Name: 小鼠星形胶质细胞的分离和直接神经元重编程 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: 学习从小鼠中枢神经系统分离高纯度星形胶质细胞并进行直接神经元重编程的方法。该方案通过转录因子强制表达将星形胶质细胞转化为功能性神经元，为研究神经可塑性和神经退行性疾病治疗提供可靠技术。

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我们感谢Ines Mühlhahn在重编程载体构建方面的贡献，Paulina Chlebik在病毒制备方面的帮助，以及Magdalena Götz和Judith Fischer-Sternjak对本手稿提出的修改意见。

以下操作步骤遵循德国慕尼黑亥姆霍兹中心（Helmholtz Zentrum Munich）的动物护理指南，符合欧盟关于用于科学目的动物保护的指令2010/63/EU。请确保遵守实施解剖操作所在机构的动物护理指南。
1. 解剖、解离和培养材料的准备
注意：所有培养试剂均需在生物安全柜内配制，并仅使用经高压灭菌或无菌的器械进行操作。解剖和解离试剂可在生物安全柜外配制。
<ol>
	<li>通过将T25培养瓶用聚-D-赖氨酸（储存液1 mg/mL；工作液20 µg/mL）溶于H2O中，至少包被2小时来准备培养瓶。之后用H2O冲洗3次，并风干。</li>
	<li>通过将5 mL的1 M HEPES缓冲液加入500 mL的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中来制备解离缓冲液。</li>
	<li>每处理六根脊髓准备一个C管（见材料表），向其中加入1950 µL神经组织解离试剂盒中的缓冲液X（见材料表）。解剖过程中置于冰上保存。通过每C管加入20 µL缓冲液Y和10 µL缓冲液A（属于神经组织解离试剂盒；见材料表）制备酶消化主混合液。充分混匀后于4 °C保存，待用时取出。</li>
	<li>制备含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液（1×PBS），并置于冰上。通过向485 mL DMEM/F12培养基中加入5 mL青霉素-链霉素（终浓度100 U/mL）、5 mL 45% D-葡萄糖和5 mL谷氨酰胺补充剂（终浓度2 mM；见材料表）来制备基础培养基。基础培养基在4 °C下可稳定保存4周。</li>
	<li>通过向44 mL基础培养基中加入1 mL B27补充剂和5 mL胎牛血清（FBS）来制备星形胶质细胞培养基。使用前向适量培养基中添加表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（各10 ng/mL）。</li>
	<li>脊髓组织解剖时，使用一对弯头大镊子、一对弯头小镊子、一对直头小镊子、一把小剪刀和一把小刮勺。</li>
</ol>
2. 星形胶质细胞的分离
<ol>
	<li>从出生后小鼠的脊髓中分离星形胶质细胞，用于将其直接重编程为功能性神经元（图1A）。本方案中，采集出生后第2至第3天小鼠的脊髓组织，每次实验采集六至八根脊髓用于星形胶质细胞的分离。该方案同样适用于从中枢神经系统的其他区域（如大脑皮层、中脑和小脑）分离星形胶质细胞；对于这些区域，应在出生后第5至第7天获取细胞。 
	&#8203;注意：若需从本方案未提及的其他脑区分离星形胶质细胞，其取材年龄和组织来源需通过实验自行确定。</li>
</ol>
3. 脊髓组织解剖
注意：组织解剖可在生物安全柜外进行。
<ol>
	<li>在 P2-P3 期通过断头法处死小鼠，无需对动物进行麻醉。将躯干置于 35 mm 培养皿中，并置于冰上保存。</li>
