Name: 远红荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针，用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: 学习使用多参数流式细胞术快速检测化疗诱导的衰老肿瘤细胞，通过双标记物提高检测可靠性，并可富集衰老细胞用于下游分析。该方法适用于培养癌细胞系和肿瘤样本。

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感谢芝加哥大学细胞计量学与抗体核心设施在流式细胞仪设备方面提供的支持。芝加哥大学动物研究中心提供了动物饲养服务。

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<li>Kasper, M., Barth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bleomycin+and+its+role+in+inducing+apoptosis+and+senescence+in+lung+cells+-+modulating+effects+of+caveolin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Cancer+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Bleomycin and its role in inducing apoptosis and senescence in lung cells - modulating effects of caveolin-1.</a> Current Cancer Drug Targets. 9 (3), 341-353 (2009).</li>
<li>Muthuramalingam, K., Cho, M., Kim, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+EMT+crosstalk+in+bleomycin-induced+pathogenesis+of+pulmonary+fibrosis-an+in+vitro+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and EMT crosstalk in bleomycin-induced pathogenesis of pulmonary fibrosis-an in vitro analysis.</a> Cell Biology International. 44 (2), 477-487 (2020).</li>
<li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism%2C+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).</li>
<li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16%28INK4a%29-luciferase+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li>
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<li>González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

作者声明本研究无任何利益冲突。

近十年来，由于肿瘤免疫学的兴起、流式细胞仪成本降低以及高校研究机构共享仪器设施的不断完善，流式细胞术已成为癌症研究中更为常见的检测平台。目前，多色检测已成为常规，因为大多数新型仪器均配备了紫光、蓝绿光以及红光至远红光的光学阵列。因此，本DDAOG方案可能适用于多种流式细胞仪。当然，任何流式细胞仪都应由用户自行评估。在向DDAOG检测中添加额外的荧光染料（例如荧光标记的偶联抗体）时需格外谨慎。应使用单染对照样本，在所有其他相关检测通道中观察荧光信号，以评估通道间的荧光串扰。若发现信号重叠，可按照常规方法进行光谱补偿20以校正。
本文所示的研究结果主要旨在证明，DDAOG流式细胞术检测可用于快速、定量且易于解读化疗药物在细胞或肿瘤中诱导的治疗诱导性衰老（TIS）效应。本研究中使用的试剂，包括ETO23,24、DOX7,...

