Name: 通过产 卵电 穿孔解剖听觉回路中脆性X智力迟钝蛋白的细胞自主功能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: 了解利用产卵电穿孔技术在鸡胚听觉回路中特异性敲低脆性X智力迟钝蛋白的细胞自主功能研究方法。该技术可揭示脆性X综合征的细胞类型特异性病理机制，适用于听觉和前庭系统基因功能研究。

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本研究由以下项目资助：国家自然科学基金（编号 32000697）；广州市科技计划项目（202102080139）；广东省自然科学基金（2019A1515110625，2021A1515010619）；中央高校基本科研业务费专项资金（11620324）；暨南大学再生医学教育部重点实验室研究基金（编号 ZSYXM202107）；中国中央高校基本科研业务费专项资金（21621054）；广东省医学科研基金（20191118142729581）。感谢暨南大学医学实验中心的支持。感谢 Terra Bradley 博士对稿件的细致编辑。

鸡蛋和鸡胚胎的处理均遵循暨南大学动物护理与使用委员会批准的动物实验方案，以谨慎和尊重的态度进行。
1. 卵母细胞与质粒的制备
<ol>
	<li>卵的准备
	<ol>
		<li>从华南农业大学获取新鲜的受精鸡卵（Gallus gallus），在孵化前储存于16 °C。为保证最佳活性，所有卵应在到达后一周内开始孵化。</li>
		<li>将卵水平放置，在38 °C下孵化46–48小时，直至达到Hamburger和Hamilton（HH）12期25，用于神经管转染；或孵化54–56小时至HH13期，用于耳囊转染。由于卵的动物极比植物极颜色更浅，水平放置可使胚胎位于卵的上方，便于操作。在此步骤及后续所有步骤中，需注意保持卵的水平位置。</li>
		<li>使用手电筒从卵底部透光照射时，胚胎位置在蛋壳上呈现为一个较暗的区域。在达到目标HH期时，使用此透光法用铅笔在蛋壳上标记胚胎位置。</li>
		<li>用含75%乙醇的纱布擦拭卵表面。用剪刀尖在卵的钝端钻一个小孔，使用18 G针头的注射器抽出2 mL蛋白液。确保孔的大小仅足以插入针头。若有蛋白液渗出，用纱布擦净，并用透明胶带封住小孔。</li>
		<li>为减少开窗过程中产生裂纹并防止碎壳掉落，用透明胶带覆盖卵的顶部，中心对准铅笔标记的暗区。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒DNA提取
	<ol>
		<li>使用基于转座子的Tet-on系统克隆鸡Fmr1 shRNA，方法如前所述20。该系统包含三个质粒：pCAGGS-T2TP、pT2K-CAGGS-rtTA-M2和pT2K-BI-TRE-EGFP-Fmr1 shRNA，构成一个药物可诱导的载体系统，转染后Fmr1 shRNA和EGFP的表达处于沉默状态，可通过多西环素（Dox）诱导激活。 
		&#8203;注意：这些质粒目前未存入公共数据库。作者同意在合理请求下提供质粒。</li>
		<li>根据制造商说明书，使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒DNA，并加入1/15体积的7.5 M乙酸钠和1体积的100%异丙醇进行沉淀。</li>
		<li>在-20 °C下沉淀过夜，于13,000 × g离心10分钟。用试剂盒提供的Tris-EDTA缓冲液溶解沉淀，终浓度为4–5 µg/µL。质粒在-20 °C下可保存12个月而不影响转染效率。</li>
		<li>电穿孔当天，用移液器枪头在无菌离心管中充分混匀每种质粒各2 µL。最终得到的6 µL质粒混合液足以用于三打卵的电穿孔。为便于电穿孔过程中观察质粒位置，每6 µL DNA混合液中加入1 µL 0.1%快绿染料（用无菌ddH2O配制）26，使质粒混合液呈现蓝色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在卵内 电穿孔
<ol>
	<li>卵窗处理与胚胎识别
	<ol>
		<li>电转染当天，每次从孵育箱中取出一打卵，依次操作。卵离开孵育箱的时间超过1小时会引入发育差异并降低存活率。</li>
		<li>用浸有75%乙醇的纱布擦拭所有手术器械。</li>