	<li>用剪刀切开皮肤，用小剪刀取出脊椎，分离脊髓，并将其放入冰上的解剖缓冲液中。在体视显微镜下（放大倍数为 2 倍）使用镊子去除分离的脊髓上的脑膜，然后将解剖并清洁后的脊髓组织转移至 C-tube 中。</li>
</ol>
4. 磁珠激活细胞分选（MACS）
<ol>
	<li>向每个C管中加入50 µL神经组织解离试剂盒中的酶P（见材料表）以及30 µL预先配制的酶混合液。将C管倒置，并放置于加热解离仪上（见材料表），确保所有组织均收集在管盖中。</li>
	<li>运行37_NTDK_1解离程序，运行时间约为22分钟。在程序即将结束前，将70 µm细胞筛网（见材料表）置于与所用C管数量相等的15 mL离心管上，并用2 mL预冷的PBS润湿筛网。在整个MACS过程中，将1x PBS置于冰上保存。</li>
	<li>程序结束后，取出C管并短暂离心，使组织沉降至管底。将解离后的组织通过筛网转移至已准备好的15 mL离心管中。筛网保留在15 mL离心管上。</li>
	<li>用10 mL 1x PBS冲洗C管以回收残留组织，并再次通过筛网收集至同一15 mL离心管中。将含有解离组织的15 mL离心管在室温下以300 x g离心10分钟。 
	注意：此步骤后需将离心机预冷至4 °C。</li>
	<li>在不扰动细胞沉淀的前提下吸除上清液，然后将细胞重悬于80 µL 1x PBS中；加入&#160;10 µL小鼠抗ACSA-2微珠试剂盒中的封闭试剂（见材料表）。用移液器轻轻吹打混匀。</li>
	<li>在4 °C避光孵育10分钟（冰箱中）。加入10 µL偶联抗星形胶质细胞表面抗原-2的微珠&#160;（见材料表），用移液器轻轻吹打混匀。在4 °C避光孵育15分钟。</li>
	<li>加入3 mL 1x PBS洗涤细胞，并在4 °C以300 x g离心10分钟。离心期间，将适当数量的磁性分选柱（见材料表）安装到磁力分离器上（见材料表），并在其下方放置15 mL收集管。用500 µL 1x PBS预洗分选柱。</li>
	<li>吸除上清液，将细胞重悬于500 µL 1x PBS中，然后将细胞悬液转移至磁性分选柱中，依靠重力自然流下。用500 µL 1x PBS冲洗15 mL离心管，并将冲洗液加至分选柱中。再用500 µL 1x PBS对分选柱进行两次额外冲洗。</li>
	<li>将分选柱从磁力分离器上取下，加入800 µL星形胶质细胞培养基，并使用配套的推杆将细胞从柱中推出，完成洗脱。</li>
	<li>将细胞接种至预先准备的培养瓶中，加入4.2 mL含EGF和bFGF的星形胶质细胞培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养。 
	注意：从其他脑区分离的星形胶质细胞无需包被培养瓶，但脊髓来源的星形胶质细胞在包被后的培养基质上生长更佳。</li>
	<li>培养细胞约7天，直至达到汇合状态（80%-90%）。若7天后细胞未汇合，可继续培养至最多10天再进行传代。超过10天后，细胞增殖能力下降，重编程效率也随之降低。</li>
</ol>
5. 星形胶质细胞重编程的接种
注意：以下步骤必须在生物安全等级1级（SL1）的生物安全柜中进行。
<ol>
	<li>以与之前准备培养瓶相同的方法，用多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片准备24孔板。为确定所需板数，需考虑星形胶质细胞在24孔板中的接种密度为每孔 5-5.5 × 104 个细胞。通常，从6只P2小鼠的脊髓中分离可获得约1 × 106 个细胞。</li>
	<li>吸去含有培养星形胶质细胞的T25培养瓶中的培养基，并用1× PBS洗涤一次。加入0.5 mL 0.05%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育5分钟，使星形胶质细胞从培养瓶表面脱落。轻轻敲击培养瓶侧面以促进细胞脱落，并在10倍物镜下使用明场显微镜检查细胞脱落情况。</li>
