Name: 猕猴的器官型视网膜外植体培养物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 了解猕猴视网膜外植体培养技术，用于研究cGMP-PKG信号通路介导的视网膜退行性病变机制。该方法通过PDE6抑制剂zaprinast诱导光感受器细胞死亡，为开发视网膜疾病治疗策略提供重要实验模型。

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本研究得到中国国家自然科学基金（编号：81960180）、Zinke遗产基金会、Charlotte和Tistou Kerstan基金会以及云南眼病临床医学中心（编号：ZX2019-02-01）的资助。我们感谢中国科学院昆明动物研究所吕龙宝教授分享本研究所用的猴眼球。

动物研究已通过中国科学院动物研究所伦理审查委员会（IACUC-PE-2022-06-002）以及云南大学动物伦理审查和动物实验方案（YNU20220149）的审查与批准。
1. 视网膜外植体的制备
<ol>
	<li>获取1至3岁野生型猕猴的眼球，置于组织保存液中，并在猴子被处死或自然死亡后3小时内冰上运输。</li>
	<li>配制蛋白酶K溶液：将25 mg蛋白酶K溶解于250 µL蒸馏水中，然后取225 µL该溶液加入18.5 mL基础培养基（R16）中。</li>
	<li>用10 mL 5%聚维酮碘溶液（聚维酮碘:水 = 1:19）清洗眼球30秒，再将其浸入5%青霉素/链霉素（PEN/STREP）:磷酸盐缓冲液 = 1:19的溶液中1分钟，以避免细菌污染。随后将眼球在10 mL R16培养基中孵育5分钟。</li>
	<li>将蛋白酶K溶液预先置于37 °C培养箱中预热。然后将眼球浸入10 mL蛋白酶K溶液中孵育2分钟。接着将眼球转移至10 mL R16 + 胎牛血清（1:1）溶液中孵育5分钟，最后将眼球转入10 mL新鲜R16培养基中进行终末清洗。</li>
	<li>分离出巩膜、角膜、虹膜、晶状体和玻璃体，并用镊子和剪刀从四个方向剪下视网膜（图1A-L）。</li>
	<li>使用环钻刀将视网膜外植体切成五个部分——鼻侧、颞侧、上方和下方使用4 mm环钻刀，中央区域（包含视盘和黄斑）使用6 mm环钻刀（图1M-O）。切割位置距离视神经头分别为：鼻侧1.5 mm，颞侧4 mm，上方和下方均为2 mm。</li>
	<li>用眼睑拉钩将视网膜外植体（包含视网膜和脉络膜）转移并放置于插入物中央，感光细胞层朝上（图1P）。在培养板膜下方加入约1 mL完全培养基（R16添加BSA、转铁蛋白、孕酮、胰岛素、T3、皮质酮、维生素B1、维生素B12、视黄醇、视黄醇乙酸酯、DL-生育酚、生育酚乙酸酯、亚油酸、L-半胱氨酸盐酸盐、谷胱甘肽、谷氨酰胺、维生素C），以完全覆盖视网膜。</li>
</ol>
2. 灵长类视网膜外植体培养
<ol>
	<li>将视网膜外植体在完全培养基中培养，并置于37 °C、充有湿润5% CO2的培养箱中。</li>
	<li>向视网膜培养基中加入适当浓度的药物处理（例如，使用100 µM、200 µM或400 µM浓度的扎普司特）。每种处理条件至少使用三个外植体，并以未加药物的外植体作为对照。药物处理持续4天。</li>
</ol>
3. 固定与冷冻切片
<ol>
	<li>将视网膜外植体与1 mL多聚甲醛（PFA）孵育45分钟，用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）短暂漂洗，然后依次与10%蔗糖孵育10分钟、20%蔗糖孵育20分钟、30%蔗糖孵育30分钟（每个视网膜外植体使用1 mL溶液）。</li>
	<li>使用环钻刀片切割视网膜外植体，以确保从不同部位获取的外植体大小一致，具体要求为：周边部分分为四个象限，中央部分直径6 mm。随后，将视网膜外植体转移至锡盒（约1.5 cm × 1.5 cm × 1.5 cm）中，并用O.C.T.包埋介质覆盖组织。立即在液氮中冷冻组织切片，并置于-20 °C冰箱中保存。</li>