		<li>将每枚卵放入定制的泡沫支架中。用75%乙醇擦拭胶带覆盖区域，然后使用小剪刀沿铅笔标记的圆周剪出一个1–2 cm2的窗口（图1A）。剪切时应保持剪刀平放，避免损伤下方的胚胎。</li>
		<li>将开窗后的卵置于体视显微镜下，目镜放大倍数为10倍，变焦为2倍，识别胚胎。调节光源的角度和亮度以获得更清晰的视野。 
		注意：在此阶段观察胚胎并识别神经管需要一定的练习和经验。
		<ol>
			<li>初学者可采用以下可选的墨水注射步骤以辅助胚胎识别。预先配制10%印度墨水溶液（溶于0.01 M磷酸盐缓冲液PBS中），并进行高压灭菌。用1 mL注射器吸取墨水溶液，安装27G针头，并用镊子将针头弯成45°角。</li>
			<li>在显微镜下，从明区边缘处小心刺入，将针头插入胚胎下方。注入约50 µL墨水，墨水将在明区下方扩散，形成深色背景，从而清晰显示胚胎轮廓。 
			注意：注射前需排出注射器内的空气。当操作熟练后，应避免使用墨水注射，因其会降低胚胎存活率。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>神经管注射与电转染 
	注意：此操作在HH12期进行，用于转染脑干中的NM神经元。
	<ol>
		<li>使用拉针仪将玻璃毛细管（直径约1 mm，长100 mm）拉制成微针。在解剖显微镜下，用镊子小心打开毛细管针尖，使其直径达到10–20 µm。将微针（通常一次准备5–10根）存放于储存盒中备用。</li>
		<li>通过连接在微针末端的橡胶管施加负压，将0.5–1 µL质粒混合物吸入毛细管微针中。负压可通过注射器或气泵实现。</li>
		<li>将卵置于显微镜下，使胚胎呈垂直方向，尾部朝向操作者（若使用三轴操纵器注射，则可呈水平方向）。一手持微针或使用三轴操纵器，将针尖从尾部向头部方向推进至r5/6区域。 
		注意：后脑最前端区域为r1，沿神经管每一段膨大即为一个菱脑节。r5/6与耳囊处于相同的前后水平位置，耳囊为一个易于识别的杯状结构（图1B-C）。</li>
		<li>轻轻刺穿卵黄膜，将针尖插入背侧神经管，随后稍向后撤，使针尖位于神经管腔内。通过施加气压注入质粒混合物，直至带颜色的质粒充分扩散至r5/6，并延伸至r3和r4区域。 
		注意：注射时无需在卵黄膜上切开切口。</li>
		<li>检查注射是否成功：若蓝色质粒溶液迅速沿神经管向下扩散且无泄漏，则为成功（图1B-C）。若发生泄漏，蓝色会迅速消退。</li>
		<li>注射后立即在神经管两侧放置铂金双极电极（图1D）。使用电转仪施加两次12 V、持续50 ms的脉冲。观察双极电极两端产生气泡，负极侧气泡更多。</li>
		<li>检查电转染是否成功：若带颜色的质粒混合物进入电极正极侧附近的神经管组织，则为成功。电转染完成后，小心移除双极电极。</li>
		<li>用预先裁剪为2英寸见方并喷洒75%乙醇的透明薄膜封住卵壳上的窗口，将卵放回孵育箱。</li>
		<li>在进行下一个卵的操作前，将双极电极浸入生理盐水中，施加10–20次12 V、50 ms的脉冲以清洁电极。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>耳囊注射与电转染 
	注意：此操作在HH13期进行，用于转染内耳的毛细胞和AG神经元。
	<ol>
		<li>在HH13期（约胚胎第2.5天），胚胎已发生旋转，头部右侧朝上。在显微镜下将卵放置为胚胎垂直、尾部朝向操作者。手持毛细管微针，从背外侧方向轻轻刺入右侧耳囊（图2A）。 
		注意：在此阶段，耳囊表现为位于身体顶部的一个小圆形结构，与r5/6处于相同的前后水平位置。</li>
		<li>施加气压注入质粒混合物，直至耳囊完全充满蓝色溶液27。检查注射是否成功：若蓝色质粒混合物局限于耳囊内且无泄漏，则为成功。</li>
		<li>注射后立即按图2B所示将双极电极置于耳囊周围，正极置于耳囊前方，负极置于后方。使用电转仪施加两次12 V、50 ms的脉冲。</li>
		<li>检查电转染是否成功：若蓝色质粒混合物进入电极正极侧附近的耳囊组织，则为成功。电转染完成后，小心移除双极电极。用透明薄膜封住卵壳窗口，并将卵放回孵育箱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 加入多西环素以启动并维持质粒转录
<ol>
	<li>多西环素溶液的制备
	<ol>