	<li>加入2.5 mL星形胶质细胞培养基以终止胰蛋白酶消化作用，将细胞悬液收集至15 mL离心管中。以300 × g 离心5分钟，吸去上清液，用1 mL星形胶质细胞培养基重悬细胞。使用血细胞计数板或自动细胞计数系统测定细胞浓度。</li>
	<li>根据细胞数量，用新鲜星形胶质细胞培养基将细胞悬液稀释至每毫升含1-1.1 × 105 个细胞。向培养基中添加EGF和bFGF，每种因子终浓度为10 ng/mL。向预先准备好的24孔板的每孔中加入500 µL细胞悬液（相当于5-5.5 × 104 个细胞），于37 °C、5% CO2 条件下培养。</li>
</ol>
6. 转录因子的强制表达
注意：在开始实验方案之前，必须合理设计实验。特别是，重编程实验必须包含阴性对照，即不表达任何重编程因子的条件。例如，当使用携带重编程因子cDNA和报告基因（如绿色荧光蛋白（GFP）、DsRed）的载体时，阴性对照应为仅携带报告基因的相同载体。当表达携带不同报告基因的多个因子时，阴性对照应相应地进行调整。
<ol>
	<li>铺板后的第二天，检查24孔板，确保细胞已贴附在盖玻片上。</li>
	<li>根据实验目的和可用资源，重编程因子的强制表达可通过病毒转导（见步骤6.3）或DNA转染（见步骤6.4）实现。 
	注意：使用逆转录病毒或慢病毒须获得政府主管部门批准，且必须在生物安全二级（SL2）实验室的生物安全柜内进行操作。</li>
	<li>通过逆转录病毒或慢病毒转导细胞，以导入表达目的重编程因子所需的遗传信息，从而对星形胶质细胞进行重编程，具体步骤如下所述。
	<ol>
		<li>以高病毒滴度（1 x 10）转导细胞10-1 × 1012 通过将1 µL细胞悬液直接加入星形胶质细胞培养基中，使病毒颗粒浓度达到每毫升若干颗粒，以确保高感染率。根据实验目的，将细胞在含病毒颗粒的星形胶质细胞培养基中于37 °C培养24–36小时，随后进行第7节或第8节操作。 
		注意：可使用不同的启动子来驱动转基因的表达（另见代表性结果）。组成型启动子（如 CMV、CAG）诱导转基因表达的时间早于可诱导型启动子；然而，这两类启动子均已成功用于将细胞重编程为神经元。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 质粒也可被导入星形胶质细胞 通过 如下所述进行DNA转染。 
	注意：此步骤可在符合安全等级1（SL1）标准的生物安全柜中进行。
	<ol>
		<li>转染前，准备好转染试剂、含有目标构建物的质粒DNA、新鲜的星形胶质细胞培养基以及减血清培养基（参见 材料表）。计算所需血清减量培养基的量（参见 材料表) 考虑到24孔板的每孔需要300 µL的低血清培养基，将适量的低血清培养基加入50 mL离心管中，并预热至37 °C。</li>
		<li>当无血清培养基温热后，吸出所有孔中的星形胶质细胞培养基，并收集至50 mL离心管中。使用0.45 µm注射器滤器过滤收集的星形胶质细胞培养基，以去除脱落的细胞。</li>
		<li>向过滤后的培养基中加入等体积的新鲜星形胶质细胞培养基，以获得每孔可添加1 mL星形胶质细胞培养基的溶液。将星形胶质细胞条件培养基置于37 °C培养箱中保存至使用（步骤6.4.9）。 
		注意：培养基被重复使用，因为它含有多种支持细胞存活的分泌因子。</li>
		<li>向每个孔中加入300 µL预热的低血清培养基，将24孔板放回培养箱中。</li>
		<li>配制溶液A，包含DNA和减血清培养基。每孔使用总量为0.6 µg的DNA，将其加入50 µL减血清培养基中。溶液A于室温保存，待用。 
		注意：通常每个条件设置三个技术重复。因此，需配制足够进行3.5次反应的混合液（例如，将2.1 µg总DNA溶于175 µL低血清培养基中），以确保有足够的材料转染24孔板中的三个孔。</li>