	<li>使用锋利刀片将琼脂修整成包含组织样本的小块，将样本块切成10 µm厚的切片，并用软毛刷将其转移至防脱载玻片上。然后在40 °C下干燥45分钟，之后于-20 °C保存备用。</li>
</ol>
4. 免疫组织化学（图2）
<ol>
	<li>cGMP 染色
	<ol>
		<li>将载玻片干燥，并用疏水性标记笔在视网膜切片周围画出疏水圈以覆盖样本。</li>
		<li>将载玻片浸入每片 200 µL 的 0.3% 磷酸盐缓冲液含吐温-20（PBST）中，室温孵育 10 分钟，随后在封闭液（5% 正常驴血清、0.3% PBST、1% BSA，每片 200 µL）中室温孵育 1 小时。</li>
		<li>将样本与一抗（1:250，羊抗 cGMP，每片 200 µL）在封闭液中 4 °C 过夜孵育，然后用 PBS 每片 200 µL 漂洗 10 分钟，重复 3 次。</li>
		<li>加入二抗（1:300，驴抗羊 Alexa Fluor 488，每片 200 µL）室温孵育 1 小时，再用 PBS 每片 200 µL 漂洗 10 分钟，重复 3 次。用含 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的抗荧光淬灭封片剂覆盖样本，4 °C 孵育至少 30 分钟后成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TUNEL 染色
	<ol>
		<li>室温干燥载玻片 15 分钟，用液体阻断笔在视网膜组织样本周围画出疏水屏障圈，随后在 40 mL PBS 中孵育 15 分钟。</li>
		<li>将载玻片置于每五张 42 mL 的 TBS（0.05 M Tris 缓冲液）中，37 °C 孵育。吸除 TBS 后，加入 6 µL 蛋白酶 K 孵育 5 分钟，然后用 TBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>将载玻片置于切片盒内的乙醇-乙酸溶液（40 mL）中，覆盖透明膜，在 -20 °C 孵育 5 分钟。随后用 TBS 漂洗 3 次，每次 5 分钟。</li>
		<li>加入封闭液（1% BSA；根据需要每片 200–300 µL），在湿盒中孵育 1 小时。</li>
		<li>按以下比例配制 TUNEL 试剂盒溶液（TMR 红色）：每张切片取 62.50 µL 封闭液（1% BSA）、56.25 µL 标记液（TMR-dUTP）和 6.25 µL 酶液。每张切片加入约 130 µL 该溶液，37 °C 孵育 1 小时，然后用 PBS 每片 200 µL 漂洗 5 分钟，重复 2 次。</li>
		<li>在样本上滴加含 1–2 滴含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂的盖玻片，4 °C 孵育至少 30 分钟后成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cGMP 染色与 TUNEL 染色联合进行
	<ol>
		<li>先进行 cGMP 染色，再进行 TUNEL 染色。依次执行步骤 4.2.1 至 4.2.5 的 TUNEL 染色步骤，然后继续执行步骤 4.1.2 至 4.1.4 的 cGMP 染色步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用以下相机参数进行明场与荧光显微镜成像：曝光时间 = 125 ms，ROI 尺寸 = 2752 x 2208，颜色 = 黑白。通过软件采集图像。每张切片使用数码相机在 20 倍放大下拍摄四个不同视野，利用 DAPI（465 nm）、EGFP（509 nm）、TMP（578 nm）获取视网膜中央区域的代表性图像，Z-Stack 扫描间隔为 1 µm，可选间隔为 1.251 µm。</li>
</ol>