		<li>在通风橱内称取100 mg多西环素粉末，溶于100 mL无菌PBS中，配制成1 mg/mL的工作液。使用0.22 µm滤器过滤溶液，并将1 mL分装液于-20 °C保存。避光操作20,28。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多西环素的给药
	<ol>
		<li>为实现完全强度的基因编辑，在目标时间点前24 h，将一份多西环素分装液置于冰上解冻。用注射器穿透蛋壳表面的透明膜，将50 µL多西环素溶液直接滴加到尿囊绒毛膜上。注射后用透明膜或胶带密封针孔。</li>
		<li>为维持基因敲低效果，每隔一天给药一次，直至在目标发育阶段收获组织。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织解剖与切片
<ol>
	<li>脑干
	<ol>
		<li>对于胚胎期3（E3）和E6的胚胎，打开蛋壳并用剪刀剪开相关膜组织。用勺子将胚胎取出，并浸入含有4%多聚甲醛（PFA）的0.1 M磷酸盐缓冲液中。</li>
		<li>对于E9胚胎，打开蛋壳，用剪刀将胚胎头部剪下，并将头部转移至盛有PBS的硅胶底培养皿中。通过眼眶将头部固定，然后纵向切开颅骨顶部。从两侧小心地将镊子置于脑组织下方，利用镊子的肩部将整个脑组织从颅腔中抬起。将脑组织浸入4% PFA中。</li>
		<li>对于E15和E19胚胎，打开蛋壳，用剪刀剪下胚胎头部，并将头部置于盛有PBS的硅胶底培养皿中。切开头顶部的皮肤以暴露颅骨。</li>
		<li>用刀片沿颅骨垂直切开，分离前脑与后部脑组织。将后部脑组织块浸入PBS中，去除颅骨顶部，然后将脑组织从颅骨上取下。</li>
		<li>通过视叶将脑组织固定于基底上，分离小脑与脑干。注意不要损伤位于小脑正下方的听觉脑干。尽可能去除脑干上的硬脑膜，然后将其浸入4% PFA中。</li>
		<li>除E19脑干需在相同条件下固定24小时外，其余胚胎及脑组织均在4 °C下于4% PFA中固定过夜。</li>
		<li>固定完成后，将组织置于含30%蔗糖的PBS中进行脱水处理，直至组织沉底，通常需要1–3天，具体时间取决于胚胎发育阶段。</li>
		<li>使用滑动式切片机在冠状面上将脑干（E15和E19）切成30 µm厚的切片。将切片收集于PBS中，并在4 °C下保存，待进行免疫染色。</li>
		<li>对于E3和E6胚胎以及E9脑干，进行横断面切片，厚度为50 µm。将切片收集于PBS中并在4 °C下保存。在免疫染色前将切片贴附于明胶包被的载玻片上。为这些发育阶段制备较厚切片有助于组织操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>听觉导管
	<ol>
		<li>从E9、E15和E19胚胎中取出脑干后，嵌于颞骨内的听觉导管在颅骨下方清晰可辨，且颞骨易于与周围颅骨分离。对于E9胚胎，将完整的颞骨固定于4% PFA中；对于较晚期胚胎，则需去除颞骨的骨性结构以分离听觉导管，并将听觉导管固定于4% PFA中。</li>
		<li>所有颞骨和听觉导管均应在4 °C下于4% PFA中固定过夜，之后进行组织包埋。</li>
		<li>按所述方法进行组织包埋。配制包埋液如下：将10%明胶（来自牛皮）浸泡于冷水中，直至明胶颗粒膨胀并沉降（约30分钟）。将混合物加热至约50 °C以溶解明胶，然后向明胶溶液中加入20%蔗糖，搅拌至完全溶解。将明胶-蔗糖溶液于4 °C保存，可保存一个月。</li>
		<li>使用时，将明胶-蔗糖溶液在37 °C预热。将颞骨/听觉导管置于96孔板中的温热明胶-蔗糖溶液内，在37 °C下孵育至组织沉底，通常需30–60分钟。</li>
		<li>用透明薄膜条铺垫12孔板孔底。加入一层温热的明胶-蔗糖溶液，待其凝固。将每块颞骨/听觉导管转移至各孔中。</li>
		<li>用第二层温热的明胶-蔗糖溶液包埋组织。调整组织位置，使其位于凝胶中央，并确保听觉导管呈水平方向。小心将培养板移入4 °C冰箱，待凝胶完全固化。</li>
		<li>拉动透明薄膜条，将凝胶-组织块从孔中取出。修剪多余凝胶成方形块状，并切去一角以标识方向。用铝箔包裹明胶块，置于干冰上速冻，随后于-80 °C保存，直至切片。</li>
		<li>使用冷冻切片机沿听觉导管长轴方向以20 µm厚度切片。将切片直接贴附于明胶包被的载玻片上。切片完成后将载玻片于-80 °C保存，待进行免疫染色。</li>
		<li>免疫染色前，将载玻片浸入预热的PBS（45 °C）中5分钟，以溶解明胶，随后用室温PBS洗涤3次，以去除残留明胶。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫染色与显微镜成像
