Name: 机器人钻孔开颅术对小鼠颅窗手术热损伤的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 了解利用手术机器人在转基因小鼠上进行半自动化颅窗钻孔的方法，以减少热损伤并提高活体成像的标准化程度。该方法通过脉冲逐点钻孔显著降低脑部热损伤。

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本研究部分得到了美国退伍军人事务部康复研究与发展服务局的功绩评审奖资助，项目编号为 GRANT12418820（Capadona）和 GRANTI01RX003420（Shoffstall/Capadona），以及研究职业科学家奖 #GRANT12635707（Capadona）。此外，本工作还部分得到了美国国立卫生研究院、国家神经疾病与卒中研究所 GRANT12635723（Capadona）以及国家生物医学成像与生物工程研究所 T32EB004314（Capadona/Kirsch）的资助。本材料基于美国国家科学基金会研究生研究奖学金（资助号：GRANT12635723）支持的工作。本材料中表达的任何观点、发现、结论或建议均为作者（们）的观点，不一定反映美国国家科学基金会的立场。

<ol><li>Kilic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Frontiers in Physiology. 11, 612678(2020).</li>
<li>Goldey, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removable+cranial+windows+for+long-term+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).</li>
<li>Augustinaite, S., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+optical+signal+imaging+and+targeted+injections+through+a+chronic+cranial+window+of+a+head-fixed+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intrinsic optical signal imaging and targeted injections through a chronic cranial window of a head-fixed mouse.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100779(2021).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+skull-removed+chronic+cranial+window+for+ultrasound+and+photoacoustic+imaging+of+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A skull-removed chronic cranial window for ultrasound and photoacoustic imaging of the rodent brain.</a> Frontiers in Neuroscience. 15, 673740(2021).</li>
<li>Wang, Y., Xi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+window+for+photoacoustic+imaging%3A+a+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Computing+for+Industry%2C+Biomedicine%2C+and+Art%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial window for photoacoustic imaging: a mini review.</a> Visual Computing for Industry, Biomedicine, and Art. 4 (1), 15(2021).</li>
<li>Augustinaite, S., Kuhn, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+window+for+imaging+cortical+activity+in+head-fixed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial window for imaging cortical activity in head-fixed mice.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100194(2020).</li>
<li>Kunori, N., Takashima, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+implantable+cranial+window+using+a+collagen+membrane+for+chronic+voltage-sensitive+dye+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An implantable cranial window using a collagen membrane for chronic voltage-sensitive dye imaging.</a> Micromachines. 10 (11), 789(2019).</li>
<li>Beckmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+deep-brain+imaging+in+mouse+using+visible-light+optical+coherence+tomography+through+chronic+microprism+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Longitudinal deep-brain imaging in mouse using visible-light optical coherence tomography through chronic microprism cranial window.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5235-5250 (2019).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Scientific Reports. 6, 27818(2016).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neocortical+neurons+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 694-701 (2012).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Sundaram, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+brain+permeant+fluorescent+molecule+and+visualization+of+Abeta+parenchymal+plaques%2C+using+real-time+multiphoton+imaging+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Organic+Letters%22%5BJournal%5D)">Characterization of a brain permeant fluorescent molecule and visualization of Abeta parenchymal plaques, using real-time multiphoton imaging in transgenic mice.</a> Organic Letters. 16 (14), 3640-3643 (2014).</li>
<li>Spires, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+abnormalities+in+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice+demonstrated+by+gene+transfer+and+intravital+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine abnormalities in amyloid precursor protein transgenic mice demonstrated by gene transfer and intravital multiphoton microscopy.</a> Journal of Neuroscience. 25 (31), 7278-7287 (2005).</li>
<li>Price, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+large-scale+mosaic+imaging+using+multiphoton+microscopy+to+characterize+transgenic+mouse+models+of+human+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">High-resolution large-scale mosaic imaging using multiphoton microscopy to characterize transgenic mouse models of human neurological disorders.</a> Neuroinformatics. 4 (1), 65-80 (2006).</li>
<li>Kimchi, E. Y., Kajdasz, S., Bacskai, B. J., Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cerebral+amyloid+angiopathy+in+a+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer+disease+using+in+vivo+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of cerebral amyloid angiopathy in a transgenic mouse model of Alzheimer disease using in vivo multiphoton microscopy.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 60 (3), 274-279 (2001).</li>
<li>Hyman, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+Alzheimer+disease+dissected+through+multiphoton+imaging+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer+Disease+and+Associated+Disorders%22%5BJournal%5D)">The natural history of Alzheimer disease dissected through multiphoton imaging of transgenic mice.</a> Alzheimer Disease and Associated Disorders. 20 (4), 206-209 (2006).</li>
<li>Korzhova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dynamics+of+aberrant+neuronal+activity+in+awake+Alzheimer%27s+disease+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Long-term dynamics of aberrant neuronal activity in awake Alzheimer's disease transgenic mice.</a> Communications Biology. 4 (1), 1368(2021).</li>