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</ol>

所有作者均声明无利益冲突。

视觉光转导是指眼睛视网膜中的感光细胞将光信号转化为电信号的生物学过程。感光细胞是具有极性的神经元，能够进行光转导，根据其外段的形态可分为两种类型：视杆细胞和视锥细胞。视杆细胞负责暗视觉，而视锥细胞负责明视觉和高敏锐度视觉。遗传性视网膜变性（RD）是一类以进行性视网膜感光细胞死亡为特征的神经退行性疾病15。
目前关于RD的研究主要基于RD的小鼠模型，包括 体外 源自小鼠视网膜变性模型的视网膜外植体培养16然而，小鼠与人类之间存在显著的遗传和生理差异，尤其是在视网膜结构方面。相比之下，非人灵长类动物（NHPs）与人类具有高度相似性，因此NHP模型最适合用于视网膜变性（RD）发病机制的研究及治疗策略的开发。
在本研究中，我们建立了一种 体外 通过培养猕猴视网膜外植体建立非人灵长类动物模型。与常规的单细胞原代培养及一种 体外 永生化细胞系的培养，一种 体外 视网膜外植体...

遗传性视网膜变性（RD）的特征是感光细胞进行性死亡，由多种致病基因突变引起1。RD的最终结果是视力丧失，在绝大多数情况下，该疾病至今仍无法治疗。因此，利用能够真实模拟人类疾病状态的模型来研究导致感光细胞死亡的细胞机制显得尤为重要。在此方面，基于灵长类动物的模型因其与人类的高度相似性而具有特殊意义。值得注意的是，此类模型可能推动开发出有效的治疗干预措施，从而阻止或延缓感光细胞的死亡。
既往关于视网膜变性（RD）中细胞死亡机制的研究表明，由引发RD的基因突变导致的磷酸二酯酶6（PDE6）活性降低或丧失，会引起环磷酸鸟苷（cGMP）水解减少2,3。cGMP是视杆细胞外段（ROSs）中环核苷酸门控离子通道（CNGCs）的特异性激动剂，也是脊椎动物光感受器细胞中将光信号转化为电信号的关键分子4。cGMP水解减少会导致ROSs中cGMP积累，从而引起CNGCs开放5。其结果是光转导通路被激活，导致光感受器细胞内阳离子浓度升高。该过程给光感受器带来代谢负担，当其过度激活时（例如由PDE6基因突变引起），可能导致细胞死亡。
许多研究表明，在具有不同视网膜变性（RD）基因突变的小鼠模型中，感光细胞内环磷酸鸟苷（cGMP）的显著过度积累可能导致cGMP依赖性蛋白激酶（PKG）的激活3,6。这会引起大量凋亡的TUNEL阳性细胞增加，并导致感光细胞层逐渐变薄。先前的研究表明，由cGMP水平升高引起的PKG过度激活是诱导感光细胞死亡的必要且充分条件2,5。针对不同RD小鼠模型的研究还显示，感光细胞中因cGMP水平升高而引发的PKG激活会导致下游效应分子（如多聚ADP-核糖聚合酶1（PARP1）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）和钙蛋白酶（calpain））的过度激活2,7,8,9。这提示这些不同的靶蛋白与感光细胞死亡之间存在因果关联。
然而，以往关于放射性损伤（RD）的病理学、毒理药理学及治疗研究主要基于RD的小鼠模型10,11,12然而，这些研究成果在临床转化方面仍面临巨大困难。这主要是由于小鼠与人类之间存在显著的遗传和生理差异，尤其是在视网膜结构方面。相比之下，非人灵长类动物（NHPs）在遗传特征、生理模式以及环境因素调控方面与人类具有高度相似性。例如，已有研究在非人灵长类动物模型中探索了光遗传学疗法用于恢复视网膜活性的可行性。13Lingam 及同事证明，符合药品生产质量管理规范级别的人诱导多能干细胞来源的视网膜光感受器前体细胞可能挽救非人灵长类动物中的视锥光感受器损伤14因此，非人灵长类动物模型对于探索视网膜变性（RD）的发病机制以及开发有效的治疗方法具有重要意义。特别是那些表现出与人类相似致病机制的非人灵长类动物RD模型，在研究RD的发生和发展中可能发挥关键作用。 体内 新药毒理药理学分析
鉴于其漫长的生命周期、较高的技术难度以及高昂的成本 体内 灵长类动物模型，我们建立了 体外 使用猕猴视网膜外植体培养建立的非人灵长类动物（NHP）模型。首先，选取1-3岁野生型猕猴进行实验。 体外 视网膜外植体培养，包含视网膜-视网膜色素上皮-脉络膜复合体。将外植体用不同浓度的PDE6抑制剂扎普利纳特（100 µM、200 µM和400 µM）处理，以激活cGMP-PKG信号通路。采用TUNEL法对外植体中感光细胞的死亡情况进行定量分析，并检测外植体中cGMP的累积水平 通过 免疫荧光。鉴于猴子与人类在视网膜细胞分布与形态、视网膜层厚度以及其他生理特征方面具有高度相似性，cGMP-PKG信号通路的建立在 体外 视网膜模型可能有助于未来对视网膜脱离发病机制的研究，以及针对视网膜脱离治疗新药的开发和毒理药理学研究。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>B2064</td><td>封闭溶液</td></tr><tr><td>皮质酮</td><td>Sigma</td><td>C2505</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>DL-生育酚</td><td>Sigma</td><td>T1539</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>驴抗羊二抗，Alexa Fluor 488标记</td><td>Life technologies corporation</td><td>A11015</td><td>cGMP的二抗</td></tr><tr><td>乙醇-乙酸溶液</td><td>Shyuanye</td><td>R20492</td><td>固定液</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini</td><td>900-108</td><td>封闭溶液</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axio Imager.M2</td><td>免疫荧光成像</td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>谷胱甘肽</td><td>Sigma</td><td>G6013</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>原位细胞死亡检测试剂盒，TMR