Name: 使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 了解蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性。该方法可检测KCC2在特定激酶调节位点的磷酸化，为理解其生理作用提供可靠工具。

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本工作得到了英国皇家学会（资助号：IEC\NSFC\201094）以及英联邦博士奖学金的支持。

注意：本实验方案描述了通过蛋白质印迹法检测特定目标蛋白的方法。
1. 细胞培养与转染
<ol>
	<li>在进行细胞培养操作前，将所有试剂在珠浴中预热至 37 ˚C。准备培养基：杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清，以及各 1% 的 2 mM L-谷氨酰胺、100 倍非必需氨基酸、100 mM 丙酮酸钠和 100 单位/毫升青霉素-链霉素。</li>
	<li>在珠浴（37 ˚C）中完全解冻稳定转染的大鼠 KCC2b 人胚胎肾 293 细胞（HEK293rnKCC2b）18。将细胞从冻存管转移至含有 5 mL 新鲜培养基的离心管中，在 1200 ×g 条件下离心 3–5 分钟。</li>
	<li>使用连接真空泵的移液器吸除上清液，并加入 10 mL 新鲜培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至 10 cm 培养皿中。</li>
	<li>将培养皿放入培养箱，在 37 °С、含 5% CO2 的湿润环境中培养 48 小时。监测培养过程以确保细胞健康生长。培养结束后，当细胞融合度超过 90% 时进行进一步传代。</li>
	<li>吸除细胞培养皿中的旧培养基，用 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻冲洗细胞。加入 2 mL 胰蛋白酶，在室温下孵育约 1–2 分钟。</li>
	<li>用 2 mL 完全培养基轻轻冲洗消化后的细胞。向新的培养皿中加入 9 mL 新鲜培养基，并从原培养皿中取 1 mL 细胞悬液接种至每个新皿中。将传代后的细胞培养皿放回培养箱继续培养 48 小时，直至融合度达到 ≥ 90%。</li>
	<li>在收集细胞前，用二甲基亚砜（DMSO）作为对照，或分别用 8 µM 星形孢菌素或 0.5 mM N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理细胞 15 分钟，随后用裂解缓冲液收集细胞。</li>
</ol>
2. 细胞裂解液的制备与上样
<ol>
	<li>吸弃培养皿中的培养基（来自转染操作）。将细胞培养物置于冰上，并用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>吸弃 PBS，然后加入 1.0 mL 冰冷的裂解缓冲液，其中含有 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、1 mM 乙二醇双（&#946;-氨基乙基醚-N,N,N&#8242;，N&#8242;-四乙酸（EGTA），1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），50 mM 氟化钠，5 mM 焦磷酸钠，10 mM 钠-&#946;-甘油磷酸盐、1 mM 正钒酸钠、1% (w/v) Triton X-100、0.27 M 蔗糖、1 mM 苯胺、0.1% (v/v) 2-巯基乙醇和 2 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）加入培养皿中。 
	注意：细胞收获过程中裂解缓冲液的体积因培养皿尺寸而异，例如，每 1 x 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm²2 烧瓶，而每5 x 10⁵细胞使用0.5 mL为宜6 细胞/60 mm 培养皿/75 cm²2 培养瓶</li>
	<li>使用预冷的塑料细胞刮刀将细胞从培养皿底部刮下，然后用移液器轻轻将细胞悬液转移至已置于冰上的微量离心管中。在4℃下持续振荡孵育30分钟。 &#176;C.</li>
	<li>在低温离心机（4 ℃）中离心细胞裂解液 &#176;C) 在 16,000 x g 下离心 g 20分钟后，小心地从离心机中取出离心管，置于冰上。将上清液转移至预冷的干净离心管中，弃去沉淀。 
	注意：根据细胞类型的不同，可能需要调整离心力和离心时间。尽管如此，一般建议在16,000 x g 20分钟。然而，具体时间需根据每个实验进行确定。例如，白细胞等脆弱细胞需要非常低的离心速度。</li>
</ol>
3. 从细胞裂解液中制备免疫沉淀物
<ol>
	<li>用移液器将 300 µL 蛋白 G-琼脂糖加入微量离心管中。在 500 x g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入 500 µL PBS，充分涡旋混匀。在 500 x g 条件下离心 2 分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。</li>