衰老细胞通常在正常生物衰老过程中随着时间推移在生物体内逐渐积累，但也可能在肿瘤细胞中因放疗和化疗等癌症治疗所诱导的损伤而迅速形成。尽管治疗诱导的衰老（TIS）肿瘤细胞已失去增殖能力，但仍可能促进治疗耐药性并导致肿瘤复发1,2,3。TIS细胞分泌的因子可通过促进免疫逃逸或转移来加剧肿瘤的恶性程度4,5。TIS细胞会发展出复杂的、依赖于微环境的表型，代谢谱发生改变，并产生独特的免疫应答6,7,8。因此，识别和表征由不同癌症治疗手段诱导的TIS肿瘤细胞，一直是癌症研究领域持续关注的课题。
为了检测TIS肿瘤细胞，常规的衰老检测方法被广泛应用，其主要原理是检测衰老标志酶——溶酶体β-半乳糖苷酶GLB1活性的升高9。在接近中性（而非酸性）的溶酶体pH条件下进行检测，可特异性地识别与衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）10。一种已使用数十年的标准SA-β-Gal检测方法采用X-Gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷）作为显色性β-半乳糖苷酶底物，通过光学显微镜在固定细胞中检测SA-β-Gal的存在11。X-Gal检测法利用常规试剂和实验室设备，可对TIS进行定性的视觉确认。评估蓝色显色产物仅需一台基本的透射光显微镜。然而，X-Gal染色法的灵敏度可能不足，有时需要超过24小时才能显色。染色后需在光学显微镜下对表现出不同程度蓝色显色的单个衰老细胞进行低通量、主观的计数评分。由于X-Gal不能穿透细胞膜，该方法需要使用溶剂固定的细胞，因而无法回收细胞用于后续分析。在处理来自动物或患者的有限样本时，这可能是一个重大缺陷。
已有文献报道了使用细胞渗透性荧光酶底物改进的SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测方法，包括C12-FDG（5-十二烷酰氨基荧光素二-β-D-半乳吡喃糖苷，绿色）和DDAOG（9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基) β-D-半乳吡喃糖苷，远红光）12,13,14,15。DDAOG的化学探针结构及其光学特性见补充图S1。这些细胞渗透性探针可用于活细胞（而非固定细胞）的分析，且荧光探针相较于显色探针更便于利用快速高通量的荧光分析平台，如高内涵筛选仪器和流式细胞仪。分选型流式细胞仪能够从细胞培养物或肿瘤组织中分离富集的活体衰老细胞群体，用于后续分析（例如蛋白质印迹、ELISA或组学分析）。荧光分析还可提供定量信号，从而更准确地确定特定样本中衰老细胞所占的比例。此外，还可方便地加入其他荧光探针，如细胞活性探针和荧光标记抗体，以实现对SA-β-Gal以外靶标的多重分析。
与DDAOG类似，C12-FDG也是一种用于检测SA-β-Gal的荧光探针，但其绿色荧光发射会与细胞内在的自发荧光（AF）重叠，这种自发荧光在细胞衰老过程中由于脂褐素聚集体在细胞内的积累而产生16。通过使用远红光DDAOG探针，绿色细胞自发荧光可作为第二个参数来确认细胞衰老状态17。这种方法通过引入第二个标志物，提高了检测的可靠性，因为单独使用SA-β-Gal作为衰老标志物时常存在不可靠性18。由于检测衰老细胞中内源性自发荧光是一种无需标记的方法，因此可快速、简便地扩展基于DDAOG的检测方法的特异性。
在此方案中，我们展示了使用 DDAOG 和 AF 作为快速、双参数流式细胞术检测方法，用于从 TIS 肿瘤细胞中鉴定活细胞 体外 培养物或从小鼠体内经药物处理的肿瘤中分离图1）。该方案所使用的荧光染料适用于多种市售的标准流式细胞仪分析仪和分选仪（表1). 可通过标准流式细胞术分析对存活衰老细胞的百分比进行定量。根据需要，可选择进行免疫标记步骤，以同时检测细胞表面感兴趣的抗原与衰老状态。已鉴定的衰老细胞还可利用标准的荧光激活细胞分选（FACS）方法进行富集。
<img alt="药物处理流程图；体外/体内；流式细胞术；TIS起始；实验设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程图。 该示意图总结了DDAOG检测的关键步骤。(A) 将诱导治疗性衰老（TIS）的药物加入哺乳动物细胞培养体系，或给予荷瘤小鼠。随后给予足够时间以启动TIS：对于细胞，在给药后培养4天；对于小鼠，共22天，每5天给药一次，共三次，之后恢复7天。收集细胞或将肿瘤组织解离成单细胞悬液。(B) 样品先用Baf处理30分钟，以调节溶酶体pH，便于检测SA-β-Gal；然后加入DDAOG探针孵育60分钟，用于检测SA-β-Gal。样品用PBS洗涤两次，再短暂加入活细胞染料（15分钟）。可选步骤：可在可用的荧光通道中使用荧光标记抗体进行染色，和/或固定样品以备后续分析。(C) 使用标准流式细胞仪分析样品。在点图中显示活细胞的红色DDAOG信号（代表SA-β-Gal）与绿色自发荧光信号（脂褐素）。根据未处理的对照样品（未显示）设定门控，以确定TIS细胞的百分比。若使用分选型流式细胞仪（FACS），可收集TIS细胞并重新接种培养，用于进一步的in vitro实验，或裂解后进行分子生物学检测。缩写：DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)；DDAOG = DDAO-半乳糖苷；TIS = 治疗诱导性衰老；FL-Ab = 荧光素偶联抗体；Baf = 巴佛洛霉素A1；SA-β-Gal = 衰老相关β-半乳糖苷酶；PBS = 磷酸盐缓冲液；FACS = 荧光激活细胞分选。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>荧光染料</td>
			<td>检测目标</td>
			<td>激发/发射波长 (nm)</td>
			<td>流式细胞仪激光器 (nm)</td>
			<td>流式细胞仪检测器 / 带通滤光片 (nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDAOG</td>
			<td>SA-β-Gal</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF</td>
			<td>脂褐素</td>
			<td>&lt; 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CV450</td>
			<td>细胞活性</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE</td>
			<td>抗体/表面标志物</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：荧光染料与流式细胞仪的光学参数。 本方案中使用的流式细胞仪参数针对配备4个激光器和15个发射检测器的仪器列出。在645/660 nm处检测到的DDAOG为SA-β-Gal1酶切后的探针形式。未切割的DDAOG可能在460/610 nm处产生微弱荧光，但可通过本方案中的洗涤步骤去除。缩写：DDAO = 9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮)；DDAOG = DDAO-半乳糖苷；AF = 自发荧光；PE = 藻红蛋白；SA-β-Gal = 衰老相关β-半乳糖苷酶。