red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td>TUNEL检测</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Sigma</td><td>16634</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>C7477</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>亚油酸</td><td>Sigma</td><td>L1012</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>MACS组织保存液</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-008</td><td>新鲜器官和组织样本的优化保存</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Solarbio</td><td>SL050</td><td>封闭溶液</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Biosharp</td><td>BL539A</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100&amp;times;</td><td>Millipore</td><td>TMS-AB2-C</td><td>青霉素/链霉素抗生素</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Solarbio</td><td>P1010</td><td>缓冲溶液</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>上海利康</td><td>310411</td><td>消毒剂</td></tr><tr><td>孕酮</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>蛋白酶K</td><td>Millpore</td><td>539480</td><td>降解蛋白质</td></tr><tr><td>R16培养基</td><td>Life technologies corporation</td><td>074-90743A</td><td>基础培养基</td></tr><tr><td>视黄醇</td><td>Sigma</td><td>R7632</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>醋酸视黄酯</td><td>Sigma</td><td>R7882</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>羊抗cGMP抗体</td><td>Jan de Vente, Maastricht University, the Netherlands</td><td></td><td>cGMP的一抗</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>GHTECH</td><td>57-50-1</td><td>脱水剂</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>Tissue-Tek包埋介质（O.C.T. Compound）</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td>包埋介质</td></tr><tr><td>醋酸生育酚</td><td>Sigma</td><td>T1157</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>转铁蛋白</td><td>Sigma</td><td>T1283</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning Incorporated</td><td>3412</td><td>细胞/组织培养</td></tr><tr><td>Tris缓冲液（TBS）</td><td>Solarbio</td><td>T1080</td><td>封闭缓冲液</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Solarbio</td><td>9002-93-1</td><td>表面活性剂</td></tr><tr><td>含DAPI的VECTASHIELD封片剂</td><td>Vector</td><td>H-1200</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>维生素B1</td><td>Sigma</td><td>T1270</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>维生素B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>维生素C</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td>完全培养基添加剂</td></tr><tr><td>扎普林司特</td><td>Sigma</td><td>Z0878</td><td>PDE6抑制剂</td></tr><tr><td>Zeiss Imager M2显微镜</td><td>&amp;nbsp;Zeiss, Oberkochen,Germany</td><td></td><td>正置显微镜</td></tr><tr><td>LSM 900 Airyscan</td><td></td><td></td><td>高分辨率激光扫描显微镜</td></tr><tr><td>Zeiss Axiocam</td><td>&amp;nbsp;Zeiss, Oberkochen,Germany</td><td></td><td>数码相机</td></tr><tr><td>Zeiss Axiovision4.7</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2021 (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>来自野生型猕猴的灵长类眼球</td><td>KUNMING INSTITUTE OF ZOOLOGY</td><td>SYXK (&lt;img alt=&quot;Equation 1&quot; src=&quot;/files/ftp_upload/64178/64178eq01.jpg&quot; style=&quot;margin: auto;&quot;/&gt;) K2017 -0008</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen Pen（液体阻断笔，Diado，0010，日本）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TUNEL试剂盒溶液（货号12156792910，Roche，德国）</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