	<li>将 1 mg 抗 KCC2 Thr906 和抗 KCC2 Thr1007 抗体与 200 µL 蛋白 G-琼脂糖微珠混合，并用 PBS 定容至 500 µL。在 4 °C 条件下于振荡平台或旋转仪上孵育 2 小时。用 PBS 洗涤两次。</li>
	<li>对全细胞裂解液进行蛋白定量，将 1 mg 细胞裂解液加入已洗涤的微珠中。在 4 °C 条件下于旋转仪上轻柔孵育 2 小时。离心收集微珠，并用含 150 mM 氯化钠（NaCl）的 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>用 200 µL PBS 将免疫沉淀物（微珠）洗涤三次。将最终沉淀重悬于 100 μL 1x 十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液中。</li>
	<li>室温下在旋转振荡器上摇动试管 5 分钟，随后在 75 °C 加热块中孵育 10 分钟。将上样样品在 11,000 x g 条件下离心 2 分钟，取上清液用于上样。</li>
</ol>
4. 进行蛋白质印迹实验
<ol>
	<li>组装制胶装置，并倒入新配制的8%分离胶（配方/配制方法见表1），在玻璃板顶部预留约2 cm空间。向装置中加入200 µL无水异丙醇，室温静置60分钟。 
	注意：用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的聚丙烯酰胺凝胶配方取决于目标蛋白的大小（表2）。因此，在确定所需凝胶浓度前，请先记录目标蛋白的分子量。</li>
	<li>使用移液器吸除异丙醇，并用约200 µL蒸馏水小心冲洗凝胶表面。加入新配制的6%浓缩胶（配方/配制方法见表1），填充制胶装置中约2 cm的空间。轻轻插入样品梳，室温静置30分钟。</li>
	<li>将制备好的凝胶固定于电泳槽中。</li>
	<li>将30.3 g Tris碱、144.1 g甘氨酸和10 g SDS溶于1000 mL蒸馏水中，配制10x转移缓冲液。取10 mL 10% SDS和100 mL 10x转移缓冲液，加入890 mL蒸馏水中，配制成1x电泳缓冲液。</li>
	<li>将1x电泳缓冲液倒入电泳槽中。在第一孔中加入5 µL分子量标记物，其余每孔加入等量蛋白样品（18–30 µL，具体体积取决于所用样品梳的规格）。空孔中加入1x LDS缓冲液，在120 V电压下电泳约90–120分钟。</li>
	<li>将58.2 g Tris碱和29.3 g甘氨酸溶于1000 mL蒸馏水中，配制10x转移缓冲液。用含20%甲醇的1x转移缓冲液活化硝酸纤维素膜。用转移缓冲液冲洗凝胶和膜，然后将其轻轻铺放在转膜夹层中。 
	注意：运行缓冲液和转移缓冲液无需调节pH，因其已处于所需最佳pH范围。此外，建议在实验前预先配制这些缓冲液并室温保存，以节省时间。</li>
	<li>按以下顺序组装转膜“三明治”结构：负极（黑色框/端）— 夹层海绵 — 滤纸 — 已冲洗的SDS-PAGE凝胶 — 已冲洗的硝酸纤维素膜 — 滤纸 — 夹层海绵 — 正极（红色框）。将组装好的“三明治”结构放入转膜槽中，在90 V电压下运行90分钟，或在30 V电压下运行360分钟。</li>
</ol>
5. 抗体染色与图像显影
<ol>
	<li>取出膜并使其干燥。使用含0.1% 1x Tween 20的Tris缓冲盐水（1x TBS-T）配制的5%脱脂奶粉封闭液，在室温下封闭膜1小时。</li>
	<li>将膜与适当稀释的一抗8,15,19以及β-actin（上样对照）在封闭液中孵育，室温下1小时或4 °C过夜。用1x TBS-T溶液洗涤膜三次，每次5分钟。 
	注意：使用β-actin、α-tubulin或甘油醛-3-磷酸脱氢酶等上样对照抗体分别孵育膜，是为了在后续定量分析中对其他Western blot结果进行归一化处理。每种一抗的推荐稀释比例可参考生产商说明书。</li>
	<li>将洗涤后的膜与以封闭液按5000倍稀释的二抗在室温下孵育60分钟。再次用1x TBS-T溶液洗涤膜三次，每次5分钟。 
	注意：强烈建议二抗的宿主物种应针对一抗的宿主物种产生。例如，若总KCC2的一抗为小鼠来源的抗KCC2抗体，则应选用抗小鼠的二抗。</li>
	<li>将洗涤后的膜置于成像板上。取等体积的增强化学发光（ECL）试剂混合，轻轻将混合液均匀覆盖于膜表面以显影信号。</li>
</ol>
6. 使用成像系统进行图像采集及数据定量分析
<ol>
	<li>将成像板转移至成像系统相应的成像区域。在计算机上打开成像软件以进行图像处理。</li>
	<li>在工具栏中，点击 新建方案，选择 单通道。在凝胶成像/应用对话框中点击 选择，滚动至 印迹，并选择 化学发光高灵敏度 或 化学发光高分辨率。然后点击 信号累积设置，设定采集图像的持续时间及图像数量。</li>
	<li>在方案设置中点击 放置凝胶，必要时调整成像系统中的凝胶位置。点击 运行方案 以采集图像。</li>
	<li>在成像目录框中右键点击其中一幅已采集的图像，将图像保存至计算机。浏览至目标图像，在运行对话框中点击 选择图像并继续。</li>
	<li>点击 图像转换 图标以调整图像的对比度和像素饱和度。根据所需的图像格式，点击通用工具栏上的 截图 图标将图像保存至计算机。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件测量条带密度，并采用适当的统计工具进行分析。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