<li>Chawda, C., McMorrow, R., Gaspar, N., Zambito, G., Mezzanotte, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+immune+cell+function+through+optical+imaging%3A+a+review+highlighting+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Monitoring immune cell function through optical imaging: a review highlighting transgenic mouse models.</a> Molecular Imaging and Biology. 24 (2), 250-263 (2022).</li>
<li>Courtin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neuronal+mechanism+for+motivational+control+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A neuronal mechanism for motivational control of behavior.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).</li>
<li>Cramer, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Through+the+looking+glass%3A+A+review+of+cranial+window+technology+for+optical+access+to+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Through the looking glass: A review of cranial window technology for optical access to the brain.</a> Journal of Neuroscience Methods. 354, 109100(2021).</li>
<li>Eles, J. R., Vazquez, A. L., Kozai, T. D. Y., Cui, X. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+inflammatory+response+and+fibrous+tissue+remodeling+around+intracortical+implants%3A+An+in+vivo+two-photon+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Meningeal inflammatory response and fibrous tissue remodeling around intracortical implants: An in vivo two-photon imaging study.</a> Biomaterials. 195, 111-123 (2019).</li>
<li>Jorfi, M., Skousen, J. L., Weder, C., Capadona, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+biocompatible+intracortical+microelectrodes+for+neural+interfacing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Progress towards biocompatible intracortical microelectrodes for neural interfacing applications.</a> Journal of Neural Engineering. 12 (1), 011001(2015).</li>
<li>Cole, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Craniotomy%3A+true+sham+for+traumatic+brain+injury%2C+or+a+sham+of+a+sham%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Craniotomy: true sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham.</a> Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).</li>
<li>Shoffstall, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+for+thermal+damage+to+the+blood-brain+barrier+during+craniotomy%3A+implications+for+intracortical+recording+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes.</a> Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001(2018).</li>
<li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+for+blood-brain+barrier+integrity%3A+how+appropriate+is+Evans+blue+in+the+twenty-first+century+and+what+are+the+alternatives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Markers for blood-brain barrier integrity: how appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives.</a> Frontiers in Neuroscience. 9, 385(2015).</li>
<li>Wang, H. L., Lai, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Evans+blue+quantitation+in+limited+rat+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples.</a> Scientific Reports. 4, 6588(2014).</li>
<li>Goss-Varley, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+implantation+in+motor+cortex+causes+fine+motor+deficit%3A+Implications+on+potential+considerations+to+Brain+Computer+Interfacing+and+Human+Augmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microelectrode implantation in motor cortex causes fine motor deficit: Implications on potential considerations to Brain Computer Interfacing and Human Augmentation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 15254(2017).</li>
<li>Oomoto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+cortical-wide+field-of-view+two-photon+imaging+with+quick+neonatal+adeno-associated+virus+injection%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for cortical-wide field-of-view two-photon imaging with quick neonatal adeno-associated virus injection.</a> STAR Protocols. 2 (4), 101007(2021).</li>
<li>Dougherty, J. D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+transgenesis+in+a+single+locus+with+independent+regulation+for+multiple+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores.</a> PLoS One. 7 (7), 40511(2012).</li>
<li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).</li>
<li>Kiyatkin, E. A., Sharma, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+the+blood-brain+barrier+depends+on+brain+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Permeability of the blood-brain barrier depends on brain temperature.</a> Neuroscience. 161 (3), 926-939 (2009).</li>
<li>Eriksson, A. R., Albrektsson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+threshold+levels+for+heat-induced+bone+tissue+injury%3A+a+vital-microscopic+study+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Prosthetic+Dentistry%22%5BJournal%5D)">Temperature threshold levels for heat-induced bone tissue injury: a vital-microscopic study in the rabbit.</a> The Journal of Prosthetic Dentistry. 50 (1), 101-107 (1983).</li>
<li>Bonfield, W., Li, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+temperature+dependence+of+the+deformation+of+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">The temperature dependence of the deformation of bone.</a> Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).</li>
<li>Hrapkiewicz, K., Medina, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHrapkiewicz%2C+K+%22Clinical+Laboratory+Animal+Medicine%2C+second+ed%22">Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed</a>. , Blackwell Publishing. Ames Iowa. (2007).</li>
<li>McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+thermal+Injury.+VI.+Hyperpotassemia+caused+by+cutaneous+exposure+to+excessive+heat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigations%22%5BJournal%5D)">Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat.</a> Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).</li>
<li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e52642(2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要声明。本内容不代表美国退伍军人事务部、美国国立卫生研究院或美国政府的观点。