注意：根据切片是贴附在载玻片上还是游离悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，需采用两种不同的免疫染色方法。
<ol>
	<li>载玻片免疫染色
	<ol>
		<li>用 PBS 清洗载玻片，每次 10 分钟，共洗 3 次。用油性笔在载玻片上圈出含有组织切片的区域，以防止染色过程中液体外溢。在切片上覆盖含 5% 正常山羊血清的 PBS 封闭液，室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>将一抗（最终使用浓度参见材料表）用含 0.3% TritonX-100 和 5% 正常山羊血清的 PBS 稀释。吸除封闭液后，将一抗稀释液覆盖于切片上。将载玻片置于底部铺有蒸馏水的湿盒中，4 °C 过夜孵育。</li>
		<li>用 PBS 清洗载玻片 3 次，每次 10 分钟。在载玻片上滴加用含 0.3% TritonX-100 的 PBS 按 1:500 稀释的荧光二抗。室温避光孵育 4 小时。</li>
		<li>用 PBS 清洗载玻片 3 次。轻轻滴加两滴封片剂于载玻片上，盖上盖玻片，注意避免盖玻片与载玻片之间产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>整体胚胎及游离切片的免疫染色
	<ol>
		<li>在孔板中用 PBS 清洗胚胎/切片，每次 10 分钟，共洗 3 次。在离心管中用含 0.3% TritonX-100 和 5% 正常山羊血清的 PBS 稀释一抗。用玻璃钩将每个胚胎/切片转移至离心管中，4 °C、60 rpm 摇床上过夜孵育。</li>
		<li>在孔板中用 PBS 清洗胚胎/切片 3 次，每次 10 分钟。将每个胚胎/切片转移至装有荧光二抗稀释液的避光离心管中，室温摇床上孵育 4 小时。</li>
		<li>在孔板中用 PBS 清洗胚胎/切片 3 次。用刷子将切片转移至含 PBS 的 15 cm 培养皿中的明胶包被载玻片上。待载玻片略微干燥（约 5 分钟）后，滴加两滴封片剂，盖上盖玻片，注意避免产生气泡。整体组织样本应保存在 PBS 中用于成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像
	<ol>
		<li>在底部含碳粉（提供黑色背景）的硅胶底培养皿中，用 PBS 浸泡整体组织进行成像。使用商用 Olympus 图像处理软件包采集和处理图像，具体方法如前所述29。</li>
		<li>使用共聚焦显微镜对载玻片上的切片进行成像，方法如前所述20。使用 10x、20x 和 63x 物镜在单焦平面成像。对同一动物来源的所有切片使用相同的成像参数采集图像。注意调整激光强度和图像采集设置，避免信号饱和。</li>
		<li>使用 Fiji 软件进行图像处理。为展示目的，可使用专业图像编辑软件调整图像的亮度、对比度和伽马值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fragile+X+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065(2017).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了确定FMRP的细胞自主功能，有必要在特定细胞群或细胞类型中调控其表达。由于FMRP的主要功能之一是调控突触的形成与可塑性，因此，要全面理解FMRP在突触通讯中的作用机制，必须能够选择性地操控特定神经环路中各个突触组分。通过鸡胚的in ovo电穿孔技术，我们展示了一种方法，可选择性地在AG-NM环路中的突触前AG神经元或突触后NM神经元中调控FMRP的表达。实现这一目标的关键步骤包括选择合适的胚胎发育阶段进行电穿孔，并准确地将电极定位至胚胎的相应位置。NM神经元起源于HH12阶段神经管菱脑节r5/6水平的神经前体细胞23。在同一阶段，颅神经嵴细胞从神经管背侧顶端迁移至前庭耳蜗神经节，包裹未来的AG神经元33。因此，NM神经元和AG中的胶质细胞均起源于神经管。相比之下，毛细胞和AG神经元则起源于外胚层24。在HH10阶段，位于r5/6水平附近的外胚层增厚，至HH13阶段内陷形成听泡（otic cup）。随后听泡闭...