<table><tbody><tr><td>巴佛洛霉素 A1</td><td>Research Products International</td><td>B40500</td><td></td></tr><tr><td>博来霉素硫酸盐&amp;nbsp;</td><td>Cayman</td><td>13877</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>US Biological</td><td>A1380</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Violet 450 AM 活性染料</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0854-39</td><td>eBioscience</td></tr><tr><td>DPP4 抗体，PE 偶联物</td><td>Biolegend</td><td>137803</td><td>克隆 H194-112</td></tr><tr><td>细胞系：A549 人肺腺癌细胞</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>细胞系：B16-F10 小鼠黑色素瘤细胞</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网，100 &amp;micro;m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>DDAO-半乳糖苷</td><td>Life Technologies</td><td>D6488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>多柔比星盐酸盐注射液 (USP)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0069-3032-20</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇化脂质体多柔比星 (USP)</td><td>Sun Pharmaceutical</td><td>NDC 47335-049-40</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>依托泊苷&amp;nbsp;</td><td>Cayman</td><td>12092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega&amp;nbsp;</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Fc 受体阻断试剂</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>抗小鼠 CD16/32</td></tr><tr><td>流式细胞仪（细胞分析仪）</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Various</td><td>LSRFortessa</td></tr><tr><td>流式细胞仪（细胞分选仪）</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Various</td><td>FACSAria</td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Lonza</td><td>BW17737</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Sigma</td><td>5401020001</td><td>Roche</td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td>Dulbecco's PBS（不含钙和镁）</td></tr><tr><td>Rainbow 校准微粒，超套装</td><td>SpheroTech</td><td>UCRP-38-2K</td><td>3.5-3.9 &amp;micro;m，2E6/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 0.9% (USP)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪数据采集软件，&quot;FACSDiva&quot;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>n/a</td><td>联系 BD 获取许可证</td></tr><tr><td>流式细胞仪数据分析软件，&quot;FlowJo&quot;</td><td>TreeStar</td><td>n/a</td><td>联系 TreeStar 获取许可证</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-114</td><td></td></tr></tbody></table>

远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

细胞衰老是一种由生物损伤诱导的增殖停滞状态，通常在衰老细胞中随着年龄增长历经数年逐渐积累，但也可能在肿瘤细胞中迅速出现，作为对多种癌症治疗所诱导损伤的应答。肿瘤细胞的衰老通常被认为是一种不利现象，因为衰老细胞会获得抗凋亡特性，阻碍肿瘤缓解，并加剧肿瘤的恶性程度和治疗耐药性。因此，识别衰老的肿瘤细胞一直是癌症研究领域关注的重点。目前已存在多种衰老检测方法，其中许多基于一种广为人知的衰老标志物——衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）的活性。
通常，SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）检测使用显色底物（X-Gal）在固定细胞上进行，通过光学显微镜对“蓝色”的衰老细胞进行缓慢且主观的计数。近年来，已开发出改进的检测方法，采用细胞通透性荧光SA-β-Gal底物，如C12-FDG（绿色）和DDAO-半乳糖苷（DDAOG；远红光），可实现对活细胞的分析，并适用于包括流式细胞仪在内的高通量荧光分析平台。C12-FDG是SA-β-Gal的一种已有充分文献记录的探针，但其绿色荧光发射光谱与细胞固有的自发荧光（AF）重叠，而这种自发荧光在衰老过程中会因脂褐素聚集体的积累而增强。通过使用远红光SA-β-Gal探针DDAOG，可将绿色自发荧光作为第二个参数用于确认细胞衰老状态，从而提高检测的可靠性。其余的荧光通道可用于细胞活力染色或可选的荧光免疫标记。
利用流式细胞术，我们展示了使用 DDAOG 和脂褐素自发荧光作为双参数检测方法来鉴定衰老的肿瘤细胞。可对存活衰老细胞的百分比进行定量分析。根据需要，可选择性加入免疫标记步骤，以检测特定的细胞表面抗原。鉴定出的衰老细胞还可通过流式细胞术进行分选和收集，用于后续分析。收集到的衰老细胞可立即裂解（例如用于免疫检测或组学分析），也可进一步培养。

