性基质上，使肌动蛋白突起能够自由生长。这两种方法均适用于后续分析，如活细胞成像、免疫组织化学、扫描电子显微镜（SEM）、细胞记录等。这些技术为有效利用鸡作为模式系统，研究和调控禽类听觉上皮的发育、成熟与再生提供了可行方案。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1081061</td><td>高保真 Cas9 蛋白</td></tr><tr><td>Anti-GFP 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>兔多克隆抗 GFP 抗体</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q12135</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型胶原蛋白，大鼠尾部来源</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM CPD300 临界点干燥仪</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUY-21 电穿孔仪</td><td>Nepagene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DM5000B 宽场显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含 GlutaMAX 添加剂和丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FLUOVIEW 3000 激光扫描显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊二醛 (25 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG 二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG 二抗，Alexa Fluor 594 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 二抗，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>无菌过滤山羊血清</td><td>HiMedia</td><td>RM10701</td><td>经热灭活处理</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>LSM980 Airyscan 显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell 细胞培养小室，30 mm，亲水性 PTFE，0.4 &amp;micro;m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>MVX10 体视显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MYO7A 抗体</td><td>DSHB</td><td>138-1</td><td>小鼠单克隆抗非常规肌球蛋白-VIIa 抗体</td></tr><tr><td>MZ16 解剖显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂 (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Noyes 剪刀，14 cm (5.5'')</td><td>World Precision Instruments</td><td>501237</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇 (4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PC-10 拉针仪</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcU6_1sgRNA</td><td>Addgene</td><td>92395</td><td>带有修饰型鸡 U6 启动子的微型载体</td></tr><tr><td>青霉素 G 钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>SMZ1500 解剖显微镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 M 二甲胂酸钠缓冲液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>HiMedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>K550X 溅射镀膜仪</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准玻璃毛细管，3 英寸，外径 1.0 mm，无纤维丝</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS MERLIN Compact VP</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硫代碳酰肼</td><td>Alfa Aesar</td><td>L01205</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

in ovo 与 ex ovo 研究禽类内耳发育的方法

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

内耳通过耳蜗和前庭感知声音并维持平衡。这一功能依赖于一种特化的机械感觉细胞，即毛细胞。内耳的基础研究已使人们深入理解了毛细胞的功能机制，以及其功能失调如何导致听力丧失和眩晕。在这些研究中，小鼠一直是占主导地位的模式系统。然而，与所有哺乳动物一样，小鼠已丧失了再生毛细胞的能力。因此，在探索恢复内耳功能的细胞治疗策略时，对其他脊椎动物物种开展互补性研究可能提供进一步的见解。鸟类的听觉上皮——基底乳头（basilar papilla, BP），是一层由机械感觉毛细胞（HCs）和支持细胞（SCs）交替排列组成的上皮结构。尽管基底乳头与哺乳动物耳蜗在解剖结构上存在差异，但两者在内耳发育和听觉的分子机制方面具有相似性。这使得基底乳头不仅适用于比较研究，也适用于再生机制的研究。本文描述了鸡内耳的解剖与操作技术，包括基因操作和小分子抑制方法，这些方法为研究内耳发育的分子机制提供了有力工具。我们讨论了在鸡胚内进行in ovo电穿孔的技术，利用CRISPR-Cas9介导的基因删除对基底乳头进行遗传干扰，随后分离基底乳头。此外，我们还展示了基底乳头的器官培养方法以及培养基质的优化使用，以观察上皮和毛细胞的发育过程。

在电穿孔实验装置中，电极的位置可能影响转染区域。正极置于卵黄下方，负极置于胚胎上方（图1A）。这导致内耳大部分区域以及两个前庭器官（图1B）和听觉基底乳头（图1C，D）中绿色荧光蛋白（GFP）表达增强，证实实现了转染。
在评估CRISPR敲低后的表型时，我们设计了针对毛细胞转录因子Atonal同源物1（Atoh1）的向导RNA。Atoh1基因突变的小鼠无法形成毛细胞32；在将Atoh1向导RNA电转染入样本并培养至E10后，我们发现与对照组（空质粒对照）相比，毛细胞的发育受到显著抑制（图2）。尽管电转染呈嵌合分布（图2E、F），但对照组中被电转染的细胞仍能正常发育为毛细胞。...