脆性X综合征（FXS）是一种以智力障碍、感觉异常和自闭症样行为为特征的神经发育障碍。在大多数情况下，FXS由脆性X智力低下蛋白（FMRP；由FMR1基因编码）的全面缺失所致。 Fmr1 基因）从早期胚胎阶段开始1FMRP 是一种 RNA 结合蛋白，通常在脑内的大多数神经元和胶质细胞中表达，也在感觉器官中表达。2,3,4在哺乳动物大脑中，FMRP 可能与数百种编码对多种神经活动至关重要的蛋白质的 mRNA 相关联5常规研究 Fmr1 基因敲除动物实验表明，FMRP的表达对于突触神经传递的组装和可塑性尤为重要6多个条件性和嵌合型基因敲除模型进一步证明，FMRP的功能和信号在不同脑区、细胞类型及突触位点之间存在差异。&#160;在包括轴突投射、树突发育和突触可塑性在内的多种发育过程中7,8,9,10,11,12,13,14通过向脑切片或培养的神经元中细胞内递送抑制性FMRP抗体或FMRP蛋白本身，研究FMRP在调控突触传递中的急性功能15,16,17,18然而，这些方法无法在发育过程中追踪由FMRP异常表达所引发的后果。因此，有必要开发 体内 研究FMRP细胞自主功能的方法亟待建立，有望帮助确定脆性X综合征患者中报道的异常表现是FMRP在相关神经元和神经环路中缺失的直接后果，还是发育过程中由全网络变化引发的间接后果19.
鸡胚听觉脑干为深入分析脆性X智力低下蛋白（FMRP）在神经环路与突触发育中的调控功能提供了一个独特且极具优势的模型。鸡胚脑组织易于获取，且该模型已建立完善 在卵内 电穿孔技术在早期胚胎阶段脑发育的遗传学研究中发挥了重要作用。在最近发表的一项研究中，该技术与先进的分子工具相结合，实现了对FMRP异常表达的时间特异性调控。20,21在此，该方法被进一步改进，以分别对突触前神经元和突触后神经元进行选择性操控。该方法在听觉脑干环路中建立。声学信号由内耳听觉毛细胞接收，随后传递至听觉神经节（AG；在哺乳动物中亦称螺旋神经节）。AG中的双极神经元以其周围突支配毛细胞，并发出中枢投射（即听觉神经）至脑干，在此终止于两个主要的耳蜗核：核巨细胞（NM）和角状核（NA）。NM中的神经元在结构和功能上可类比于哺乳动物前腹侧耳蜗核中的球形丛状细胞。在NM内，听觉神经纤维（ANFs）与NM神经元的胞体形成突触连接。 通过 Held 大型终末膨大22在发育过程中，NM神经元起源于后脑的菱脑节5和6（r5/6）23，而AG神经元则源自位于耳囊中的神经母细胞24在此，我们描述了分别在突触前AG神经元和突触后NM神经元中选择性敲低FMRP表达的操作步骤。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;卵的孵化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16 &amp;deg;C 冰箱</td><td>MAGAT</td><td></td><td>用于受精卵的储存。</td></tr><tr><td>卵孵化仪</td><td>SHANGHAI BOXUN</td><td>GZX-9240MBE</td><td></td></tr><tr><td>受精卵</td><td>华南农业大学农场</td><td></td><td>为获得最佳活性，卵必须在一周内使用。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒制备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sigma</td><td>10016</td><td></td></tr><tr><td>快绿染料（Fast green）</td><td>Solarbio</td><td>G1661</td><td>用蒸馏水配制0.1%工作液，并进行高压灭菌。</td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒（Plasmid Maxi-prep kit）</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>将质粒DNA溶解于Tris-EDTA（TE）缓冲液中；使用无内毒素制备试剂盒</td></tr><tr><td>乙酸钠（Sodium Acetate）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>用无核酸酶水配制7.5 M工作液。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;电穿孔与多西环素给药&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BTX</td><td>ECM399</td><td></td></tr><tr><td>1 mL / 5 mL 注射器</td><td>广州康福莱</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>CNOPTEC</td><td>SZM-42</td><td></td></tr><tr><td>多西环素（Doxcycline）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td>每次给药使用新鲜分装样品，并于-20 &amp;deg;C保存。</td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>贝博博美</td><td>RD0910</td><td>0.9–1.1 mm × 100 mm</td></tr><tr><td>实验室封口膜（Parafilm）</td><td>PARAFILM</td><td>PM996</td><td>透明薄膜</td></tr><tr><td>拉针仪</td><td>成都仪器厂</td><td>WD-2</td><td>拉制条件：500 &amp;deg;C 持续15秒</td></tr><tr><td>铂电极</td><td>自制</td><td></td><td>直径0.5 mm，间距1.5 mm。</td></tr><tr><td>橡胶管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;组织解剖与固定&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td>尖端尺寸：0.05 × 0.01 mm</td></tr><tr><td>其他手术器械</td><td>RWD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（Paraformaldehyde）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td>新配制的4% PFA磷酸盐缓冲液可在4 &amp;deg;C保存最多一周。</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>DOW</td><td>01673921</td><td>用于黑色背景培养皿时，需添加食品级炭粉。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;切片&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机</td><td>LEICA</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>明胶（Gelatin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>来源于牛皮。</td></tr><tr><td>滑动式切片机</td><td>LEICA</td><td>SM2010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;免疫染色&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠二抗</td><td>Abcam</td><td>ab150113</td><td>1:500 稀释，RRID: AB_2576208</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 山羊抗兔二抗</td><td>Abcam</td><td>ab150078</td><td>1:500 稀释，RRID: AB_2722519</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Abcam</td><td>ab285390</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片剂</td><td>Southern&amp;nbsp;Biotech</td><td>Sb-0100-01</td><td></td></tr><tr><td>FMRP 抗体</td><td>Y. Wang, 佛罗里达州立大学</td><td>#8263</td><td>1:1000 稀释，RRID: AB_2861242</td></tr><tr><td>Islet-1 抗体</td><td>DSHB</td><td>39.3F7</td><td>1:100 稀释，RRID: AB_1157901</td></tr><tr><td>Netwell 培养板</td><td>Corning</td><td>3478</td><td></td></tr><tr><td>神经丝蛋白抗体（Neurofilament antibody）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td>1:1000 稀释，RRID: AB_477272</td></tr><tr><td>小清蛋白抗体（Parvalbumin antibody）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3088</td><td>1:10000 稀释，RRID: AB_477329</td></tr><tr><td>SNAP25 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab66066</td><td>1:1000 稀释，RRID: AB_2192052</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成像&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>ADOBE</td><td></td><td>图像编辑软件</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>LEICA</td><td>SP8</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>MVX10</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td>商用图像处理软件包</td></tr></tbody></table>

