食蟹猴视网膜器官型外植体培养

本研究建立的灵长类视网膜模型为深入探究cGMP-PKG依赖性视网膜退变的全面机制及治疗开发提供了有力工具。该非人灵长类个体模型保留了视网膜组织结构的完整性及细胞间相互作用，能够更真实地模拟体内环境。同时，该模型减少了动物使用量，并缩短了实验周期。

为研究视网膜发育或退行性变提供对照实验方法。开始制备视网膜外植体时，用10毫升5%聚维酮碘溶液清洗从野生型猕猴中分离的眼球，持续30秒。为避免细菌污染，将眼球浸入5%青霉素-链霉素PBS溶液中1分钟，随后在10毫升R16培养基中孵育5分钟。

然后将眼球浸入10毫升预热至37摄氏度的蛋白Ace-K溶液中，孵育2分钟。接着在10毫升1:1的R16与胎牛血清混合溶液中孵育5分钟。最后用10毫升新鲜的R16溶液进行终末洗涤。

操作完成后，分离巩膜、角膜、虹膜、晶状体和玻璃体。然后用镊子和剪刀从四个方向切下视网膜。接下来，使用4 mL三锋刀片，从鼻侧距视神经乳头1.5 mm、颞侧4 mm以及上下方各2 mm处切割视网膜外植体。

然后使用6毫米细锯片切割含有视盘和黄斑的视网膜外植体中央侧。用宽口移液管吸取包含视网膜和脉络膜的视网膜外植体，将其放置在插入物中央，感光细胞层朝上。将视网膜完全浸入膜下方培养板中1毫升的完全培养基内。

将视网膜外植体进行培养，并置于37摄氏度、含加湿5%二氧化碳的培养箱中。对外植体给予适当浓度的药物处理，持续四天。每种处理条件至少使用三个外植体，并以未加药物的外植体作为阳性对照。

用于固定和冷冻切片时，将视网膜外植体用一毫升多聚甲醛处理45分钟。随后用一毫升磷酸盐缓冲液短暂漂洗，再将外植体依次在10%蔗糖中孵育10分钟、20%蔗糖中孵育20分钟、30%蔗糖中孵育30分钟。将视网膜外植体均匀切割，周边分为四个象限，中心保留六毫米。

然后将视网膜外植体转移至一个约1.5 × 1.5 × 1.5厘米的锡盒中，加入适量切割最佳温度化合物包埋介质覆盖外植体。立即用液氮冷冻组织切片，并置于-20 °C冰箱中保存。接着，将琼脂修整成包含组织样本的小块。

用软毛刷将组织块切成10 µm的切片，并将其置于防脱载玻片上。然后在40 °C下干燥45分钟，之后于-80 °C保存备用。对于环磷酸鸟苷（cGMP）染色，使用液相阻断笔在干燥的视网膜切片周围画出疏水圈，并覆盖样本。

将切片浸入200微升含0.3% PBS的Triton-X100溶液（PBST）中，孵育10分钟，随后在室温下用200微升封闭液处理1小时。接着，将样本切片与200微升用封闭液配制的一抗溶液在4摄氏度下4℃孵育过夜，并用PBS洗涤三次，每次10分钟。最后，在室温下将切片与200微升二抗溶液孵育1小时。

用 PBS 每次 10 分钟清洗三次后，将样本覆盖含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，并在 4 摄氏度下保存至少 30 分钟，然后进行成像。将载玻片在室温下干燥 15 分钟，并用液体阻断笔在视网膜组织样本周围画出疏水屏障环。用 40 毫升 PBS 孵育 15 分钟后，将切片置于 42 毫升 0.05 摩尔 Tris-缓冲液或 TBS 中，在 37 摄氏度下处理。

吸弃 TBS，将样品与 6 微升蛋白酶 K 孵育 5 分钟，随后用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。将载玻片置于染缸中，加入 40 毫升乙醇-乙酸溶液，覆盖透明膜，在 -20 摄氏度孵育 5 分钟。

用TBS清洗载玻片，每次5分钟，共清洗三次。每张载玻片加入200至300微升封闭液或1% BSA，于湿盒中孵育1小时。每张载玻片加入约130微升TMR红染色液，孵育1小时后，用200微升PBS清洗两次，每次5分钟。

将含有1至2滴含DAPI的抗荧光淬灭封片剂的盖玻片置于样本上，于4°C孵育至少30分钟，然后进行成像。在依次完成TUNEL和cGMP染色后，通过调整相机参数进行明场和荧光显微镜观察。使用数字相机和成像软件在20倍放大倍数下采集每张切片四个视野的图像。

使用DAPI、EGFP和TMR，通过z轴堆栈扫描（间隔为1 µm，可选1.251 µm）获取视网膜中央区域的代表性图像。在用不同浓度PDE6抑制剂扎普利司特（Zaprinast）处理的视网膜外植体中，与对照组相比，外核层中TUNEL和cGMP阳性细胞的数量显著增加。TUNEL阳性细胞占比较高表明，cGMP活性的升高可能加剧了预nest诱导的视网膜细胞变性，且cGMP的累积在光感受器变性过程中发挥一定作用。

组织块的制备应尽快进行。操作动物时应避免散射和任何积聚，因为这有助于提高细胞存活率，并改善大块组织系列中纤维的状态。在最大程度上，应使用类固醇清除玻璃体。

转移视网膜外植体时应避免接触视网膜神经纤维层，以防止机械性细胞损伤。请注意，在将视网膜外植体顺利转移至培养插件时，可预先将培养皿用适当液体浸润以保持湿润，再转移视网膜组织。此外，整个操作过程必须在无菌环境下进行，以避免操作过程中发生污染。