已采用多种方法来检测在神经元中表达的 SLC12 家族阳离子-氯离子共转运蛋白（CCC）的活性，包括 KCC2。其中许多技术已被证实有助于深入理解这些转运蛋白的功能相关性及其在不同疾病相关突变中的结构-功能关系。关键的是，各种方法均存在各自的优势与局限性21。然而，上文所述方案重点介绍了如何利用蛋白质印迹法（western blot）检测 KCC2 在激酶调控位点 Thr906 和 Thr1007 上的磷酸化水平，该方法对于研究 KCC2 的功能与活性具有重要意义。
KCC2的调控通过在关键的丝氨酸/苏氨酸残基上的磷酸化与去磷酸化实现1。Western印迹是一种有效的技术，可用于研究KCC2在Thr906和Thr1007激酶调控位点的磷酸化状态。该方法的基本原理是利用针对目的免疫印迹样品/蛋白质中磷酸化肽段的磷酸化位点特异性抗体，检测KCC2磷酸化水平的变化。Western印迹法用于从组织或细胞样品中检测特定的目标蛋白。该方法首先通过电泳根据蛋白分子大小进行分离，然后将蛋白通过电转移方式...

氯化钾共转运蛋白2（KCC2）是溶质载体家族12（SLC12）中阳离子-氯离子共转运蛋白（CCCs）的一员，仅存在于神经元中，对氯离子（Cl⁻）正常功能的维持至关重要- 稳态以及随之而来的功能性GABA能抑制1,2,3,4. 神经元内低氯离子浓度的维持- 浓度（[Cl⁻]）-]i在脑和脊髓中，通过KCC2将细胞内Cl⁻浓度维持在4-6 mM水平，促进γ-氨基丁酸（GABA）/甘氨酸介导的超极化及突触抑制5KCC2 调控异常与多种神经系统疾病（包括癫痫）的发生密切相关4此外，KCC2介导的Cl⁻外排功能下降− 外排及受损的超极化性GABAA 以及/或者甘氨酸受体介导的电流已被证实与癫痫、神经性疼痛和痉挛有关6,7神经元KCC2受到负向调节 通过 其C末端胞内区关键调控残基被无赖氨酸（with-no-lysine, WNK）-STE20/SPS1相关富含脯氨酸/丙氨酸（SPAK）/氧化应激反应（OSR）激酶信号复合物磷酸化1，这有助于维持未成熟神经元中去极化的GABA活性2,8,9WNK-SPAK/OSR1 磷酸化苏氨酸残基 906 和 1007（Thr906/Thr1007），并随后下调 mRNA 基因表达 KCC2，导致其生理功能随之退化8,10更重要的是，目前已知的事实是，WNK-SPAK/OSR1激酶复合物能够磷酸化并抑制KCC2的表达1,2,4,11,12，且激酶复合物信号通路对Thr906/Thr1007位点的磷酸化抑制与该蛋白表达水平的上调相关 KCC2 mRNA基因13,14,15需要特别注意的是，神经元中 KCC2 和 Na 的调控+-K+-2Cl- 通过蛋白质磷酸化调节共转运蛋白1（NKCC1）的表达以协同且相反的模式进行1,4,16.
关于KCC2调控机制的理解已取得持续且显著的进展，这得益于相关技术的发展，使研究人员能够研究其功能与活性； 通过 直接（评估激酶调控位点的磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性）研究。本文所述方案重点介绍利用蛋白质印迹技术研究神经元K+-Cl- 通过研究共转运体在激酶调控位点Thr906/1007的磷酸化，探讨共转运体KCC2的功能.
Western blot 是一种用于从组织或细胞样品中检测特定目标蛋白的方法。该方法首先通过电泳根据蛋白质的大小进行分离，然后将蛋白质通过电泳转移至固相支持物（通常为膜）上，再利用特异性抗体标记目标蛋白。抗体可偶联不同的标签或荧光染料标记的二抗，通过比色法、化学发光法或荧光法进行检测。该技术可实现从复杂的蛋白质混合物中特异性地检测目标蛋白。该方法已被用于表征 KCCs 的磷酸化特异性位点1，并用于鉴定可抑制 KCC3 Thr991/Thr1048 磷酸化的激酶抑制剂17。通过遵循本实验方案，可从细胞或组织裂解液中特异性检测总 KCC2 蛋白及其磷酸化形式。原则上，该技术通过检测蛋白偶联的抗体，对于深入理解 KCC2 磷酸化位点的协同作用具有重要意义，有助于揭示其生理调控所涉及的分子机制。对总蛋白表达水平的定量分析可代表 KCC2 的功能与活性状态。此外，还有其他经典方法可直接测定 KCC2 活性，例如铷离子和铊离子摄取实验。其他技术如膜片钳电生理学则用于检测 GABA 活性，从而间接反映 KCC2 的激活或失活状态，其依据为细胞内氯离子稳态的评估结果。