使用伊文思蓝染料（EB染料）及成像技术操作简便、快速，对于评估新方法和技术在脑部血管损伤方面的效果具有重要价值。无论是在使用手术机器人，还是在验证实验室当前已有方法时，验证手术技术以区分实验处理效应与手术本身影响，并改善动物福利，都是至关重要的。采用热电偶装置也有助于评估钻孔方法，确保不产生热损伤。已知骨组织钻孔过程中温度升高可导致组织损伤，即使温度升高5 °C，也足以在脑内引发显著的血管损伤32,33,34,35,36。建议采用本文详述的方法，以优化实验室和手术技术。
尽管热电偶评估具有一定的应用价值，但也存在一些局限性。由于需要在颅骨侧面钻孔以将热电偶插入脑内，且可能对脑组织造成损伤，因此热电偶数据只能通过尸体小鼠获取。因此，所测得的温度差异反映的是钻孔条...

颅窗技术已广泛应用于神经科学、神经工程学和生物学领域，用于在活体动物中直接观察和成像大脑皮层1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11转基因小鼠与多光子成像技术的强强联合，为研究神经环路活动及其他生物学过程提供了极为宝贵的见解 体内 脑12,13,14,15,16,17,18颅骨上安装的微型显微镜进一步拓展了这些能力，实现在清醒、自由活动动物中的记录19. 制作颅窗的过程需要使用电动钻头磨薄或完全去除颅骨，以形成足够大的颅骨开窗，从而在大脑皮层上方固定一块透明玻璃20聚二甲基硅氧烷（PDMS）及其他聚合物也已被测试作为颅窗材料9,21最终，理想的颅窗应是不改变或干扰其下方正常内源性活动的。然而，通常认为颅窗钻孔会加重下方组织的损伤，导致脑组织损害、微环境破坏，并影响脑膜，严重时可阻碍多光子成像的深度22由此产生的神经炎症具有多种影响， ranging 从血脑屏障（BBB）通透性的改变，到胶质细胞在植入部位周围的激活与募集23因此，建立更安全且可重复性更高的颅窗钻孔方法，对于获得稳定的成像质量并减少混杂因素至关重要。
尽管操作中已采取措施尽量减少对深层组织的损伤，但钻骨过程仍可能对脑组织造成热效应和机械性干扰24,25。意外的钻头穿透硬脑膜所导致的机械性创伤，还可能进一步引发不同程度的皮层损伤24。Shoffstall 等人的一项研究25表明，钻骨产生的热量会导致血脑屏障（BBB）通透性增加，这通过脑实质中出现伊文思蓝（Evans Blue, EB）染料得以证实25。EB 染料经静脉注射后，会与血液中循环的白蛋白结合，因此在正常情况下不会以显著浓度穿过健康的血脑屏障。因此，EB 染料常被用作检测血脑屏障通透性的敏感标志物26,27。尽管该研究未直接评估血脑屏障通透性对后续所研究生物学继发效应的影响，但先前的研究已将血脑屏障通透性的增加与慢性植入微电极后神经炎症反应的增强以及运动功能的改变相关联28。
根据研究目标的不同，热损伤和机械损伤的程度可能成为实验误差的来源，对研究的严谨性和可重复性产生负面影响。已有数十种文献报道的方法用于制备颅窗，这些方法各自采用不同的钻孔设备、转速、技术以及操作人员1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。Shoffstall 等人25报道，观察到的加热效应差异归因于钻孔过程中施加力的大小、进给速率以及施加角度等方面的变异，而这些因素在手动钻孔时无法有效控制25。人们普遍认为，自动化钻孔系统及其他立体定位设备可提高实验结果的可重复性和一致性，但已发表的方法学研究尚未将温度变化或血脑屏障通透性作为评估指标进行严格评价。因此，亟需建立更具可重复性且操作一致的方法来制备颅窗，同时也需要建立严格的方法以评估颅窗钻孔对下方神经组织的影响。
本研究的重点是确定并开发用于开颅窗的稳定且安全的钻孔方法。用于安装颅窗的开颅骨窗尺寸明显大于用于植入脑部微电极的标准开颅窗。使用标准设备时，此类开颅操作无法通过单个钻孔完成，因而手工操作时会引入更多的术者间技术差异。20手术机器人已引入该领域，但尚未得到广泛应用1,6,29自动化钻孔可控制导致试验间差异的变量，表明使用该设备可减少 术者间与术者内效应。鉴于开颅窗所需较大颅骨切口带来的额外操作难度，这一点尤为值得关注。尽管可以假设自动化钻孔所具备的控制性具有明确优势，但针对此类设备实际应用效果的评估仍十分有限。虽然尚未观察到明显的组织损伤5因此，建议使用EB进行更高灵敏度的检测。
在此，使用一种市售的外科钻孔机器人及其配套软件来测量血脑屏障（BBB）通透性，该系统可编程设定立体定位坐标、进行颅骨开窗规划/映射，并提供多种钻孔模式选择（“逐点式”与“水平式”），后者指钻头的行进路径。首先钻出八个“种子”点（图1A），以勾勒出颅骨开窗的轮廓。随后，采用“逐点式”或“水平式”钻孔方法将种子点之间的区域切除。“逐点式”执行垂直的引导孔切割（类似于数控钻床），而“水平式”则沿颅骨开窗的周缘进行水平切割，以界定出开窗区域（类似于数控铣床）。两种方法最终均可形成一块可移除的颅骨组织，从而暴露颅骨开窗区域。为避免额外损伤，实验中并不实际移除颅骨开窗部分，以隔离钻孔本身造成的损伤。通过伊文思蓝（EB）染料结合荧光成像的方法，在小鼠实施颅骨开窗术后检测血脑屏障通透性，同时插入热电偶直接测量钻孔过程中脑表面的温度（图1B，C）。既往观察表明，以2秒为间隔进行脉冲式钻孔（开/关交替）足以缓解钻头产热25，因此本实验方案将该参数纳入外科机器人的操作流程中。
本研究旨在展示评估开颅钻孔过程中热损伤的方法。尽管这些方法是在自动钻孔的背景下进行介绍的，但同样适用于手动钻孔操作。这些方法可用于在将设备或钻孔方案作为标准操作规程采用之前，验证其有效性与安全性。
