Name: 东方果蝇背侧芽孢杆菌CRISPR/Cas9诱变实验方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学习利用CRISPR/Cas9技术在东方果蝇Bactrocera dorsalis中进行基因诱变的高效低成本实验方案。该方法可产生80%嵌合突变体，为入侵害虫的功能基因研究和环境友好型防治策略提供重要技术支持。

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本工作由深圳市科技创新计划（资助编号：KQTD20180411143628272）以及深圳市大鹏新区科技创新与产业发展专项资金（资助编号：PT202101-02）支持。

1. 靶点设计与 体外 sgRNA的合成
<ol>
	<li>预测目标基因的结构并确定外显子与内含子之间的边界 通过 生物信息学分析 B. dorsalis 基因组（此处使用的软件应用程序列于 材料表). 
	注意：BLAT20 用于在基因组中搜索潜在的基因位点。使用Hisat2将高质量的RNA-seq测序读段（转录组）比对至获得的基因位点21. Samtools22 用于生成排序后的 bam 文件。将排序后的 bam 文件作为输入提供给 Stringtie223 以提供组装的转录本。组装的转录本与基因位点信息由 Transdecoder 进行整合。24通过 Transdecoder 获得的结果在 IGV 工具中进行了可视化展示25 外显子与内含子之间的边界得以确定。</li>
	<li>在候选靶基因位点内确定合适的靶区域。总长度必须小于750 bp，以便于测序图1B）。设计特异性引物，通过 PCR 从野生型基因组 DNA 中扩增目标区域（图1B（引物：F-引物：AACATTGAATATCTGGAATCAGGTAAACT，R-引物：CCTCATTGTTGATTAATTCCGACTTC）。将PCR产物克隆至平末端载体中26 并选取20个单菌落进行测序，以确定目标区域在实验室昆虫种群中的保守程度。</li>
	<li>典型的靶位点包含一个三核苷酸序列基序（NGG 或 CCN）以及紧邻 NGG 或 CCN 基序的 20 bp 序列（20 bp-NGG 或 CCN-20 bp）。将候选靶位点序列与 B. dorsalis 基因组，并确保预测的编辑效率足够高且脱靶率较低；已有多种开源软件可自动进行此类预测。在本方案中，使用 sgRNAcas9-AI27 用于筛选和评估最佳靶点。该软件的使用详情可参见其使用手册。 
	注意：优先选择靠近目标基因5'非翻译区（5' UTR）的靶位点，并且20 bp序列起始处含有1-2个鸟嘌呤（G）的序列。为了获得可通过PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测的大片段缺失，需设计两个靶向序列28 建议间隔超过 100 bp图1C).</li>
	<li>使用市售的gRNA合成试剂盒生成设计好的sgRNA。按照说明书中的步骤依次操作。用无核酸酶水重悬gRNA产物，使用紫外-可见分光光度计测定浓度，并在使用前于-80 °C保存（本实验所用试剂盒成功合成的单条gRNA [10 µL] 浓度约为4000–6000 ng/µL，甚至更高）。 
	&#8203;注意：尽管构建突变果蝇是每位研究人员的第一步，但为后续实验/分析选择适当的阴性对照至关重要。在构建突变体的同时生成这些对照可节省研究人员的时间和精力。例如，可将随机序列sgRNA设为阴性对照。</li>
</ol>
2. 胚胎的收集与制备
<ol>
	<li>放置 B. dorsalis 蛹&#160;放入塑料饲养笼中。成虫羽化后，提供糖和酵母（1:1）的混合物作为食物，并提供水源。图 2A，B饲养条件为55%相对湿度（RH）、26.5 °C，以及14:10的光/暗循环（光照开启时间为早晨6点，关闭时间为晚上8点）。</li>
	<li>大多数成虫在羽化后10天达到性成熟。应提供适宜的环境以促进成虫尽可能多地交配。理想条件下使用带有30–50 lux光照的光照架，这可提高雌蝇的产卵量，从而提升胚胎收集效率。 
	注意：将成虫（羽化后5-6天）置于光线较暗（&#60;100 lux）的环境可促进交配。通常产卵高峰发生在下午3:00（14:10/L:D，光照开启时间为上午6:00，关闭时间为晚上8:00）；为获得足够的胚胎，建议在下午3:00前30分钟将产卵室放入饲养笼中。</li>
	<li>在产卵室中放置一个200目筛网，距离室盖1-2 mm。这有助于获得尽可能多的胚胎。 
	注意：避免让胚胎浸泡在橙汁中或用纱布擦拭，因为这会显著降低胚胎的存活率。</li>
	<li>当显微注射装置准备就绪时，将一个新的产卵室放入笼中。每10分钟用湿润的细毛刷收集一次胚胎，然后将其排列在自制的注射板上（聚甲基丙烯酸甲酯材质，长55 mm，宽13.75 mm，高5 mm；中部开有一条45 mm × 5 mm × 0.3 mm的浅槽，便于卵的放置）。若胚胎内部压力较高，可进行轻微干燥处理 &#60;10% 相对湿度下处理 10 分钟为可选步骤。注射过程中将胚胎浸入卤代烃油中，以避免进一步脱水（图 2C).</li>