		<li>配制溶液B，由转染试剂和减血清培养基组成。每孔将0.75 µL转染试剂加入50 µL减血清培养基中。由于该溶液适用于所有转染条件，建议批量配制以减少不同转染之间的差异。</li>
		<li>将溶液B在室温下孵育5分钟。以1:1的比例将溶液B逐滴加入溶液A中，轻轻混匀。切勿涡旋。将溶液A+B在室温下于通风橱中孵育20-30分钟。</li>
		<li>对所有转染条件重复步骤6.4.5–6.4.7。20–30分钟后，将溶液A+B逐滴加入每孔，终体积为100 µL。轻轻摇动培养板，将细胞放回37 °C培养箱中孵育4小时。</li>
		<li>孵育4小时后，移除转染培养基，加入1 mL 步骤6.4.3中制备的预温星形胶质细胞条件培养基。根据实验目的，继续培养细胞36–48小时，随后进行第7节或第8节的操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 星形胶质细胞重编程（7 天分析）
<ol>
	<li>通过将1 mL B27添加剂加入49 mL基础培养基中制备神经元分化培养基（见步骤1.4）。根据细胞是否经过转导或转染（分别见步骤6.3和6.4），在24–48小时后，将每孔中的星形胶质细胞培养基更换为1 mL神经元分化培养基，并将细胞置于37 °C、9% CO₂条件下继续培养2. 
	注意：细胞也可在5% CO₂条件下保存2 若无9% CO2 培养箱可用。然而，在这些条件下，神经元重编程的效率更高。</li>
	<li>可选：为提高重编程效率，在将星形胶质细胞培养基更换为神经元分化培养基时，补充Forskolin（终浓度30 µM）和Dorsomorphin（终浓度1 µM）。若选择使用Forskolin和Dorsomorphin处理细胞，则在首次处理后2天追加一次Dorsomorphin，直接加入培养基中。</li>
	<li>小鼠星形胶质细胞直接重编程为神经元细胞通常在换液后7天内发生。因此，在启动神经元重编程7天后，固定或收集细胞用于后续分析。</li>
</ol>
8. 星形胶质细胞重编程为成熟神经元（长期培养）
<ol>
	<li>通过将1 mL B27补充剂加入49 mL基础培养基中（见步骤1.4）来制备神经元分化培养基。根据细胞是否经过转导或转染（分别见步骤6.3和6.4），在24–48小时后，将星形胶质细胞培养基更换为每孔1 mL含有Forskolin（终浓度30 µM）和Dorsomorphin（终浓度1 µM）的神经元分化培养基，并在37 °C、9% CO2条件下培养细胞。 
	注意：若无9% CO2培养箱，也可在5% CO2条件下培养。但在该条件下，神经元重编程效率较低。</li>
	<li>在初次处理后的第2天，通过直接将Dorsomorphin加入神经元分化培养基中，重复一次Dorsomorphin处理。</li>
	<li>从神经元重编程开始第7天起，制备成熟培养基：将6 µL N2、1.2 µL NT3（储存液20 µg/mL）、1.2 µL BDNF（储存液20 µg/mL）、1.2 µL GDNF（储存液20 µg/mL）以及1.2 µL cAMP（储存液100 mM）加入189.2 µL神经元分化培养基中。向每孔现有的神经元分化培养基中添加200 µL成熟培养基。 
	注意：成熟培养基仅在首次处理时添加。后续所有处理均按以下所述部分更换神经元分化培养基进行。</li>
	<li>每周两次，通过移除200 µL神经元分化培养基并加入200 µL新鲜成熟培养基的方式重复小分子处理，持续最多6周。在成熟过程中，可于第21天或之后对细胞进行电生理实验，或固定细胞用于下游分析（如免疫荧光）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