<img alt="小鼠基因工程流程图，包括注射、细胞培养、孵育。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64188/64188fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程示意图。 示意图展示了小鼠在颅窗手术后进行伊文思蓝（EB）定量所经历的流程。（A）小鼠在立体定位仪和手术机器人钻孔装置下的示意图。图中显示了覆盖运动皮层的颅窗示例，以及种子点（绿色）和边缘点（蓝色）。（B）灌注装置包括向小鼠全身注入1×磷酸盐缓冲液（PBS）以清除血液，随后取出脑组织。（C）然后将脑组织放入EB荧光成像系统腔室，对伊文思蓝染料进行荧光成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64188/64188fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>1×磷酸盐缓冲液&lt;br/&gt; 类型：试剂</td><td>VWR</td><td>MRGF-6235</td><td>伊文思蓝稀释液</td></tr><tr><td>Aura 软件&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>Spectral Instruments Imaging</td><td></td><td>用于Lumina成像系统的开源图像处理软件</td></tr><tr><td>布托啡诺&lt;br/&gt; 类型：药物</td><td>来自动物设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳化钨钻头，0.6 mm（机器人钻）&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>Stoelting</td><td>58640-1</td><td></td></tr><tr><td>卡洛芬&lt;br/&gt; 类型：药物</td><td>源自动物设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>头孢唑林&lt;br/&gt; 类型：药物</td><td>来自动物设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>伊文思蓝染料&lt;br/&gt; 类型：试剂</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>用1×磷酸盐缓冲液重悬</td></tr><tr><td>异氟烷&lt;br/&gt; 类型：药物</td><td>源自动物设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS136334</td><td>IVIS Lumina III 目前已取代市场上的 Lumina II</td></tr><tr><td>Jenco线性化温度计&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>Jenco</td><td>765JF</td><td>热电偶设置</td></tr><tr><td>氯胺酮&lt;br/&gt; 类型：药物</td><td>来自动物设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LivingImage&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>IVIS Lumina III 软件</td></tr><tr><td>Marcaine&lt;br/&gt; 类型：药物</td><td>源自动物设施</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurostar 软件&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>斯托尔廷</td><td></td><td>随手术机器人购买附赠</td></tr><tr><td>MouseSTAT 生理监测系统&amp;reg; 脉搏血氧仪 &amp;和心率监测器&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-03</td><td>用于监测生命体征</td></tr><tr><td>PrismPlus小鼠&lt;br/&gt; 类型：动物</td><td>杰克逊实验室</td><td>031478，RRID:IMSR_JAX:031478，雄性，约8月龄</td><td>用于研究的动物</td></tr><tr><td>Stoelting 钻孔与注射机器人用于电动立体定位仪&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>Stoelting</td><td>58640</td><td>主机器人钻机与立体定位架</td></tr><tr><td>热电偶&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>TC Direct</td><td>206-557</td><td>热电偶设置</td></tr><tr><td>USB-6008 多功能 I/O 数据采集设备&lt;br/&gt; 类型：工具</td><td>国家仪器公司</td><td>USB-6008</td><td>热电偶设置</td></tr><tr><td>赛拉嗪&lt;br/&gt; 类型：药物</td><td>源自动物实验设施</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠颅窗手术中机器人钻孔开颅所致热损伤评估

Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

颅骨窗手术可利用双光子或其他活体成像技术对活体小鼠脑组织进行成像。然而，手工实施任何开颅手术时，常会导致脑组织产生热损伤，这种损伤在不同手术间具有固有的变异性，并可能依赖于术者的个体操作技术。引入手术机器人可实现手术操作的标准化，从而减少与手术相关的热损伤。本研究测试了三种机器人钻孔方法以评估其热损伤程度：水平钻孔、逐点钻孔和脉冲式逐点钻孔。水平钻孔采用连续钻孔模式，而逐点钻孔则在颅骨窗范围内钻出多个小孔。脉冲式逐点钻孔在此基础上增加了脉冲模式 &#34;2秒开启，2秒关闭&#34; 钻孔方案设计为允许在钻孔过程中进行间歇性冷却。通过静脉注射伊文思蓝（Evans Blue, EB）染料并进行荧光成像，可评估脑组织损伤程度；同时在钻孔部位下方放置热电偶以测量热损伤。热电偶结果显示，脉冲式逐点钻孔组的温度变化显著低于水平钻孔组和连续逐点钻孔组，分别为6.90 °C ± 1.35 °C、16.66 °C ± 2.08 °C 和18.69 °C ± 1.75 °C。同样，在颅窗钻孔后，脉冲式逐点钻孔组的EB染料渗漏明显少于水平钻孔组，表明其对脑内血管的损伤更小。因此，脉冲式逐点钻孔方法似乎是减少热损伤的最佳钻孔方案。机器人钻孔设备是一种有助于减少操作培训需求、降低操作变异性并减少热损伤的有效工具。随着多光子成像技术在各研究实验室中的广泛应用，提升实验的严谨性和可重复性显得尤为重要。本文所述方法将有助于指导研究人员更有效地使用此类手术机器人，从而推动该领域的发展。

热效应评估 
通过测量使用横向（图2A）、逐点（图2B）和脉冲式逐点（图2C）方法进行钻孔时相对于基线的温度变化，评估了热损伤的潜在风险。图2D展示了获取热数据的实验装置。热效应评估采用 N = 4 个颅窗样本。横向法与逐点法采用相同的初始钻孔示意图，但在边缘点切割方式上有所不同。脉冲式逐点法则在初始钻孔和边缘钻孔部分均采用脉冲模式。对于横向法，初始钻孔的最大温度变化为 16.66 °C ± 2.08 °C，边缘钻孔为 9.08 °C ± 0.37 °C。对于逐点法，初始钻孔的最大温度变化为 18.69 °C ± 1.75 °C，边缘钻孔为 8.53 °C ± 0.36 °C。对于脉冲式逐点法，初始钻孔的最大温度变化为 6.90 °C ± 1.35 °C，边缘钻孔为 4.10 °C ± 0.51 °C。横向钻孔与逐点钻孔方案在热变化方面无显著差异。然而，改用脉冲...

颅窗手术已成为转基因小鼠活体成像中广泛应用的外科技术。本方案描述了一种手术机器人的使用方法，该机器人可进行半自动化的颅骨钻孔以制备颅窗，有助于减少不同手术者之间的操作差异，并部分减轻因热损伤导致的血脑屏障破坏。