<table><tbody><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2917</td><td>用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614</td><td>用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>抗 pSPAK 抗体</td><td>Dundee University</td><td>S670B</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗 KCC2 抗体</td><td>Dundee University</td><td>S700C</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗 KCC2 pSer940 抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-95678</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗 KCC2 pThr1007 抗体</td><td>Dundee University</td><td>S961C</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗 KCC2 pThr906 抗体</td><td>Dundee University</td><td>S959C</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗小鼠二抗</td><td>Cell Signalling technology</td><td>66002</td><td>用作 Western 印迹的二抗</td></tr><tr><td>抗 NKCC1 抗体</td><td>Dundee University</td><td>S841B</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗 NKCC1 pThr203/207/212 抗体</td><td>Dundee University</td><td>S763B</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗兔二抗</td><td>Cell Signalling technology</td><td>C29F4</td><td>用作 Western 印迹的二抗</td></tr><tr><td>抗绵羊二抗</td><td>abcam</td><td>ab6900</td><td>用作 Western 印迹的二抗</td></tr><tr><td>抗 SPAK 抗体</td><td>Dundee University</td><td>S669D</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-微管蛋白 III 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8578</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>苯胺</td><td>Merck UK</td><td>135828</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>用作上样缓冲液和裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>Bradford 考马斯亮蓝</td><td>Thermo Scientific</td><td>1856209</td><td>用于裂解液蛋白定量</td></tr><tr><td>凝胶制备装置</td><td>Atto&amp;nbsp;</td><td>WSE-1165W</td><td>用于运行 SDS-PAGE 电泳</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804</td><td>用于裂解液制备</td></tr><tr><td>离心机</td><td>VWR</td><td>MicroStar 17R</td><td>用于样品离心</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>用于细胞培养实验</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Marvel</td><td>N/A</td><td>用于制备封闭缓冲液</td></tr><tr><td>杜氏改良伊格尔培养基 - 高糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>ECL 显影试剂</td><td>Perkin Elmer</td><td>ORTT755/2655</td><td>用于 Western 印迹图像的显影</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/0700/53</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>e4378</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>BioRad</td><td>PowerPAC HC</td><td>为 SDS-PAGE 电泳提供电源</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>ThermoFisher</td><td>E/0650DF/17</td><td>用于制备无菌设备和环境</td></tr><tr><td>胎牛血清 - &amp;nbsp;热灭活</td><td>Merck Life Sciences UK</td><td>F9665</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>通风橱</td><td>Walker</td><td>A7277</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>转印滤纸 - Whatman</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;</td><td>10426981</td><td>用于 Western 印迹中制备转印夹心结构</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15527</td><td>用于制备缓冲液</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td>GraphPad Software, Inc., USA</td><td>版本 6.0</td><td>用于绘制 Western 印迹的图表并进行数据分析&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Acros Organics</td><td>10647282</td><td>用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>Grant</td><td>QBT1</td><td>用于加热 Western 印迹上样样品</td></tr><tr><td>HEK293 细胞</td><td>Merck UK</td><td>12022001-1VL</td><td>用于培养实验的细胞系</td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>Wayne Rasband 及贡献者；NIH, USA&amp;nbsp;</td><td>ImageJ 1.53e</td><td>用于测量 Western 印迹图像中的条带强度</td></tr><tr><td>成像系统</td><td>BioRad</td><td>ChemiDoc MP</td><td>用于获取 Western 印迹图像</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>LEEC</td><td>LEEC precision 190D</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Honeywell</td><td>24137</td><td>用于电泳凝胶的制备</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸锂 (LDS)</td><td>Novex</td><td>NP0008</td><td>用作 Western 印迹的上样缓冲液</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸&amp;nbsp;</td><td>Merck Life Sciences UK</td><td>M7145</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5418</td><td>用于制备 Western 印迹用裂解液</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>BioRad</td><td>iMark</td><td>用于测定裂解液蛋白浓度</td></tr><tr><td>Microsoft PowerPoint</td><td>Microsoft, USA</td><td>PowerPoint2016</td><td>用于编辑 Western 印迹图像</td></tr><tr><td>分子量标记物</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>N-乙基马来酰亚胺</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23030</td><td>用于细胞培养实验</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>45004091</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Mettler Toledo</td><td>Seven compact s210</td><td>用于监测缓冲液的 pH 值</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟 (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>PKC&amp;delta; pThr505</td><td>Cell Signalling technology</td><td>9374</td><td>用作 Western 印迹的一抗</td></tr><tr><td>Sepharose Protein G</td><td>Generon</td><td>PG50-00-0002</td><td>用于免疫沉淀</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>用作洗涤缓冲液的组分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>用于制备 TBS-T 缓冲液</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5750</td><td>用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>正钒酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>甘油磷酸钠-&amp;beta;</td><td>Merck UK</td><td>G9422</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>星形孢菌素（来自 &lt;em&gt;Streptomyces sp.&lt;/em&gt;）</td><td>Scientific Laboratory Supplies, UK</td><td>S4400-1MG</td><td>用于细胞培养实验</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Scientifc Laboratory Supplies</td><td>S0389</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7024</td><td>用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>转印槽</td><td>BioRad</td><td>1658005EDU</td><td>用于 Western 印迹中将蛋白转印至膜上</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>用于制备 SDS-PAGE 分离胶和浓缩胶&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>用作裂解缓冲液的组分</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 溶液</td><td>Merck Life Sciences UK</td><td>T4049</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3179</td><td>用于制备 TBS-T 缓冲液</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Charles Austen</td><td>Dymax 5</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries</td><td>K-550-GE</td><td>用于样品制备</td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Scientific Industries Ltd</td><td>Vortex-Genie&amp;nbsp; K-550-GE</td><td>用于混合已溶解的样品</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Grant Instruments Ltd. (JB Academy)</td><td>JBA5</td><td>用于孵育溶液</td></tr></tbody></table>