小鼠星形胶质细胞的原代培养是一种卓越的方法 体外 研究直接神经元重编程的模型系统。事实上，尽管这些细胞是在出生后阶段分离的，但仍表达典型的星形胶质细胞标志物29，保留模式形成基因的表达28,29，并保持增殖能力，类似于 体内 同龄的星形胶质细胞38经MACS分离后，细胞首先贴附于培养瓶，随后开始增殖，从而获得高度富集的星形胶质细胞培养物29重要的是，培养的星形胶质细胞不会去分化为多能细胞状态，也不会获得永生化特性。此外，在表达报告蛋白（如 DsRed 或 GFP）后，这些细胞不会自发产生神经元，而是维持星形胶质细胞的身份。同时，它们不会无限增殖，而是增殖速度逐渐减慢，并向更成熟的阶段过渡，从而降低其直接重编程为神经元的潜能。32,39</s...

哺乳动物的中枢神经系统（CNS）高度复杂，包含数百种不同类型的细胞，其中包括大量不同的神经元亚型1,2,3,4,5,6。与其他器官或组织7,8,9不同，哺乳动物的中枢神经系统再生能力极为有限；创伤性脑损伤或神经退行性病变导致的神经元丢失是不可逆的，常导致运动和认知功能障碍10。为了恢复脑功能，目前正深入研究多种替代丢失神经元的策略11。其中，将体细胞直接重编程为功能性神经元的方法正成为一种有前景的治疗手段12。直接重编程，又称转分化，是指将一种已分化的细胞类型直接转化为另一种细胞身份，而不经过中间的增殖状态或多能状态13,14,15,16。该方法最初由发现MyoD1因子足以将成纤维细胞转化为肌细胞而开创17,18，此后已成功应用于将多种细胞类型重编程为功能性神经元19,20,21。
星形胶质细胞，中枢神经系统中最丰富的巨胶质细胞22,23，是直接神经元重编程的一种极具前景的细胞类型，原因如下。首先，它们在中枢神经系统中分布广泛且均匀，可提供充足的 原位 新生神经元的来源。其次，星形胶质细胞与神经元在发育上关系密切，因为在胚胎发育过程中它们拥有共同的祖先细胞——放射状胶质细胞24两种细胞类型具有共同的胚胎起源，这似乎比来自不同胚层细胞的重编程更有利于神经元转化。19,21此外，星形胶质细胞通过其放射状胶质细胞起源所获得的模式化信息在成年星形胶质细胞中也得以维持25,26,27，并且似乎有助于生成具有区域特异性的神经元亚型28,29,30因此，研究并理解星形胶质细胞向神经元的转化，是实现该技术在基于细胞替代治疗策略中全部潜力的重要组成部分。
转化 体外 将培养的星形胶质细胞转化为神经元已在直接神经元重编程领域取得多项突破，包括：i）鉴定出足以从星形胶质细胞生成神经元的转录因子15,19,31，ii) 在相同细胞环境下由不同重编程因子触发的分子机制的解析32，以及 iii) 强调星形胶质细胞发育起源对诱导不同神经元亚型的影响28,29,33此外， 体外 星形胶质细胞的直接转化揭示了限制直接神经元重编程的多个主要障碍34,35，例如活性氧（ROS）生成增加34 星形胶质细胞与神经元线粒体蛋白质组之间的差异35因此，这些观察结果有力地支持将星形胶质细胞的原代培养物作为直接神经元重编程的模型，用于研究生物学中的多个基本问题12，涉及细胞身份维持、阻碍细胞命运转变的障碍，以及代谢在重编程中的作用。
本文介绍了一种从出生后（P）小鼠中分离星形胶质细胞的详细方案，可获得极高纯度的细胞，已通过从小鼠脊髓中分离星形胶质细胞得到验证29我们还提供了将星形胶质细胞重编程为神经元的实验方案 通过 病毒转导或DNA质粒转染。重编程细胞可在转导后7天（7 DPT）进行分析，以评估重编程效率和神经元形态等指标，也可在培养中维持数周，以评估其随时间的成熟情况。值得注意的是，本方案并非特异针对脊髓星形胶质细胞，可直接应用于分离来自其他多种脑区的星形胶质细胞，包括大脑皮层灰质、中脑和小脑。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐（DAPI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG1 Alexa 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21240</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG1 生物素</td><td>Southernbiotech</td><td>Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG2b Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 Alexa 546</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11010</td><td></td></tr><tr><td>Aqua Poly/Mount 封片剂</td><td>Polysciences</td><td>Cat# 18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Life Technologies</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# A9418</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0260</td><td></td></tr><tr><td>C-Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>背侧形态发生素（Dorsomorphin）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5499</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAN Biotech</td><td>P30-3302</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林（Forskolin）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Dako</td><td>Cat# Z0334; RRID: AB_100013482</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000（转染试剂）</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 11668019</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer 70&amp;micro;m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 ACSA-2 MicroBead 试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-678</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG1 抗突触素 1</td><td>Synaptic Systems</td><td>Cat# 101 011 RRID:AB_887824)</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 IgG2b 抗 Tuj-1（&amp;beta;III-微管蛋白）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>MS 柱</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>N2 添加剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>神经组织解离试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>NT3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>octoMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM &amp;ndash; GlutaMAX（低血清培养基）</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 51985-026</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1149</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 RFP</td><td>Rockland</td><td>Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 Sox9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# AB5535; RRID:AB_2239761</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素 Alexa 405</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# S32351</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# T9284</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠星形胶质细胞的分离与直接神经元重编程

