通过产 卵电 穿孔解剖听觉回路中脆性X智力迟钝蛋白的细胞自主功能

我们的协议是一种体内方法，用于研究FMRP在开发过程中的细胞自主功能。这有助于了解脆性X综合征的细胞类型特异性病理生理学。该方法采用含有Fmr1小发夹RNA的药物诱导载体系统的阶段，位点和方向特异性电穿孔。

通过这种方法，我们在听觉回路中实现了选择性FMRP敲低。该方法也可用于研究听觉回路或前庭系统中其他基因的功能。首先将卵子水平放置，将胚胎定位在卵子的顶部，以便于操作。

在 38 摄氏度下孵育 46 至 48 小时，直到汉堡和汉密尔顿或 HH 阶段 12，用于神经管转染，或 54 至 56 小时，直到 HH 13 进行耳囊转染。从孵化器中取出鸡蛋，一次一打鸡蛋。将种蛋放在孵化器外超过一小时会引入发育变化并降低活力。

用手电筒从鸡蛋底部投射光线。胚胎的位置在蛋壳上显示为一个黑暗区域。用铅笔在蛋壳上标记胚胎的位置。

用含有75%乙醇的纱布擦拭鸡蛋，并用剪刀尖端在鸡蛋的尖头钻一个孔。然后，用 18 号针头注射器取出两毫升白蛋白。确保孔仅足够大以允许针头插入。

用纱布擦去任何泄漏的白蛋白，并用透明胶带密封孔。用透明胶带覆盖鸡蛋的顶部，以铅笔标记的黑暗区域为中心，以尽量减少裂缝并防止在开窗过程中掉落的贝壳碎片。用含有75%乙醇的纱布擦拭所有手术工具，并用75%乙醇擦拭胶带覆盖的区域。

用一把小剪刀在铅笔标记的圆周周围剪一个一到两平方厘米的窗口。将剪刀平放，以免损坏下面的胚胎。将带窗的鸡蛋放在具有10倍目镜和2倍变焦的立体显微镜下。

用墨水溶液填充一毫升注射器，然后安装27号针头。用镊子将针头弯曲成45度角。在显微镜下，小心地从opaqua区域的边缘戳出，然后将针头插入胚胎下方。

注入约50微升墨水，这些墨水将扩散到透明区域下方，以进行胚胎可视化。墨水将形成深色背景，以便清晰地可视化胚胎。使用移液器拉拔器将玻璃毛细管拉入移液器。

在解剖显微镜下，用镊子小心地将毛细管针的尖端打开直径至10至20微米。将移液器存放在储物盒中直至使用。接下来，用注射器通过移液器末端的橡胶管施加负压，用0.5至1微升的质粒混合物填充毛细管移液器。

将卵子放在显微镜下，使胚胎垂直定向，尾巴靠近您。用一只手或三轴机械手握住毛细管移液器，并将移液器的尖端驱动到菱形 5 至 6。在尾对头的方向。

轻轻地将吸头穿过卵黄素膜并插入背侧神经管，然后稍微撤回移液器，使吸头在神经管腔内。通过施加气压注入质粒混合物，直到有色质粒完全扩散到菱形5至6中，并延伸到菱形3和菱形4中。检查注射是否成功，这是当蓝色质粒溶液快速扩散到神经管而不泄漏时实现的。

当泄漏发生时，蓝色会迅速褪色。注射后，立即在神经管的两侧放置一个铂双极电极。使用电穿孔器提供两个 12 伏和 50 毫秒持续时间的脉冲。

观察双极电极末端的气泡，负极端的气泡更多。检查电穿孔是否成功，这是在有色质粒混合物进入电极正极附近的神经管组织时实现的。电穿孔后，小心地取出双极电极。

用一块预切成两英寸见方的透明薄膜覆盖蛋壳上的窗口，并喷洒 75% 乙醇。将鸡蛋放回孵化器中。清洁双极电极，在盐水中提供 10 到 20 个 12 伏脉冲和 50 毫秒持续时间，然后再进行下一个鸡蛋。

在显微镜下，将卵子放在胚胎垂直且尾巴靠近您的方式放置。握住毛细管移液器，在背外侧方向轻轻戳右耳囊。用气压注入质粒混合物，直到耳囊充满蓝色溶液。

检查注射是否成功，这是当蓝色质粒混合物被限制在耳囊内并且不泄漏时实现的。注射后立即将双极电极放在耳囊上，并将正侧和负侧分别放置在耳囊的前方和后方。使用电穿孔器提供两个 12 伏和 50 毫秒持续时间的脉冲。

检查电穿孔是否成功，这是当蓝色质粒混合物进入电极正极附近的耳囊组织时实现的。电穿孔后，小心地取出双极电极，并用透明薄膜覆盖蛋壳上的窗口。最后，将鸡蛋放回孵化器。

代表性图像显示了胚胎第二天或E2的神经管转染和人肉处理后胚胎第三天或E3的示例。此处显示了横截面上具有Fmr1 shRNA和EGFP的转染细胞。表达EGFP的细胞局限于神经管和脑干的一侧。此处显示了E15处的横截面，转染侧有表达EGFP的磁细胞核或NM神经元。

在对侧，在海带核或NL的腹侧部分可以看到含EGFP的轴突。与邻近的非转染神经元相比，转染的NM神经元中的FMRP免疫反应性显着降低，验证了Fmr1 shRNA的敲低效果。此处显示了E19处伴FMRP免疫反应性的听神经节。听觉神经节神经元未转染。

一些来源于颅神经嵴细胞的神经胶质细胞被转染。代表性图像显示耳囊转染后耳囊管中的FMRP敲低。E9的听觉导管表现出广泛的EGFP荧光。

在横截面上，表达EGFP的细胞位于基底和听神经节中。与邻近的非转染毛细胞相比，转染毛细胞中的FMRP免疫反应性降低，验证了Fmr1 shRNA的敲低效果。同样，FMRP免疫反应性在转染的听觉神经节神经元中显着降低。

转染的听觉神经节神经元的中心投影通过具有特征性终球末端的听觉神经追踪到脑干。在尝试此程序时，最重要的是控制电穿孔的位点和方向以进行选择性转染。按照此过程，可以进行单细胞类型填充，免疫染色，细胞分选，然后使用质谱或单细胞测序来揭示形态学和生化水平的变化。

该技术还可以选择性地编辑其他基因，在干回路的听觉中具有时间控制和成分特异性，并且可以修改以操纵前庭系统。