通过听觉环路解析脆性x智力低下蛋白的细胞自主功能 在卵内 电穿孔

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

脆性X智力低下蛋白（FMRP）是一种mRNA结合蛋白，可调控局部蛋白质翻译。FMRP的缺失或功能障碍会导致脆性X综合征（FXS）中出现异常的神经元和突触活动，该综合征以智力障碍、感觉异常以及社交沟通问题为特征。目前对FMRP功能及FXS发病机制的研究主要依赖于在转基因动物中敲除Fmr1基因（即编码FMRP的基因）。本文报道了一种利用鸡胚进行的体内方法，用于研究FMRP在神经环路组装和突触形成期间的细胞自主功能。该方法采用阶段特异性、位点特异性和方向特异性的电穿孔技术，导入包含Fmr1小发夹RNA（shRNA）和EGFP报告基因的药物可诱导载体系统。通过该方法，我们实现了在听觉神经节（AG）及其脑干靶区之一——巨细胞核（NM）中选择性敲低FMRP，从而实现了对AG-NM环路中特定组分的操控。此外，转染所呈现的嵌合模式可在同一动物内设置对照，并允许对邻近神经元或纤维进行比较，从而提高数据分析的可靠性和敏感性。该可诱导载体系统可对基因编辑的起始时间进行精确控制，以最小化发育过程中的累积效应。上述策略的结合为解析FMRP在突触和神经环路发育中的细胞自主功能提供了一种创新工具。

通过执行 在卵内 在不同部位和不同发育阶段进行电穿孔，我们实现了在听觉外周或听觉脑干中选择性地敲低FMRP。
在NM中敲低FMRP 
针对鸡Fmr1基因的小发夹RNA（shRNA）被设计并克隆至Tet-On载体系统中，具体方法如前所述20。在体电转染的实验装置如图1A所示。将用快绿染色的质粒DNA在HH12期注射至r5/r6水平的神经管内（图1B-C）。在r5/6水平的神经管两侧分别放置铂金双极电极（图1D）。施加两次12 V的脉冲，以将质粒驱动至电极正极侧的组织中。将多西环素（Dox）施加于尿囊绒毛膜上，以诱导Fmr1 shRNA和EGFP的表达。Dox处理24小时后，在荧光体视...