颅窗手术能够利用多光子或其他活体成像技术对活体小鼠的脑组织进行成像。然而，……

本方案提供了一种评估颅窗钻孔所致血管损伤的方法。使用手术机器人可提高手术操作的一致性，同时减少掌握该技术所需的训练时间。在本操作过程中，我们采用了颅内注射，该步骤可能极具挑战性。我们建议初次接触该技术的研究人员进行充分的培训。首先，按照论文中所述设置系统，并根据手术机器人手册完成帧校准。然后进入手术软件，通过选择“以空白项目开始”来创建一个新项目。然后在顶部将受试对象设置为小鼠，以指定要使用的钻孔坐标图谱。接着选择“开始新项目”，并点击左下角的“规划”以进入钻孔坐标规划界面。通过在立体定位图谱的任意位置点击，创建将要实施的颅窗技术钻孔方案。以bregma为参考点，输入文中所述的运动皮层坐标。按键盘上的Enter键以更新选定的坐标。单击“存储目标”以保存这些坐标，并输入适当的名称。然后单击左下角的移动按钮，返回主钻孔界面。单击工具，然后选择项目，再选择“另存为”选项，以便将此模板项目用于后续实验，因为它会自动保留钻孔坐标。首先，对麻醉后的小鼠皮下注射抗生素头孢唑林、镇痛剂卡洛芬和布托啡诺。接下来，将小鼠置于加热垫上，并通过鼻罩吸入0.5%至2%异氟烷维持麻醉状态。使用配套的耳杆将动物固定在手术机器人立体定位仪框架上，并通过脚趾夹捏常规评估生命体征和麻醉深度。随后用氯己定葡萄糖酸盐和70%异丙醇对手术区域进行消毒清洁。将无菌塑料膜覆盖在小鼠和立体定位仪上，以维持手术过程中的无菌环境。使用手术刀片在颅骨正中线上做一英寸长的切口，切口从眼睛后方开始，用带有棉头的涂抹棒蘸取3%过氧化氢干燥并清洁颅骨。为便于尾部注射，用酒精擦拭尾部。用拇指和食指弯曲尾部，使尾部弯曲处上方的尾静脉暴露。将注射器与静脉平行插入，缓慢注入伊文思蓝溶液。注射完成后，等待五分钟，使伊文思蓝充分循环。 成功的注射可立即通过小鼠的四肢和手术窗口变蓝来确认。颅骨准备好钻孔后，返回手术软件并点击工具。然后选择项目，接着选择新建，并从下拉菜单中选择一个模板项目以使用模板项目。选择相同的实验方案元素。单击规划，然后选择要沿用至本新项目中的钻孔参数，再单击启动新项目。接下来，通过单击工具并选择校正倾斜与缩放，打开校正界面，以校正当前动物小鼠颅骨的倾斜度和缩放比例，从而调整钻孔位置和框架。