使用蛋白质印迹法研究神经元k-cl共转运蛋白kcc2的功能与活性

Study of the Functions and Activities of Neuronal K-Cl Co-Transporter KCC2 Using Western Blotting

钾氯共转运蛋白2（KCC2）是溶质载体家族12（SLC12）中阳离子-氯离子共转运蛋白（CCCs）的一员，仅存在于神经元中，对氯离子（Cl⁻）稳态的正常调控至关重要- 稳态，从而影响GABA能抑制功能。KCC2调控异常具有破坏性，已被证实与包括癫痫在内的多种神经系统疾病的发生相关。随着研究技术的发展，科研人员得以探究KCC2的功能与活性，有关其调控机制的研究已取得显著进展；这些技术或可 通过 直接（评估激酶调控位点的磷酸化）或间接（观察和监测GABA活性）的研究方法。本文重点介绍如何利用蛋白质印迹技术检测KCC2在激酶调控位点Thr906和Thr1007的磷酸化水平。此外，还有其他经典方法可用于直接测量KCC2活性，例如铷离子和铊离子摄取实验。进一步地，膜片钳电生理技术可用于测量GABA活性，从而通过评估细胞内氯离子稳态间接反映KCC2的激活或失活状态。本文将简要讨论其中部分附加技术。

此处，图1 所示的代表性结果利用蛋白质印迹技术，研究了星形孢菌素（staurosporine）和N-乙基马来酰亚胺（NEM）对稳定表达KCC2b的HEK293细胞系（HEKrnKCC2b）18中WNK-SPAK/OSR1介导的KCC2和NKCC1磷酸化的影响。有关代表性结果的详细信息见Zhang等人的研究15。与NEM类似，星形孢菌素是一种广谱激酶抑制剂，可增强KCC2的转运活性并抑制NKCC1的活性15,20。对HEK293细胞使用星形孢菌素和NEM处理后，SPAK靶位点的磷酸化水平降低——即位于T环激酶结构域内的Thr233位点，以及人源SPAK（hsSPAK）S环磷酸化位点Ser373。因此，这两种化合物均降低了上述SPAK磷酸化位点的磷酸化水平。此外，星形孢菌素降低了HEKrnKCC2b</...

本实验方案重点介绍利用蛋白质印迹技术研究神经元中K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性。方案详细描述了对KCC2在激酶调控位点Thr906/1007处磷酸化水平的检测方法。 通过 western印迹。此外，本文还简要介绍了其他用于验证KCC2活性的方法。