通过在卵内电穿孔技术，我们建立了一种方法，可在鸡胚发育过程中特定电路组装阶段，选择性地转染听觉内耳及耳蜗核，实现细胞群特异性的脆性X智力低下蛋白敲低。

通过听觉环路解析脆性X智力低下蛋白的细胞自主功能 在卵内 电穿孔

脆性X智力低下蛋白（FMRP）是一种可结合mRNA的蛋白质，可调控局部蛋白质的翻译。FMRP的缺失或功能障碍会导致……

本方案是一种在体内研究FMRP在发育过程中细胞自主功能的方法。该方法有助于理解脆性X综合征的细胞类型特异性病理生理机制。本方法采用特定时期、特定部位和特定方向的电穿孔技术，导入含有Fmr1小发夹RNA的药物可诱导载体系统。通过该方法，我们实现了在听觉回路中对 FMRP 的特异性敲低。该方法也可用于研究其他基因在听觉回路或前庭系统中的功能。首先将鸡蛋水平放置，使胚胎位于蛋的上方，便于操作。在38摄氏度下孵育46至48小时，直至达到Hamburger and Hamilton（HH）12期，用于神经管转染；或孵育54至56小时，直至HH 13期，用于耳囊转染。从孵育箱中取出鸡蛋，每次取一打。鸡蛋离开孵育箱的时间超过一小时会引入发育差异并降低存活率。使用手电筒从鸡蛋底部照射光线。胚胎的位置会在蛋壳上呈现为一个暗区。用铅笔在蛋壳上标记胚胎的位置。用含75%乙醇的纱布擦拭鸡蛋，在鸡蛋尖端用剪刀尖端钻一个小孔。然后，使用18号针头的注射器抽出2毫升蛋清。确保小孔仅足够插入针头即可。用纱布擦去渗出的白蛋白，并用透明胶带封住孔洞。用透明胶带覆盖蛋的顶部，中心对准铅笔标记的暗区，以尽量减少裂纹并防止开窗过程中壳碎片掉落。用含75%乙醇的纱布擦拭所有手术器械，并用75%乙醇擦拭已覆盖胶带的区域。使用小型剪刀在铅笔标记周围剪出一个一至二平方厘米的窗口，沿圆周操作。操作时保持剪刀平放，以避免损伤下方的胚胎。将开窗后的卵置于体视显微镜下，使用10倍目镜和2倍变焦。用1毫升注射器吸取墨水溶液，然后安装27号针头。使用镊子将针头弯曲成45度角。在显微镜下，从视杯边缘小心刺入，并将针头插入胚胎下方。注射约50微升墨水，使其扩散至明区下方，以实现胚胎的可视化。墨水将形成深色背景，便于清晰观察胚胎。使用拉针仪将玻璃毛细管拉制成移液针。在解剖显微镜下，用镊子小心地将毛细玻璃针的尖端打开至直径10至20微米。将移液管存放于储存盒中，直至使用。接下来，通过注射器对移液管末端的橡胶管施加负压，将0.5至1微升的质粒混合物吸入毛细玻璃移液管中。将卵置于显微镜下，使胚胎垂直定向，尾部朝向操作者。用一只手或三轴操纵器握住毛细移液管，将移液管尖端沿尾部至头部方向推进至菱脑节5到6区域。轻轻将吸头穿过卵黄膜，进入背侧神经管，然后稍微回撤移液器，使吸头位于神经管腔内。通过施加气压注入质粒混合物，直至带颜色的质粒充分扩散至第5至第6菱脑节，并延伸至第3和第4菱脑节。检查注射是否成功：当蓝色质粒溶液在神经管内快速扩散且无泄漏时，即为注射成功。当发生泄漏时，蓝色会迅速消退。注射后立即在神经管两侧放置铂金双极电极，使用电穿孔仪施加两轮脉冲，每轮电压为12伏，持续时间为50毫秒。观察双极电极末端的气泡，负极一侧气泡较多。检查电穿孔是否成功，当染色的质粒混合物进入电极正极侧附近的神经管组织时，即表示电穿孔成功。电穿孔后，小心移除双极电极。用预先切成两英寸见方并喷有75%乙醇的透明薄膜覆盖蛋壳上的窗口。将鸡蛋放回培养箱中。在处理下一个鸡蛋之前，通过在生理盐水中施加10至20次12伏、持续50毫秒的脉冲来清洁双极电极。在显微镜下，将卵放置成胚胎呈垂直方向，尾部朝向操作者。手持毛细移液管，轻轻从背外侧方向刺入右侧耳囊。利用气压注入质粒混合物，直至耳囊充满蓝色溶液。检查注射是否成功，成功的标志是蓝色质粒混合物被限制在耳囊内且无泄漏。注射后立即在耳囊上放置双极电极，将正极和负极分别置于耳囊的前侧和后侧。使用电穿孔仪传递两轮脉冲，每轮电压为12伏，持续时间为50毫秒。检查电穿孔是否成功，当蓝色质粒混合物进入耳囊组织靠近电极正极一侧时，即表示电穿孔成功。电穿孔后，小心移除双极电极，并用透明薄膜覆盖蛋壳上的窗口，最后将鸡蛋放回孵育箱中。代表性图像显示了在胚胎第2天（E2）进行神经管转染并给予多西环素处理后，胚胎第3天（E3）的示例。图中横截面显示了转染了Fmr1 shRNA和EGFP的细胞。表达EGFP的细胞局限于神经管和脑干的一侧。图中还展示了E15时期横截面上转染侧表达EGFP的巨细胞核（nucleus magnocellularis, NM）神经元。在对侧，可见含有 EGFP 的轴突位于尾侧丘系核（nucleus laminaris, NL）的腹侧部分。通过转染 NM 神经元后，FMRP 免疫反应性较邻近未转染神经元显著降低，从而验证了 Fmr1 shRNA 的敲低效果。图中显示了 E19 期具有 FMRP 免疫反应性的听觉神经节。听觉神经节神经元未进行转染。部分来源于颅神经嵴细胞的胶质细胞被转染。代表性图像显示，在耳囊转染后，听觉管中FMRP表达被敲低。E9时期的听觉管表现出强烈的EGFP荧光。在横断面切片中，表达EGFP的细胞位于基底乳头和听觉神经节。通过与邻近未转染的毛细胞相比，转染毛细胞中FMRP免疫反应性降低，验证了Fmr1 shRNA的敲低效果。类似地，转染的听觉神经节神经元中FMRP免疫反应性也显著减弱。通过听觉神经及其特征性的端足终末，追踪转染的听觉神经节神经元在脑干中的中枢投射。在进行该操作时，最重要的是控制电穿孔的位点和方向，以实现选择性转染。在此操作之后，可进行单细胞类型填充、免疫染色、细胞分选结合质谱分析，或单细胞测序，以揭示形态学和生物化学水平上的变化。该技术还可实现对听觉耳中干细胞回路的其他基因进行具有时间控制和组分特异性的选择性编辑，并可加以改造以操控前庭系统。