</ol>
3. 胚胎显微注射
<ol>
	<li>使用微量移液器拉制仪制备玻璃注射针。 
	注意：遵循用户指南设置参数非常重要。在本方案中，可依据微量移液器拉制仪说明书推荐的参数制备不同形状的针头。玻璃毛细管必须尽可能清洁，以防止灰尘堵塞针头。</li>
	<li>配制工作溶液。将Cas9蛋白与相应的sgRNA混合至以下工作浓度：&#160;sgRNA，300 ng/µL；Cas9蛋白，150 ng/µL。向混合液中加入1 µL酚红，以便于标记已注射的胚胎。将配制好的混合液置于冰上，防止sgRNA降解。 
	注意：使用无核酸酶的移液器吸头和PCR管。Cas9蛋白的浓度应小于或等于150 ng/µL；浓度过高具有毒性，会显著降低胚胎存活率。Cas9也可通过DNA或mRNA形式递送以实现成功的基因编辑17,19。本方案推荐使用Cas9蛋白，因为mRNA易降解，而质粒DNA表达Cas9蛋白需要经历转录和翻译过程，耗时较长。</li>
	<li>设置注射仪参数。初始程序设定为：Pi-500 hPa，Ti-0.5 s，PC-200 hPa。在显微注射过程中可根据需要进一步调整这些参数。</li>
	<li>将3 µL混合液加入注射针中。避免引入可能堵塞针头的气泡。使用微型研磨器打开针尖。</li>
	<li>根据用户指南将针头连接至显微操作器（图2E）。</li>
	<li>将排列好胚胎的培养皿置于显微镜载物台上。在精细光学显微镜下调整微量移液管的位置，使移液管与胚胎处于同一焦平面。通过踩踏脚踏板调节液滴体积，建议注射体积为胚胎体积的1/10。</li>
	<li>将针尖插入胚胎的后部（植物极）。通过踩下注射仪的脚踏板将混合液注入胚胎。若已添加酚红，可立即观察到轻微的红色染色。 
	&#8203;注意：针孔处少量的胞质回流不会降低胚胎存活率。注射约200个胚胎足以实现单个基因的成功诱变。添加更多卤代烃油以浸没胚胎，可防止进一步脱水。注射操作需在极细胞形成之前完成，以确保每个突变能够高效遗传。</li>
</ol>
4. 注射后昆虫的饲养
<ol>
	<li>将注射后的胚胎连同注射板一起放入人工气候箱中，保持相对湿度55%、温度26.5 °C，并设置14:10的光暗循环（早晨六点开灯，晚上八点关灯）。</li>
	<li>注射后，胚胎发育通常需要24小时完成，36小时后开始孵化。使用细头毛刷将幼虫转移至已准备好的幼虫饲料上。每日收集幼虫三到四次，直至不再有幼虫孵化。一般情况下，幼虫孵化过程持续2–3天，并在7天内化蛹。 
	&#8203;注意：本实验使用以玉米为基础的饲料喂养幼虫。饲料配方包含150 g玉米粉、150 g香蕉、0.6 g苯甲酸钠、30 g酵母、30 g蔗糖、30 g纸巾、1.2 mL盐酸和300 mL水29。应尽量减少幼虫在油中的停留时间（&#60;2 h）。尽可能在幼虫孵化后立即转移至饲料中，这可显著提高存活率和化蛹率。不要提供过多饲料（90 mm培养皿中装至约2/3体积的饲料足以供30条幼虫食用）；否则饲料易发霉，降低幼虫存活率。</li>
	<li>将成熟的幼虫放入湿润的沙土中使其化蛹。蛹期约为10天。在成虫羽化开始前，将蛹转移至塑料饲养笼中。</li>
</ol>
5. 突变体筛选
<ol>
	<li>突变体筛选的流程图如图3A所示。将显微注射获得的G0代成虫与野生型成虫杂交，以获得杂合子品系。通过基因分型验证子代（G1代）所携带的突变类型。</li>
	<li>将具有相同突变基因型的G1代个体进行自交，以在G2代中获得纯合子品系。若G1代突变体的基因型完全不同，则将杂合子与野生型果蝇杂交，通常在G3代获得纯合子品系。为后续表型分析实验，需保留两到三个纯合子品系。</li>
	<li>提取新鲜蛹壳或单个成虫中足的基因组DNA用于基因分型。设计特异性引物扩增目标区域，引物应至少位于目标位点上下游50 bp处。引物设计细节参见步骤1.2。 
	注意：由于蛹壳中的DNA含量极低，建议使用 commercially available DNA extraction kits（商业化DNA提取试剂盒）。</li>
	<li>PCR扩增程序如下：98 °C 预变性3 min，随后进行35个循环：98 °C 变性10 s，退火温度（根据所设计引物确定）退火15 s，72 °C 延伸35 s，最后72 °C 终延伸10 min。</li>
	<li>对纯化的PCR产物进行测序。若在目标位点附近检测到多个重叠峰（图3B），则表明成功发生了突变。将纯化的PCR产物亚克隆至平末端载体中，挑取10个单菌落进行测序，以确认突变体的基因型。保留发生移码突变及提前终止翻译的品系（图3C）。 
	注意：无需对G0代个体进行单克隆测序以验证其基因型，只需对PCR产物直接测序，并保留目标位点附近出现明显多重重叠峰的个体。在初次注射后，建议选取10枚胚胎提取基因组DNA，并依据步骤5.3的标准对PCR产物进行测序，以提前预测突变率。本研究中，基因型测定所用的Sanger测序由测序公司完成。</li>
</ol>