食蟹猴视网膜器官型外植体培养

Organotypic Retinal Explant Cultures from Macaque Monkey

遗传性视网膜变性（RD）的特征是感光细胞进行性死亡。在感光细胞中，环磷酸鸟苷（cGMP）依赖性蛋白激酶（PKG）通路的过度激活会导致感光细胞死亡，尤其是在携带磷酸二酯酶6b（PDE6b）突变的模型中。以往关于RD的研究主要使用小鼠模型，如rd1或rd10小鼠。鉴于小鼠与人类之间存在遗传和生理差异，明确灵长类动物与啮齿类动物视网膜的可比性程度具有重要意义。猕猴与人类在遗传上具有高度相似性。因此，本研究选取野生型猕猴（年龄1-3岁），用于包含视网膜-视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合体的视网膜外植体的体外培养。这些外植体经不同浓度的PDE6抑制剂扎普司特（zaprinast）处理，以激活cGMP-PKG信号通路并模拟RD的发病过程。随后通过免疫荧光染色和TUNEL检测验证灵长类视网膜外植体中cGMP的累积及细胞死亡情况。本研究建立的灵长类视网膜模型可用于cGMP-PKG依赖性RD机制的相关且有效的研究，并为未来治疗策略的开发提供平台。

本研究中，采用包含视网膜-视网膜色素上皮-脉络膜复合体的猕猴视网膜外植体进行外植体培养图1, 补充图 S1）。与 体外 使用未附着视网膜色素上皮和脉络膜的视网膜进行视网膜细胞培养，本实验中的外植体培养有助于提高细胞存活率，从而延长光感受器细胞的存活时间。
我们使用不同浓度的PDE6抑制剂扎普林ast（100 µM、200 µM和400 µM；补充图S2）处理体外光感受器细胞，以诱导cGMP积累并继而激活PKG。体外实验中每种浓度分别处理4天。使用400 µM扎普林ast处理的体外视网膜模型显示出最多数量的TUNEL阳性细胞、显著的cGMP信号，同时对视网膜色素上皮（RPE）及内层视网膜神经元细胞的毒性较低。图2中TUNEL阳性细胞占比较高，提示cGMP活性升高可能加剧扎普林ast诱导的视网膜细胞变性，且cGMP的积累在光感受器变性过程中发挥一定...

从野生型猕猴获得的视网膜外植体进行培养 体外使用PDE6抑制剂扎普利那特（zaprinast）诱导视网膜变性及cGMP-PKG信号通路。通过免疫荧光法验证不同扎普利那特浓度下外植体中cGMP的累积情况。