使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性

钾氯共转运蛋白2（KCC2）是溶质载体家族12（SLC12）中阳离子-氯离子共转运蛋白（CCCs）的一员，仅存在于……

该方案可通过直接评估KCC2的激酶分子大小磷酸化，帮助理解KCC2调控所涉及的机制，从而揭示其生理功能与活性。即使目标蛋白表达量极低，该技术也可用于从复杂的相关分子混合物中鉴定和表征目标分子（如蛋白质）。该技术是复杂系统蛋白质分析以及识别组织功能异常或疾病潜在机制的重要工具。演示实验操作的是我实验室的博士生Sunday Solomon Josiah。首先，将所有试剂预先置于37摄氏度的珠浴中，并在珠浴中将稳定转染的大鼠KCC2b人胚胎肾293细胞完全解冻。随后，将细胞从冻存管转移至含有5 mL新鲜培养基的离心管中，并在1,200 ×g条件下离心3至5分钟。使用连接真空泵的吸液管吸去上清液后，将细胞重悬于10毫升新鲜培养基中。将细胞悬液转移至10厘米培养皿，在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养48小时。待细胞达到90%融合度时，吸去旧培养基，用2毫升PBS洗涤细胞，进行传代。加入两毫升胰蛋白酶，在室温下孵育约一到两分钟。用两毫升完全培养基洗涤经胰蛋白酶处理的细胞。向新培养皿中加入九毫升新鲜培养基。然后将1毫升旧培养皿中的溶液加入新培养皿中。将分装后的细胞培养皿放入培养箱中培养48小时，使其融合度达到90%以上。在裂解缓冲液收获细胞前，用二甲基亚砜、8微摩尔星形孢素或0.5毫摩尔N-乙基马来酰亚胺处理细胞15分钟。吸弃横切培养皿中的培养基，将培养皿置于冰上，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。吸弃 PBS，向培养皿中加入 1.0 毫升预冷的裂解缓冲液。用预冷的塑料细胞刮棒将细胞从培养皿底部刮下后，将细胞悬液转移至置于冰上的微量离心管中，并在 4°C 下持续振荡 30 分钟。在低温离心机中离心细胞裂解液后，立即将其置于冰上。将上清液收集至预冷的干净离心管中，并弃去沉淀物。用移液器吸取 300 微升 Protein G Sepharose 加入微量离心管中。然后以500 G离心溶液2分钟。弃去上清液后，加入500微升PBS，充分涡旋混匀。离心后再次弃去上清液，并重复该步骤。接下来，将一毫克抗KCC2苏氨酸906和抗KCC2苏氨酸1007抗体与200微升Protein G Sepharose珠混合，再用PBS定容至500微升。在4摄氏度下于振荡平台或旋转轮上摇动两小时后，用PBS重复洗涤两次。对细胞裂解液进行蛋白质定量，然后将一毫克细胞裂解液加入洗涤后的珠中，在末端对末端旋转仪中孵育，随后离心沉淀。用含有150毫摩尔氯化钠的PBS洗涤三次，随后用200微升PBS洗涤三次，然后将最终沉淀重悬于100微升LDS样品缓冲液中。在室温下将试管置于旋转摇床中振荡5分钟。将试管在加热块中孵育后离心，取上清液用于上样凝胶。