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<li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+of+Drosophila+with+the+CRISPR+RNA-guided+Cas9+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease.</a> Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).</li>
<li>Zhu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+of+juvenile+hormone+receptor%2C+Methoprene-tolerant%2C+induces+black+larval+phenotype+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).</li>
<li>Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transformer-2+and+fruitless+characterisation+with+developmental+expression+profiles+of+sex-determining+genes+in+Bactrocera+dorsalis+and+B.+correcta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li>
<li>Gabrieli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm-less+males+modulate+female+behaviour+in+Ceratitis+capitata+%28Diptera%3A+Tephritidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).</li>
</ol>

作者不存在任何利益冲突。

CRISPR/Cas9 系统是目前应用最广泛的基因编辑工具，具有多种应用，如基因治疗30、作物育种31以及基因功能的基础研究32。该系统已成功应用于多种昆虫物种的基因编辑，并已成为害虫功能基因研究的有效工具。本文所展示的实验方案标准化了引导 RNA 的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选等操作步骤。此外，还提供了一个故障排除表，用于总结各步骤中可能出现的问题并给出相应的解决方案，以减轻工作负担并提高实验效率（表 2）。该流程为靶基因的编辑提供了可靠的方法，有助于提升对橘小实蝇（B. dorsalis）的功能基因组学研究水平。
首先，靶基因的选择对于提高CRISPR/Cas9系统的效率至关重要，目前已有多种开源软件可自动设计靶点并预测潜在的脱靶率，例如ChopChop33,<sup class="xr...