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

内耳通过耳蜗和前庭感知声音并维持平衡。这一功能依赖于一种特化的机械感受细胞，称为……

年龄、感染以及耳毒性药物可导致内耳毛细胞退化，从而引起听力损失。在非哺乳动物脊椎动物（如鸡）中，毛细胞能够再生。本文所述技术利用了鸡胚实验成本低、胚胎易获取以及组织外植体体外发育良好的优势。了解鸟类内耳毛细胞的发育与再生过程，可为听力损失及其潜在治疗方法提供重要见解，而器官培养技术对于评估各种药物的耳毒性效应具有重要意义。实验开始前，获取 freshly laid eggs，并用70%乙醇进行表面清洁，以防止污染。将鸡蛋置于37至38摄氏度、相对湿度45%的条件下孵育3.5至4天。孵育后，将鸡蛋侧放五分钟，使胚胎重新定位到卵黄的上方。然后用镊子在鸡蛋顶端的钝端打一个小孔，以便21号针头穿过。使用5毫升注射器和21号针头，从鸡蛋钝端的小孔中抽出2毫升蛋清。用透明胶带封住钝端的孔。为了制作蛋窗，将透明胶带贴在蛋壳顶部。使用垂直拉针仪，从标准玻璃毛细管中制备显微注射用的针头。拉制完成后，使用精细镊子折断毛细管尖端，以获得尖端直径约50微米、呈锥形的尖端。对于基因敲除实验，将三种质粒——即引导质粒pcU6.1sgRNA、T2KeGFP和T2TP——按1:1:1的比例混合，并加入1微克SP Cas9蛋白、30%蔗糖和0.1%快绿染料，最终体积为10微升。在进行多个质粒的电穿孔时，确保DNA的终浓度至少为每微升4微克。借助弹簧剪剪开一个长约2厘米、宽约1.5厘米的窗口，暴露胚胎。然后用镊子打开覆盖在胚胎上方的绒毛膜，以便接触胚胎。注射约200纳升的DNA溶液混合物，使听泡充满。为了确定向导RNA的效率，进行T7核酸内切酶检测。向胚胎中加入0.719%生理盐水液滴，以降低电阻并防止过热。接着，将正极电极穿过在卵钝端所打的孔插入，并移动电极，使其位于卵黄下方。将负极电极置于充满液体的耳囊上方。使用方波脉冲发生器，通过电穿孔将质粒转染至听泡内，施加5次25伏、每次100毫秒的脉冲，脉冲间隔50毫秒。具体电穿孔条件应根据各自的实验装置通过经验确定。电穿孔后，加入几滴0.719%生理盐水以使胚胎水化。用透明胶带封闭蛋壳，然后将其放回37至38摄氏度的湿化培养箱中继续孵育。使用70%乙醇和加热方法对手术台、显微镜载物台及周围区域进行消毒，或用酒精对显微解剖器械进行灭菌，包括微型弹簧剪、微型刮匙以及两对精细镊子。准备解剖用培养皿，包括底部为黑色硅胶的玻璃培养皿、90 毫米塑料培养皿和 60 毫米培养皿。准备好预冷的 PBS 或汉克斯平衡盐溶液（Hanks' balanced salt solution，简称 HBSS），用于解剖操作。将鸡蛋轻轻敲破，倒入 90 毫米培养皿中。然后识别鸡胚的外耳，并将头部转移至一个盛有冰冻 PBS 的 60 毫米培养皿中。接着，调整胚胎方向，使喙的顶端朝内，并用一把 5 号镊子夹住喙部。用另一把 5 号镊子挖出眼睛。然后，从头侧到尾侧，沿颅骨中线切开，并取出脑组织。加入更多冰冻的PBS或HBSS，找到位于耳蜗管末端且靠近中线的两个亮晶晶的球状结构，即球囊耳石。为分离两个内耳，需在两个球囊之间以及该区域的上方和下方进行切割。然后在斜射光下观察内耳的轮廓，去除多余组织和前庭。将分离出的耳蜗转移至含有冰冻 PBS 的黑色硅胶底板上。使用5号镊子剥离软骨性耳蜗囊，以获取耳蜗导管。然后定位耳蜗管的波状层或称耳蜗管覆膜，并使用55号镊子将其移除，以暴露基底乳头或BP。接下来，使用55号镊子去除盖膜，暴露毛细胞和支持细胞。对于基底乳头的膜培养，取一个六孔组织培养板，每孔放置一个培养膜插入物。用200微升移液器吸取适量培养基，然后用含有一倍HBSS缓冲液的移液器吸取已解剖的基底乳头外植体。将外植体转移至膜上，并调整其方向，使基底乳头朝上，从顶部可清晰观察到毛细胞和支持细胞。外植体定位后，缓慢吸去培养膜表面的HBSS缓冲液。在此过程中，外植体将附着于培养膜上。向六孔板的孔中加入1.2毫升达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM培养基），使液体位于膜插件与孔壁之间。为制备耳蜗管的胶原培养，在四孔板的每孔中加入三滴 freshly prepared 胶原混合液，并将解剖得到的耳蜗管转移至每滴胶原液中。将培养板置于37°C、5%二氧化碳条件下孵育10分钟，以固化胶原基质。对于培养物的小分子处理，将培养基更换为700微升添加了药理学调节剂（如青霉素）的培养基，并按照之前所述条件孵育培养板。每天更换50%的培养基。经过适当的孵育时间后，移除培养基，并将外植体用于后续检测。在电穿孔实验装置中，正确的电极定位导致内耳前庭器官和听觉基底乳头中均出现较高的GFP表达，证实了转染成功。通过CRISPR Cas9介导的内耳Atoh1基因敲除导致毛细胞丢失。在卵内电穿孔后孵育至E10阶段，Atoh1基因敲除组与空质粒对照组相比，毛细胞发育减少。尽管电穿孔具有嵌合性，但对照组电穿孔细胞仍能形成毛细胞。在转染Atoh1 gRNA的样本中，绿色荧光蛋白阳性细胞从未表现出毛细胞发育的标记物。将基底乳头器官在三维基质（如胶原）中进行培养，并使用针对毛细胞抗原的抗体进行染色，可良好地维持组织形态长达五天。在这些培养条件下，毛细胞和支持细胞的排列结构得以保持。膜上的器官培养物可维持长达五天，同时保持毛束的完整性。从代表性图像中顶端连接蛋白原钙黏蛋白15的定位情况可以观察到这一点。为了研究毛细胞束的发育，可采用更高分辨率的成像技术，例如超分辨率显微镜或扫描电子显微镜，以获取更详细的信息。整个操作过程中应保持无菌条件。电穿孔时，需确保胚胎不会干燥。在滴定药理学抑制剂时，可降低其浓度以克服可能的致死效应。胚胎和外植体均可用于成像实验。可通过实时视频显微镜观察，或如本方案所示，进行静态光镜共聚焦电子显微镜观察。鉴于使用鸡胚内耳外植体操作简便且易于获取，我们可通过培养基筛选来鉴定对毛细胞再生至关重要的新分子。