组装 Western Blot 制胶装置，并倒入新配制的 8% 分离胶以制备凝胶，灌胶至距离玻璃板顶部约两厘米处。向装置中加入 200 微升无水异丙醇，室温静置 60 分钟。用移液器吸除异丙醇，并用约 200 微升蒸馏水小心冲洗凝胶表面。加入新配制的6%浓缩胶至制胶装置后，轻轻插入样品梳，室温静置30分钟。随后将凝固好的凝胶固定于电泳槽中。向电泳槽中加入电泳缓冲液后，在第一孔中加入5 µL分子量标准品，其余各孔每孔加入等量的蛋白质样品。用 LDS 填充空孔，在 120 伏电压下电泳约 90 至 120 分钟。用含有 20% 甲醇的转移缓冲液重新水化硝酸纤维素膜。用转移缓冲液冲洗凝胶和膜，并将其轻轻铺展在制备好的转膜夹心中。按以下顺序组装待转移的“三明治”结构：负极、三明治泡沫垫、经漂洗的SDS-PAGE凝胶滤纸、经漂洗的硝酸纤维素膜、滤纸、三明治泡沫垫、正极。组装完成后，将该结构放入转移槽中，以90伏电压运行90分钟，或以30伏电压运行360分钟。随后，使用封闭缓冲液在室温下封闭干燥的膜1小时。将膜在封闭缓冲液中加入适当稀释的一抗和 beta-actin，室温孵育一小时，或 4°C 过夜。随后用 TBST 洗涤三次，每次五分钟。将洗涤后的膜加入用封闭缓冲液稀释的二抗中，孵育 60 分钟，再重复进行三次 TBST 洗涤。完成后，将洗涤后的膜置于成像板上。为显影信号，在将成像板转移至成像系统前，将等体积混合的两种增强型化学发光试剂配制的溶液均匀覆盖于膜上。用星形孢菌素和N-乙基马来酰亚胺（NEM）处理HEK293细胞后，内源性表达的SPAK蛋白在其靶位点的磷酸化水平降低，这些靶位点包括位于T环激酶结构域内的苏氨酸233位点以及S环磷酸化位点丝氨酸373。星形孢菌素降低了稳定表达KCC2b的HEK294细胞中丝氨酸940位点的磷酸化水平，而NEM则显著增加了该位点的磷酸化。此外，星形孢菌素降低了苏氨酸505位点的磷酸化水平，而NEM在相同位点仅引起轻微但无统计学意义的磷酸化增加。这两种化合物对蛋白激酶C在苏氨酸505位点以及KCC2b在丝氨酸940位点的磷酸化所产生差异性效应具有良好的相关性。代表性结果还显示，NEM 导致总 KCC2 表达量显著增加，而总 NKCC1 和 SPAK 的表达量在两种化合物处理后均无显著变化。此外，这两种化合物均导致 SPAK 在苏氨酸 233 位点和丝氨酸 373 位点的磷酸化水平降低，这分别与 NKCC1 内源性表达时苏氨酸 906/1007 位点以及苏氨酸 203/207/212 位点的磷酸化减少相关。另外，星形孢菌素和 NEM 分别降低了蛋白激酶 C 在丝氨酸 940 位点的磷酸化水平，同时增加了稳定表达的 KCC2b 的磷酸化水平，这分别与星形孢菌素和 NEM 处理后蛋白激酶 C delta 在苏氨酸 505 位点的磷酸化水平降低和升高相关。如果使用了不合适的初级或次级抗体，则在成像过程中将无法观察到条带。此外，若抗体浓度过低，信号也可能不可见。该技术是蛋白质定量分析中的重要工具，已使其被广泛应用于多种科研和资源利用领域，包括作为有效的早期诊断工具。