Isolation and Direct Neuronal Reprogramming of Mouse Astrocytes

直接神经元重编程是一种强大的技术，能够将不同起始细胞群体直接转化为功能性神经元，而无需经过多能性中间阶段。该技术不仅在疾病建模领域具有广阔前景——例如可将患有神经退行性疾病患者的成纤维细胞转化为神经元——同时也为基于细胞的替代疗法提供了极具潜力的替代方案。在此背景下，一项重要的科学突破在于证实中枢神经系统内已分化的非神经细胞（如星形胶质细胞）亦可被转化为功能性神经元。 体外。自那时起， 体外 星形胶质细胞直接重编程为神经元的研究已为揭示强制性细胞身份转换背后的分子机制以及阻碍高效重编程的障碍提供了重要见解。然而，来自 体外&#160;由于不同实验室在分离、培养和重编程星形胶质细胞时所采用的方法存在差异，导致实验结果难以相互比较。本文中，我们描述了一种详细的实验方案，可从出生后小鼠中枢神经系统的不同脑区可靠地分离和培养高纯度的星形胶质细胞。 通过 磁性细胞分选。此外，我们提供了将培养的星形胶质细胞重编程为神经元的实验方案 通过 病毒转导或DNA转染。该简化且标准化的实验方案可用于研究细胞身份维持的分子机制、新神经元身份的建立，以及特定神经元亚型的生成及其功能特性。

星形胶质细胞的原代培养通常在经过MAC分选并接种后7至10天内达到80%–90%的融合度（图1B）。一般情况下，一个T25培养瓶可获得约1–1.5 × 106个细胞，足以在每孔接种密度为5–5.5 × 104个细胞时接种20–30个盖玻片。接种后第二天，细胞通常覆盖盖玻片表面的50%–60%（图1C）。在此阶段，培养物几乎完全由星形胶质细胞组成，而其他细胞类型（如成神经细胞）几乎不存在（图1D）29。
重编程因子可递送至星形胶质细胞，方式包括 通过 逆转录病毒或慢病毒转导，或通过DNA质粒转染。通常，与转染相比，病毒转导可感染更多的细胞。由于直接神经元转化会导致大量细胞死亡34,35</sup...