in-ovo-and-ex-ovo-methods-to-study-avian-inner-ear-development

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

在蛋 和 卵外 研究中研究鸟类内耳发育的方法

本文介绍了一种简单的技术，可用于实现禽类胚胎的长期体外培养。ex-ovo...

一种适用于成像与显微手术应用的ex-ovo鸡胚培养系统

为了评估中脑多巴胺能神经元发育过程中基因的功能及其调控机制，我们描述了一种方法，该方法涉及将质粒DNA构建体进行卵内电穿孔转染至鸡胚中脑腹侧多巴胺能神经元前体细胞中。in ovo...

in ovo 鸡胚中脑电穿孔技术用于研究多巴胺能神经元发育中基因功能

异位表达是阐明微小RNA在脑发育中作用的一种技术。然而，利用该方法靶向特定区域时存在 在卵内...

In ovo 鸡胚腹侧中脑中 microRNA 的表达

本文介绍了一种显微解剖技术，随后将荧光染料注射至早期鸡胚的听觉神经节，以选择性示踪听觉轴突纤维在神经及后脑中的走行。...

选择性示踪鸟类胚胎前庭耳蜗神经中的听觉纤维

在发育过程中观察和接触鸡胚具有一定的挑战性。我们开发了一种简单、经济的体外培养（ex ovo）方法，可广泛应用于课堂教学或科研环境。该方法能够使研究者在胚胎发育的较晚阶段（HH...

优化的 体外培养 培养鸡胚胎至发育的较晚阶段

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法...

通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。...

在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

本文介绍了一种用于培养鸡胚胎器官的器官型培养方案 体外...

研究鸡胚胎组织发育的器官型培养方法

本文介绍了一种获取鸡胚非冠状位听觉脑干切片的实验方案，用于在单个脑干切片中研究听觉频率拓扑特性（tonotopic...

切片胚胎鸡听觉脑干以评估音调拓扑梯度与微环路

我们采用了标准的听觉脑干反应（ABR）技术，并将其应用于雏鸡，这是一种听觉功能的早熟鸟类模型。该方案详细阐述了动物准备和ABR信号采集的技术步骤，这些步骤可推广至其他鸟类或啮齿类动物模型。...

雏鸡听觉脑干反应的评估

本方案面向小鼠内耳组织的初学者，全面详述了针对不同发育阶段的小鼠内耳组织进行切片免疫染色的处理步骤。...

冷冻切片与免疫染色小鼠内耳组织：从胚胎期到成年期

了解鸟类内耳发育与毛细胞再生的分子机制，使用鸡胚模型进行卵内电穿孔和离体培养实验。该方法为听力损失治疗研究提供重要见解，并可用于评估药物的耳毒性效应。

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

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