在屏幕顶部，通过点击浅红色的钻头按钮，确保钻头处于激活状态。校正完成后，通过点击屏幕底部中央的“关闭”按钮退出校正窗口，然后点击“工具”，再选择“钻头”，进入钻孔操作界面，开始钻孔操作。通过选择屏幕顶部的颅骨开窗形状窗口，随后查看下拉菜单中的钻孔目标详细信息，确认钻孔位置。若要执行手动脉冲钻孔，请在钻头菜单中取消勾选“自动停止”选项旁的复选框，以关闭自动停止功能，从而可手动控制钻头启停以实现脉冲操作。在钻孔菜单中，选择 100 微米作为钻孔深度进给量。打开钻孔位点菜单并导航至第一个钻孔位点。使用前进按钮或手动控制降低钻头，直至其接触颅骨，当钻头到达颅骨时按下“设定表面”按钮。准备就绪后，单击“advance”开始钻孔。当钻头前进100微米后，按两次Esc键停止钻孔。两秒后，重复此循环直至达到颅骨所需深度。在钻孔过程中，针对每个种子点和边缘点，一旦到达硬脑膜，需立即通过钻孔菜单中的按钮设置硬脑膜状态。使用热电偶结合三种不同的钻孔方案，并连接数据采集系统，将颅骨和脑组织的温度变化实时读取至 MATLAB 中进行测量。将一具小鼠尸体固定于立体定位仪框架上，并安装机器人钻孔装置。在颅骨侧面距离将要制作颅窗的位置约两毫米处手动钻一个小孔，以便将热电偶滑入颅窗钻孔区域的下方。按照先前演示的方法，开始对三种钻孔方案进行钻孔操作，由于温度变化产生尖峰信号，表明钻头穿过颅骨时脑部附近出现升温现象。通过测量水平钻孔、逐点钻孔和脉冲式逐点钻孔方法在钻孔过程中相对于基线的温度变化，评估热损伤的可能性。水平钻孔和逐点钻孔方案在温度变化方面均无显著差异。然而，改为脉冲式逐点钻孔方法后，相较于水平钻孔和常规逐点钻孔，脑组织的升温显著减少。水平边缘钻孔耗时300秒，而逐点边缘钻孔耗时200秒。脉冲法在种子钻孔和边缘钻孔中耗时最长，每种均约需500秒。为监测钻孔方案与血管损伤之间的关系，进行了伊文思蓝荧光成像。通过水平逐点切割方式进行的钻孔被发现会对脑内血管系统造成损伤。与对照组相比，逐点脉冲法在种子点和边缘点处的局部损伤较小，但在颅窗内仍可见伊文思蓝染料的存在。手动钻孔时，每次推进钻头后都必须检查颅骨开窗情况，以确保硬脑膜未被穿透。除了颅窗手术外，还可使用手术机器人进行标准的颅骨切除术，以改善手术效果。