进行了多项实验以比较DDAOG与X-Gal及C12-FDG在SA-β-Gal检测衰老中的可比性。首先，使用X-Gal对经ETO诱导的衰老B16-F10黑色素瘤细胞进行染色（图2A）。在部分经ETO处理的细胞中出现了强烈的蓝色，而其他细胞则呈现较弱的蓝色染色。大多数经ETO处理的细胞形态增大。使用荧光SA-β-Gal底物C12-FDG（绿色）或DDAOG（远红）对经ETO处理的细胞进行染色，结果显示其染色模式和强度变化与X-Gal相当（图2B）。然而，绿色C12-FDG的发射光与细胞自发荧光（AF）重叠（图2C），而自发荧光已知会在衰老细胞中积累17。相比之下，DDAOG的远红发射波段中自发荧光几乎可忽略不计。
与使用荧光显微镜对衰老细胞进行计分和计数相比，利用流式细胞仪的高通量能力在短时间内（...

本文介绍了一种通过荧光流式细胞术定量检测化疗药物在细胞培养或小鼠肿瘤模型中诱导的衰老癌细胞的实验方案。可选步骤包括共免疫染色、样本固定以方便大批量或多个时间点的分析，以及通过流式细胞分选富集存活的衰老细胞。

细胞衰老是一种由生物损伤诱导的增殖停滞状态，这种损伤通常在衰老细胞中经年累积，但也可能在其他情况下出现……

我们的多参数流式细胞术方案能够快速且更高效地检测肿瘤细胞中由治疗诱导的衰老状态，这种状态在癌症生物学和治疗研究中正受到广泛关注。与现有的基于显微镜的检测方法相比，我们的流式细胞术衰老检测方法更为快速。我们采用两种标志物而非单一标志物来识别衰老细胞，从而提高了检测的可靠性。可通过荧光抗体对细胞进行共染色，以检测其他感兴趣的靶标。利用流式细胞术分选可富集衰老细胞群体，用于后续分析。该检测方法可在培养的肿瘤细胞系中，或在经轻柔解离后的完整肿瘤样本中检测到衰老细胞。在尝试本技术之前，必须熟悉所用流式细胞仪的一般操作程序。有关推荐的流式细胞仪规格，请参阅正文。在药物诱导衰老前一天，使用 0.25% 胰蛋白酶 EDTA 收获癌细胞系培养物。将细胞置于 37 摄氏度下 5 分钟以激活胰蛋白酶，并使细胞单层脱离。当观察到单层细胞明显脱落时，加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液转移至无菌的锥形管中。使用标准血细胞计数板方法计数细胞，并记录每毫升的细胞数量。在标准六孔塑料培养板中，以每平方厘米1×10³至10×10³个细胞的密度接种细胞。将培养板置于37°C、含5%二氧化碳及湿度的环境中孵育过夜。第二天，用目标的衰老诱导剂（如依托泊苷）处理细胞。随后孵育四天，以诱导细胞衰老的发生。每天在光学显微镜下观察细胞，检查是否出现预期的形态学变化。衰老开始后，加入胰蛋白酶-EDTA，在37摄氏度下作用5分钟，收集细胞。当细胞解离成悬浮状态时，用等体积的完全培养基中和胰蛋白酶。将每孔细胞悬液转移至1.7毫升微量离心管中。再次计数细胞，并将等量的细胞分装到一组新试管中。在4°C条件下，以1,000 ×g离心5分钟，弃去上清液。首先，通过向细胞沉淀中加入含1 µM巴佛洛霉素A（bafilomycin A）的DMEM溶液，调节培养细胞样品的溶酶体pH值，细胞浓度为每毫升1×10⁶个细胞，用移液器吹打混匀。在37摄氏度下，以缓慢速度在旋转仪上孵育30分钟。随后，为进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色，无需洗涤样本，直接加入终浓度为每毫升10微克的DDAOG储存溶液。避光条件下，在旋转仪上继续孵育60分钟。同前，离心试管，弃去上清液，并用1毫升冰预冷的含0.5% BSA的PBS溶液洗涤沉淀。然后向洗涤后的细胞沉淀中加入300微升稀释的Calcein Violet 450 AM溶液。置于冰上避光孵育15分钟。将细胞样品转移至适用于流式细胞仪的试管中。在数据采集软件中，打开一个紫色通道直方图以及一个远红通道对绿色通道的散点图。以低进样速度启动流式细胞仪的数据采集，并将用DDAOG染色的阳性对照样品置于进样口。开始采集样本数据。调整通道电压，使每个图中包含超过90%的事件。当所有设置达到最佳状态后，每份样本记录10,000个事件。将仅含载体且用 DDAOG 染色的对照样品置于进样口。