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神经科学

通过产 卵电 穿孔解剖听觉回路中脆性X智力迟钝蛋白的细胞自主功能

本文介绍了一种利用独特手术方法和特殊形状电极将基因转入发育中 小鼠大脑...

小鼠 在子宫内 电穿孔：可控时空基因转染

神经元迁移受到多种细胞自主性和非细胞自主性因素的调控。本方案展示了如何 在子宫内 电穿孔可用于确定转基因小鼠的表型是源于细胞内在机制的破坏，还是源于神经元与其环境之间相互作用的受损。...

通过诱导实现蛋白质删除 子宫内 电穿孔法在转基因模型中界定神经元迁移缺陷

我们介绍一种从胚胎小鼠内耳分离和培养耳蜗外植体的方法。同时，我们还演示了通过方波电穿孔法将基因转入耳蜗外植体的技术。体外外植体培养结合基因转移技术，使研究人员能够研究在发育过程中改变基因表达所产生的影响。...

小鼠胚胎耳蜗外植体培养及电穿孔介导的基因转导

本文介绍了一种用于研究海马发育过程中特定基因调控机制的实验方案。通过采用 子宫外...

Ex Utero 电穿孔与小鼠海马组织的器官型切片培养

室管膜下结节状异位（PNH）是成年期最常见的皮质发育畸形（MCD）形式，但在大多数散发病例中，其遗传基础仍不明确。我们近期开发了一种策略，用于识别MCDs的新型候选基因，并直接验证其致病作用 体内.

一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略 子宫内 电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法...

通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

本文提供了使用以下方案 在子宫内...

子宫内 研究神经元亚群兴奋性及单细胞连接性的电穿孔技术

鸟类和哺乳动物的听觉脑干神经元专门负责快速神经编码，这是正常听觉功能的基本过程。这些神经元起源于胚胎后脑的不同前体细胞。本文介绍了利用电穿孔技术在鸡胚后脑中表达基因的方法，以研究基因在听觉发育过程中的功能。...

在卵内 鸡听觉脑干中的电穿孔技术

子宫内双次电穿孔技术可用于靶向空间和时间上分离的细胞群体。该技术可用于在正常条件下通过荧光蛋白观察这些细胞群体之间的相互作用，也可在功能实验干扰目的基因后进行观察。...

双子宫内电穿孔技术用于时空分离的细胞群体靶向

鸡是一种经济、易得且广泛可用的模式生物，适用于多种研究。本文详细描述了一系列实验方案，旨在揭示禽类内耳发育与再生的分子机制。...

In Ovo 与 Ex Ovo 研究禽类内耳发育的方法

了解利用产卵电穿孔技术在鸡胚听觉回路中特异性敲低脆性X智力迟钝蛋白的细胞自主功能研究方法。该技术可揭示脆性X综合征的细胞类型特异性病理机制，适用于听觉和前庭系统基因功能研究。

通过听觉环路解析脆性X智力低下蛋白的细胞自主功能在卵内电穿孔

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通过听觉环路解析脆性X智力低下蛋白的细胞自主功能 在卵内 电穿孔

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