遗传性视网膜变性（RD）以进行性光感受器细胞死亡为特征。环鸟苷酸（cyclic guanosine monophosphate）过度激活……

本研究建立的灵长类视网膜模型为深入探究cGMP-PKG依赖性视网膜退变的全面机制及治疗开发提供了有力工具。该非人灵长类个体模型保留了视网膜组织结构的完整性及细胞间相互作用，能够更真实地模拟体内环境。同时，该模型减少了动物使用量，并缩短了实验周期。为研究视网膜发育或退行性变提供对照实验方法。开始制备视网膜外植体时，用10毫升5%聚维酮碘溶液清洗从野生型猕猴中分离的眼球，持续30秒。为避免细菌污染，将眼球浸入5%青霉素-链霉素PBS溶液中1分钟，随后在10毫升R16培养基中孵育5分钟。然后将眼球浸入10毫升预热至37摄氏度的蛋白Ace-K溶液中，孵育2分钟。接着在10毫升1:1的R16与胎牛血清混合溶液中孵育5分钟。最后用10毫升新鲜的R16溶液进行终末洗涤。操作完成后，分离巩膜、角膜、虹膜、晶状体和玻璃体。然后用镊子和剪刀从四个方向切下视网膜。接下来，使用4 mL三锋刀片，从鼻侧距视神经乳头1.5 mm、颞侧4 mm以及上下方各2 mm处切割视网膜外植体。然后使用6毫米细锯片切割含有视盘和黄斑的视网膜外植体中央侧。用宽口移液管吸取包含视网膜和脉络膜的视网膜外植体，将其放置在插入物中央，感光细胞层朝上。将视网膜完全浸入膜下方培养板中1毫升的完全培养基内。将视网膜外植体进行培养，并置于37摄氏度、含加湿5%二氧化碳的培养箱中。对外植体给予适当浓度的药物处理，持续四天。每种处理条件至少使用三个外植体，并以未加药物的外植体作为阳性对照。用于固定和冷冻切片时，将视网膜外植体用一毫升多聚甲醛处理45分钟。随后用一毫升磷酸盐缓冲液短暂漂洗，再将外植体依次在10%蔗糖中孵育10分钟、20%蔗糖中孵育20分钟、30%蔗糖中孵育30分钟。将视网膜外植体均匀切割，周边分为四个象限，中心保留六毫米。然后将视网膜外植体转移至一个约1.5 × 1.5 × 1.5厘米的锡盒中，加入适量切割最佳温度化合物包埋介质覆盖外植体。立即用液氮冷冻组织切片，并置于-20 °C冰箱中保存。接着，将琼脂修整成包含组织样本的小块。用软毛刷将组织块切成10 µm的切片，并将其置于防脱载玻片上。然后在40 °C下干燥45分钟，之后于-80 °C保存备用。对于环磷酸鸟苷（cGMP）染色，使用液相阻断笔在干燥的视网膜切片周围画出疏水圈，并覆盖样本。将切片浸入200微升含0.3% PBS的Triton-X100溶液（PBST）中，孵育10分钟，随后在室温下用200微升封闭液处理1小时。接着，将样本切片与200微升用封闭液配制的一抗溶液在4摄氏度下4℃孵育过夜，并用PBS洗涤三次，每次10分钟。最后，在室温下将切片与200微升二抗溶液孵育1小时。用 PBS 每次 10 分钟清洗三次后，将样本覆盖含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂，并在 4 摄氏度下保存至少 30 分钟，然后进行成像。将载玻片在室温下干燥 15 分钟，并用液体阻断笔在视网膜组织样本周围画出疏水屏障环。用 40 毫升 PBS 孵育 15 分钟后，将切片置于 42 毫升 0.05 摩尔 Tris-缓冲液或 TBS 中，在 37 摄氏度下处理。吸弃 TBS，将样品与 6 微升蛋白酶 K 孵育 5 分钟，随后用 PBS 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟。将载玻片置于染缸中，加入 40 毫升乙醇-乙酸溶液，覆盖透明膜，在 -20 摄氏度孵育 5 分钟。用TBS清洗载玻片，每次5分钟，共清洗三次。每张载玻片加入200至300微升封闭液或1% BSA，于湿盒中孵育1小时。每张载玻片加入约130微升TMR红染色液，孵育1小时后，用200微升PBS清洗两次，每次5分钟。将含有1至2滴含DAPI的抗荧光淬灭封片剂的盖玻片置于样本上，于4°C孵育至少30分钟，然后进行成像。在依次完成TUNEL和cGMP染色后，通过调整相机参数进行明场和荧光显微镜观察。使用数字相机和成像软件在20倍放大倍数下采集每张切片四个视野的图像。使用DAPI、EGFP和TMR，通过z轴堆栈扫描（间隔为1 µm，可选1.251 µm）获取视网膜中央区域的代表性图像。在用不同浓度PDE6抑制剂扎普利司特（Zaprinast）处理的视网膜外植体中，与对照组相比，外核层中TUNEL和cGMP阳性细胞的数量显著增加。TUNEL阳性细胞占比较高表明，cGMP活性的升高可能加剧了预nest诱导的视网膜细胞变性，且cGMP的累积在光感受器变性过程中发挥一定作用。组织块的制备应尽快进行。操作动物时应避免散射和任何积聚，因为这有助于提高细胞存活率，并改善大块组织系列中纤维的状态。在最大程度上，应使用类固醇清除玻璃体。转移视网膜外植体时应避免接触视网膜神经纤维层，以防止机械性细胞损伤。请注意，在将视网膜外植体顺利转移至培养插件时，可预先将培养皿用适当液体浸润以保持湿润，再转移视网膜组织。此外，整个操作过程必须在无菌环境下进行，以避免操作过程中发生污染。

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猕猴的器官型视网膜外植体培养物

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长期无血清培养具有完整视网膜色素上皮的小鼠视网膜组织外植体

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一种新型人类类器官视网膜培养技术的表征

本文介绍了一种优化的视网膜类器官诱导系统，该系统适用于多种人类多能干细胞系，可高效且高重复性地生成视网膜组织。...

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

非人灵长类动物（NHP）由于其在解剖结构和遗传上的相似性，是研究人类视网膜细胞治疗的理想模型。本文描述了一种在NHP眼球中进行黄斑下视网膜色素上皮细胞移植的方法，以及预防与黄斑操作相关的术中并发症的策略。...

退行性视网膜疾病非人灵长类动物模型中的视网膜色素上皮移植

本方案介绍并描述了从成年小鼠获取的视网膜外植体的分离、解剖、培养和染色步骤。该方法作为一种离体（ex...

成年小鼠视网膜外植体作为 离体 研究视网膜神经血管疾病的模型

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

此处，我们提供了一种详细的从小鼠眼球中分离视网膜的方法，适用于后续的长期研究 离体 实验。本方案旨在使这一技术要求较高的方法更易于研究人员掌握，以便利用在维持视网膜胶质细胞活性条件下所提供的研究路径 原位...

一个 离体 研究小鼠视网膜胶质细胞相互作用的外植体模型

了解猕猴视网膜外植体培养技术，用于研究cGMP-PKG信号通路介导的视网膜退行性病变机制。该方法通过PDE6抑制剂zaprinast诱导光感受器细胞死亡，为开发视网膜疾病治疗策略提供重要实验模型。

食蟹猴视网膜器官型外植体培养

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