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使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性

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来源：Josiah, S. S., 等。利用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性。 J. Vis. Exp.

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利用质子杀伤筛选法在质膜上表达细胞内区室 Na+/H+ 交换体并进行功能表征

遗传性心律失常通常由突变引起，这些突变会改变一种或多种离子通道在细胞表面的递送。本文中，我们改进了流式细胞术检测方法，用于定量分析在tsA-201细胞中表达的重组离子通道的总蛋白和细胞表面蛋白的相对表达水平。...

利用流式细胞术测定重组离子通道的细胞表面相对表达量与总表达量

本实验方案的目的是对来自复杂生物样品（如细胞裂解液或组织匀浆）中的蛋白激酶CK2底物进行标记、富集和鉴定。该方法利用了CK2生物学特性的独特之处来实现这一目标。...

利用一种通用的生化方法鉴定新型CK2激酶底物

本方案描述了一种通过测量膜电位变化来研究生电性膜蛋白的方法。该检测方法为功能性读取上皮细胞系中内源性表达的多种离子通道提供了平台。...

一种基于荧光的膜电位检测方法，用于高通量功能研究两种上皮细胞系中的两种内源性离子通道

在此，我们演示如何将原代海马神经元的转染与活细胞共聚焦成像相结合，以分析病理蛋白诱导的轴突运输变化，并鉴定介导这些效应的分子机制通路。...

利用活细胞成像技术测定病理性蛋白对原代海马神经元轴突运输的影响

了解蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能和活性。该方法可检测KCC2在特定激酶调节位点的磷酸化，为理解其生理作用提供可靠工具。

使用蛋白质印迹法研究神经元K-Cl共转运蛋白KCC2的功能与活性

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