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科研

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机器人钻孔开颅术对小鼠颅窗手术热损伤的评估

本视频和实验方案演示了如何在啮齿类动物中植入玻璃覆盖的颅窗。此类制备可用于长期活体双光子成像，对新皮层进行数月时间尺度的观察。该方法也可用于其他类型的成像，包括光学内在信号成像。...

一种用于慢性脑成像的开颅手术操作流程

本文演示了小鼠创伤性脑损伤的成熟模型——侧向液体脉冲冲击（LFP）。LFP...

侧向液体冲击：小鼠创伤性脑损伤模型

本视频介绍了一种在小鼠模型中植入颅窗的手术方法，以实现对大脑不同区域的稳定光学观测。...

小鼠颅窗植入术：一种用于稳定光学接触小鼠脑区的玻璃盖片植入手术方案

关键词：颅窗植入，小鼠模型，光学成像，玻璃盖片，脑部手术，活体成像

本视频演示了通过开颅方式在小鼠中诱导创伤性脑损伤的操作步骤：沿颅骨中线做切口，钻透颅骨并移除骨瓣以暴露脑皮层，施加高压以造成损伤。随后缝合伤口，制备可用于后续实验的小鼠模型。...

使用撞击探针建立小鼠创伤性脑损伤模型

急性脑损伤是一种目前尚无有效治疗方法的严重创伤。多光子显微镜技术可实现对急性脑损伤在啮齿类动物中发展过程的纵向研究，并用于探索治疗策略。通过多光子显微镜研究的两种急性脑损伤模型包括 体内...

小鼠急性脑损伤后纵向双光子成像

创伤性脑损伤（TBI）仍然是一个严重的健康问题。通过使用控制性皮质冲击手术模型，可以开展针对TBI的影响及潜在治疗方法的研究。...

创伤性脑损伤的可控皮层冲击模型

本方案展示了开颅小鼠创伤性脑损伤模型的建立方法，以及将体外培养的人诱导多能干细胞来源的细胞移植至损伤部位的技术。同时简要描述了对这些操作结果进行的行为学和组织学检测。...

小鼠脑损伤的可控皮层冲击模型结合人诱导多能干细胞来源神经细胞的治疗性移植

本文介绍了一种通过开放式颅脑控制性皮质冲击诱导小鼠创伤性脑损伤的实验方案。...

用于诱导创伤性脑损伤的可控皮层冲击小鼠模型

本研究展示了对小鼠施加重复性创伤性脑损伤，同时植入颅窗，以便后续通过双光子显微镜对神经元表达的EGFP进行活体成像。...

利用双光子显微镜对具有闭合性颅脑损伤及颅窗的小鼠进行荧光蛋白表达的活体成像

本方案描述了一种两阶段手术方法，用于在小鼠中创建一个大尺寸、可重复密封且保留硬脑膜的颅窗。该技术能够在数周时间内对分布式的深部脑网络（如默认模式网络）进行长期、多模态的电生理记录。...

用于小鼠默认模式网络纵向多模态电生理记录的大尺寸可重复密封颅窗手术方案

了解利用手术机器人在转基因小鼠上进行半自动化颅窗钻孔的方法，以减少热损伤并提高活体成像的标准化程度。该方法通过脉冲逐点钻孔显著降低脑部热损伤。

小鼠颅窗手术中机器人钻孔开颅所致热损伤评估

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