启动数据采集，每份样品记录 10,000 个事件。观察自发荧光（AF）和 DDAO-半乳糖苷信号相较于阳性对照是否升高。将样本数据保存为 fcs 文件格式，并将文件导出至配备流式细胞术分析软件的工作站计算机。使用流式细胞术数据分析软件，加载所有采集样本的 fcs 数据文件。首先，为圈选活细胞，双击仅含溶剂对照样本的数据，以打开其数据窗口。将数据以紫色通道直方图形式可视化。活细胞经CV 450染色后，其荧光强度高于死细胞，因此呈现更亮的荧光信号。使用单门直方图工具绘制门控区域，仅包含活细胞。将门命名为“活细胞”。然后将活细胞门从样本布局窗口拖动到其他细胞样本上，以统一应用该门。打开布局窗口。在布局窗口中，将所有样本以紫色通道的直方图形式可视化。验证各样本的活细胞设门是否恰当，若不恰当，则根据需要进行调整。接下来，为了圈选衰老细胞，双击仅含载体的对照组中已圈选的活细胞数据，以打开其数据窗口。然后将数据以远红通道对绿色通道的散点图形式展示。使用矩形圈选工具，在右上象限中圈选DDAO阳性与AF阳性细胞比例低于5%的区域。将门命名为“衰老细胞”。然后将衰老细胞门拖动到样本布局窗口中所有样本的活细胞子集上，以统一应用该门。将所有经过活细胞门选后的子集拖放到布局窗口中。将所有可存活样本以远红光通道与绿色通道的散点图形式可视化，并观察结果。确保在所有图中均可见衰老细胞门控，且仅含载体的对照组门控内衰老细胞比例低于5%。分析至此完成。现在可以根据需要以图形和表格形式导出数据。与未处理的细胞相比，由依托泊苷诱导的衰老B16-F10黑色素瘤细胞表现出扩大的形态以及因衰老相关β-半乳糖苷酶水平升高导致X-gal裂解而产生的蓝色染色。使用荧光C12FDG或DDAOG对依托泊苷处理的细胞进行染色，显示出与X-gal相似的染色模式和强度变化。然而，有研究表明，未染色的衰老细胞中会积累与绿色C12FDG发射光重叠的细胞自发荧光。相比之下，DDAOG的远红发射波段中的自发荧光通常可忽略不计。本文展示了用于散点图的流式细胞仪数据采集设置、五峰商用彩虹荧光校准微球以及染色细胞的单通道荧光数据。DDAOG流式细胞仪衰老检测数据显示，依托泊苷诱导的B16-F10黑色素瘤细胞发生治疗诱导性衰老（TIS）的比例为存活细胞的35%，而衰老细胞清除剂ABT-263几乎完全消除了TIS细胞。在A549肺癌细胞中，博来霉素诱导的TIS发生在66%的存活细胞中，而ABT-263将该比例降低至15%。ABT-263单独使用对未经处理的增殖细胞无毒性。在抗体共染色实验中，PE通道数据的直方图显示，42%经依托泊苷处理的细胞对衰老标志物DPP4阳性。此外，通过二维点图可视化分析表明，44%的依托泊苷处理细胞同时对DDAOG和DPP4呈双阳性，而仅使用溶剂处理的细胞中双阳性比例为4%。接下来评估了DDAOG染色细胞的固定效果。与未固定的对照样品相比，固定样品在未处理细胞中表现出略高的背景信号，并且在博来霉素（BLM）处理的细胞中，被判定为衰老细胞的百分比更高。该效应在固定后于4°C条件下保存过夜或一周的样品中同样存在。文中展示了通过形态学特征和增殖标志物对富集的衰老细胞群体进行流式细胞术分选及验证结果。如预期所示，经分选的衰老细胞表现出增大的形态，通过荧光标记的鬼笔环肽染色肌动蛋白进行观察。免疫荧光染色也显示增殖标志物Ki67的信号减少。最后，对经化疗药物处理的肿瘤中衰老细胞的比例进行了定量分析。组织中的 X-gal 染色相对较弱，但在经阿霉素或聚乙二醇化脂质体阿霉素处理的肿瘤中可见明显的蓝色染色，尤其是在那些通过 DDAO-半乳糖苷流式分析也判定为衰老阳性的肿瘤中更为明显。与预期一致，仅用生理盐水处理的肿瘤表现出可忽略不计的衰老。与任何活细胞实验一样，本实验方案的步骤应高效但轻柔地进行。应避免延长染色步骤或超过所述时间的孵育。若通过流式细胞术分选衰老细胞，则可将其重新放入培养体系中用于免疫检测，或进行裂解并用于组学分析，包括转录组学或蛋白质组学分析。该技术已使本实验室及其他实验室能够鉴定衰老肿瘤细胞的新特征，包括DNA损伤的定量、蛋白质表达以及代谢变化。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