本文介绍了一种详细的实验方案，用于培养出生后小鼠中枢神经系统不同区域来源的高度富集的星形胶质细胞，并通过强制表达转录因子将其直接转化为功能性神经元。

直接神经元重编程是一种强大的方法，可将不同起始细胞群体直接转化为功能性神经元，而无需经过多能性状态。

星形胶质细胞是直接神经元重编程的一个有趣自体细胞群体。本方案提供了一种可靠的技术，用于从中枢神经系统不同区域分离培养高纯度的星形胶质细胞。该方案经过设计与优化，旨在研究星形胶质细胞在无混杂因素（例如不同起始细胞群体间星形胶质细胞纯度差异）干扰下重编程为功能性神经元的能力。演示该操作的人员为实验室博士后 Bob Hersbach 以及本实验室技术助理 Tatiana Simon。首先，将已实施安乐死的小鼠躯干置于直径 35 毫米的培养皿中，并置于冰上保存。使用剪刀切开皮肤，再用小剪刀取出椎骨。然后取出脊髓并将其置于冰上的解剖缓冲液中。在具有两倍放大倍数的体视解剖显微镜下，使用镊子去除分离的脊髓上的脑膜，并将解剖干净的脊髓组织转移至C管中。向每根C管中加入50 µL神经组织解离试剂盒中的酶P以及30 µL预先配制好的酶混合液。将C管倒置并放置在加热的解离装置上，确保所有组织均收集于管盖内。通过从分离器上取下柱子，加入800 µL星形胶质细胞培养基，并使用附带的推杆将细胞从柱中洗脱出来。将细胞接种至预先准备好的培养瓶中，加入4.2 mL星形胶质细胞培养基，该培养基需添加10 ng/mL的EGF和bFGF。从其他脑区分离的星形胶质细胞无需包被培养瓶，但脊髓来源的星形胶质细胞需要包被以提供更佳的贴壁基质。将细胞置于37°C、5% CO₂条件下培养。在生物安全等级一级的生物安全柜内进行星形胶质细胞接种操作，并按照文本稿件中的描述，准备含Poly-D-Lysine包被的玻璃盖玻片的24孔板。进行铺板时，从 P2 小鼠中分离六根脊髓可获得约 100 万个细胞。吸除含有培养星形胶质细胞的 T-12.5 培养瓶中的培养基，并用 1× PBS 洗涤一次。加入 0.5 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA，于 37°C 孵育 5 分钟，使星形胶质细胞从培养瓶上脱离。轻轻敲击培养瓶侧面，使细胞从培养瓶表面脱落，并在显微镜下使用10倍物镜通过明场观察细胞脱落情况。加入2.5毫升星形胶质细胞培养基终止消化，将细胞悬液收集至15毫升离心管中。在4°C下以300 ×g离心5分钟。吸去上清液，并将细胞重悬于1 mL星形胶质细胞培养基中。使用血细胞计数板或自动细胞计数系统计算细胞浓度。根据细胞数量，用新鲜的星形胶质细胞培养基稀释细胞悬液，培养基中需添加EGF和bFGF，每种因子浓度为10 纳克/毫升。向先前准备好的24孔板的每个孔中加入500微升细胞悬液，并在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养细胞。通过将1毫升B27添加剂加入49毫升基础培养基中，制备神经元分化培养基。根据细胞是否已进行转导或转染，在24至48小时后，将每孔中的星形胶质细胞培养基更换为1毫升神经元分化培养基。将细胞置于37摄氏度、9%二氧化碳条件下培养。为提高重编程效率，在用神经元分化培养基替换星形胶质细胞培养基时，向其中添加佛司可林和Dorsomorphin，使其终浓度分别为30微摩尔和1微摩尔。若选择使用佛司可林和Dorsomorphin处理细胞，则在初次处理两天后追加一次Dorsomorphin剂量。将第二种处理直接加入培养基中。星形胶质细胞的原代培养物在磁力辅助细胞分选并接种后7至10天内达到80%至90%的融合度。接种后的第二天，细胞通常覆盖盖玻片表面的50%至60%。此阶段的培养物主要由星形胶质细胞组成，而其他细胞类型（如神经母细胞）几乎不存在。在转导或转染后的第七天，诱导的神经元细胞已可明显区别于星形胶质细胞。神经元细胞的胞体比未重编程的星形胶质细胞小，具有较长的突起，并表达神经元标志物 beta three tubulin，而不表达星形胶质细胞标志物 GFAP。转导或转染后21天，许多诱导神经元能够产生动作电位，并且对成熟神经元标志物NeuN和突触泛蛋白Synaptophysin呈阳性。必须正确分离目标区域，避免周围组织的污染。必须小心去除分离的脊髓上的软脑膜和背根神经节。该方法可用于从中枢神经系统的不同区域（包括大脑皮层、中脑背侧和小脑）分离星形胶质细胞。未来，该技术将有助于拓展我们对区域性星形胶质细胞及其重编程为功能性神经元潜力的认识。

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科研

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神经科学

小鼠星形胶质细胞的分离和直接神经元重编程

在本视频中，我们介绍了从新生小鼠中获取纯化星形胶质细胞的方法。...