远红荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针，用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

本视频展示了一种基于流式细胞术的检测方法，用于通过双衰老标志物定量治疗诱导的衰老癌细胞。衰老细胞的检测与定量涉及使用β-半乳糖苷酶底物。该底物被衰老细胞内活跃的溶酶体β-半乳糖苷酶切割，产生荧光产物，结合自发荧光的脂褐素颗粒，共同标记衰老的癌细胞。...

基于流式细胞术的治疗诱导癌细胞衰老定量分析

细胞衰老是抑制还是促进肿瘤发生目前仍存在争议。由于化疗药物可诱导癌细胞发生衰老，因此研究细胞衰老对于提出新的治疗策略至关重要。然而，目前广泛使用的标准β-半乳糖苷酶检测方法存在诸多局限性。本文提出一种基于流式细胞术的快速、灵敏的检测方法，用于定量细胞衰老。...

一种定量衰老癌细胞的灵敏方法

细胞内活性氧（ROS）已被证明在细胞衰老的诱导过程中发挥重要作用。本文介绍了一种用于定量细胞衰老过程中ROS水平的高灵敏度检测方法。同时，我们还提供了检测衰老相关分泌表型的实验方案，该表型据称与多种与年龄相关的功能障碍有关。...

正常人成纤维细胞在癌基因诱导衰老过程中活性氧与衰老相关分泌表型的定量检测

细胞衰老是慢性年龄相关性疾病发生的关键因素。靶向衰老细胞的治疗策略在延长健康寿命方面展现出广阔前景。本文介绍一种基于单细胞水平检测衰老相关β-半乳糖苷酶活性的新型筛选方法，用于鉴定senotherapeutics（抗衰老药物）。...

基于SA-β-半乳糖苷酶的筛选实验用于识别衰老细胞清除药物

本文介绍了一种基于流式细胞术的单细胞水平多重衰老相关标志物的可视化与定量分析方法。...

同时成像与基于流式细胞术的多重荧光衰老标志物检测在治疗诱导的癌细胞衰老中的应用

本方案介绍了利用反射光共聚焦显微镜对从人脂肪组织中分离的基质血管组分进行衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性的客观、单细胞水平检测。该方法可与免疫细胞化学染色兼容，包含pH对照以实现定量评估，并且相较于传统的SA-β-gal染色，具有更高的灵敏度和更低的主观性。...

使用反射光检测脂肪基质血管组分中的衰老现象

本文介绍了一种活细胞LysoTracker实验方案，用于检测IMR-90人成纤维细胞衰老过程中溶酶体的重塑变化。...

利用LysoTracker进行溶酶体示踪分析以定量评估人成纤维细胞的细胞衰老

本文介绍了一种高效筛选方案，用于鉴定可促进胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向星形胶质细胞分化的...

基于流式细胞术的药物筛选系统用于鉴定促进胶质母细胞瘤干细胞分化的小分子

本方案旨在从含有非靶标背景细胞的混合物中分离并制备稀有靶细胞，用于单细胞水平的分子遗传学表征。所获得的DNA质量与未经处理的单细胞相当，适用于单细胞分析（包括基于筛查和靶向分析的应用）。...

靶细胞预富集与全基因组扩增用于单细胞下游分析

小鼠原位胰腺导管腺癌同种移植瘤免疫表型分析的实验步骤旨在对肿瘤免疫微环境进行特征分析。通过手术将肿瘤原位植入小鼠体内。收获体积为200–600...

通过流式细胞术对小鼠原位同系移植（同源性）KPC 胰腺导管腺癌进行免疫表型分析

学习使用多参数流式细胞术快速检测化疗诱导的衰老肿瘤细胞，通过双标记物提高检测可靠性，并可富集衰老细胞用于下游分析。该方法适用于培养癌细胞系和肿瘤样本。

远红光荧光衰老相关β-半乳糖苷酶探针用于通过流式细胞术鉴定和富集衰老肿瘤细胞

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