星形胶质细胞分离：一种获取小鼠皮层星形胶质细胞纯品的方法

该视频展示了一种从其他脑细胞中分离培养小鼠星形胶质细胞的简单方法。在培养过程中，通过使用星形胶质细胞特异性培养基并抑制非星形胶质细胞的贴壁，该方法可选择性地培养星形胶质细胞。这些培养的星形胶质细胞呈现星状形态，并具有细长的突起。...

一种分离和培养小鼠星形胶质细胞的简易技术

本视频展示了表达转化因子的星形胶质细胞直接重编程为神经元的过程。转化因子触发一系列分子事件，促进星形胶质细胞向神经元的转化。通过神经元分化培养基提供特定试剂和补充物，进一步支持该过程的进行。...

小鼠星形胶质细胞直接重编程为神经元

来源：Pereira, M. et. al., 通过脑内注射病毒载体在体内直接重编程常驻胶质细胞为中间神经元。J. Vis. Exp.

小鼠模型中胶质细胞重编程的立体定位病毒载体注射

星形胶质细胞已被确认为多功能细胞，参与多种基本生物学过程，在正常脑发育、功能维持及中枢神经系统修复中发挥重要作用。本文介绍一种快速获取纯化小鼠星形胶质细胞培养物的实验流程，用于研究这类主要中枢神经系统细胞的生物学特性。...

小鼠皮层星形胶质细胞的分离与培养

表型正常的星形胶质细胞和神经干细胞取自携带floxed条件性致癌等位基因的基因工程小鼠，通过病毒介导的Cre重组进行转化，可用于建立星形细胞瘤发病机制的模型 体外 和 体内...

星形细胞瘤发病机制建模 体外 和 体内 利用条件性基因工程小鼠的皮层星形胶质细胞或神经干细胞

我们修改并实施了一项先前发表的方案，该方案描述了将人 诱导 多能干细胞（hiPSCs）快速、可重复且高效地分化为兴奋性皮层神经元的方法12。具体而言，我们的改进可实现对神经元细胞密度的控制，并可在微电极阵列上应用，以在神经网络水平上检测其电生理特性。...

利用微电极阵列测量网络活性的诱导多能干细胞快速神经元分化

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外...

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

本实验方案的总体目标是指导如何从中枢神经系统中提取、培养和分离小鼠星形胶质细胞和小胶质细胞，随后用原生动物寄生虫进行感染。...

同时分离原代星形胶质细胞和小胶质细胞用于原生动物寄生虫感染研究

星形胶质细胞在大脑皮层中均匀分布，这使得在细胞水平上分析其复杂形态具有挑战性。本方案采用基于子宫内电穿孔的多色标记方法，以标记单个皮层星形胶质细胞，并结合用户友好的图像分析流程，对其体积和形态进行分析。...

子宫内电穿孔法将多靶点基因组整合彩色（MAGIC）标记递送至个体小鼠皮层星形胶质细胞

本方案概述了从成年小鼠脊髓中分离纯化星形胶质细胞和小胶质细胞的方法，可用于后续的RNA分析和细胞培养等应用。方案包括详细的细胞解离方法及操作步骤，旨在提高分离细胞的质量和得率。...

从成年小鼠脊髓中分离纯化的星形胶质细胞和小胶质细胞 体外 检测与转录组学研究

学习从小鼠中枢神经系统分离高纯度星形胶质细胞并进行直接神经元重编程的方法。该方案通过转录因子强制表达将星形胶质细胞转化为功能性神经元，为研究神经可塑性和神经退行性疾病治疗提供可靠技术。

小鼠星形胶质细胞的分离与直接神经元重编程

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