东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种世界性分布的重要农业害虫，可危害超过150种水果作物，包括番石榴、芒果、蒲桃属（Eugenia spp.）、西印度樱桃、柑橘、枇杷和木瓜1。仅在中国广东省，其造成的经济损失估计超过2亿元人民币。成虫雌蝇将卵产于成熟或接近成熟的果实表皮之下，导致果实腐烂和提前脱落，从而降低果实品质和整体产量2。由于成虫具有较强的飞行能力，且幼虫钻入果皮内部取食，需要与害虫直接接触才能起效的杀虫剂在田间防治中效果较差。此外，杀虫剂的广泛使用已导致B. dorsalis对多种农用化学品产生抗药性，使得对该类害虫的防控更加困难3。因此，迫切需要开发高效且环境友好的害虫管理策略。
近年来，随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，科学家们正致力于开发环境友好的害虫管理策略，例如RNA干扰（RNAi），以靶向多种害虫重要基因（分子靶标）的功能。通过功能基因研究，可以鉴定出对害虫生存和繁殖至关重要的基因，并进一步将其作为潜在的分子靶标，用于改进具有特异性靶向性和环境友好性的害虫管理工具4。为了将这些策略应用于橘小实蝇的防治，需要有效的功能基因研究方法。
CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）核酸酶系统最初在细菌和古菌中被发现，是一种参与识别和降解外源性细胞内DNA（例如由感染性噬菌体引入的DNA）的适应性机制5。在II型CRISPR系统中，Cas9核酸酶由小型相关RNA（crRNA和tracrRNA）引导，切割入侵的DNA6,7,8，迄今已成为最广泛应用的基因编辑工具之一9,10,11,12。由于CRISPR/Cas9系统具有基因沉默效率高、成本低等优势，目前已成功应用于多种昆虫物种的基因编辑，包括埃及伊蚊（Aedes aegypti）13,14、飞蝗（Locusta migratoria）15和家蚕（Bombyx mori）16。在B. dorsalis中，已利用CRISPR/Cas9成功敲除了与体色、翅多型性和性别决定相关的基因17,18,19。然而，该昆虫中CRISPR/Cas9应用的详细操作流程仍不完善。此外，研究人员提供的B. dorsalis基因编辑步骤也存在差异，亟需标准化。例如，已发表文献中所使用的Cas9形式各不相同17,18,19。
本文提供了一种利用CRISPR/Cas9系统对B. dorsalis进行基因突变的系统性方法，包括引导RNA的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选。该实验方案可为致力于研究B. dorsalis基因功能的科研人员提供生成突变果蝇的有效指导。

<table><tbody><tr><td>6x DNA上样缓冲液</td><td>TransGen Biotech</td><td>GH101-01</td><td></td></tr><tr><td>人工气候室</td><td>上海博迅</td><td>MGC-350P</td><td></td></tr><tr><td>AxyPrep 基因组DNA小量提取试剂盒</td><td>Axygen</td><td>AP-MN-MS-GDNA-250G</td><td></td></tr><tr><td>BLAT</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于在基因组中搜索潜在基因位点</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>WPI&amp;nbsp;</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf InjectMan 4 显微操作仪</td><td>Eppendorf</td><td>InjectMan 4</td><td></td></tr><tr><td>GeneArt Precision gRNA 合成试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A29377</td><td></td></tr><tr><td>HISAT2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于将转录组数据比对到获得的基因位点</td></tr><tr><td>IGV</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于可视化Transdecoder的分析结果</td></tr><tr><td>微型研磨器</td><td>NARISHIGE</td><td>EG-401</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯显微镜</td><td>奥林巴斯公司</td><td>SZ2-ILST</td><td></td></tr><tr><td>pEASY-Blunt 克隆试剂盒</td><td>TransGen Biotech</td><td>CB101-02</td><td>https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf</td></tr><tr><td>酚红溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Pipette cookbook 2018 P-97 &amp; P-1000 微量移液器拉制仪操作手册</td><td>Instrument Company&amp;nbsp;</td><td></td><td>https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf</td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (预混液)</td><td>宝生物医学科技</td><td>R040A</td><td></td></tr><tr><td>SAMtools</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于生成排序后的bam文件</td></tr><tr><td>sgRNAcas9-AI</td><td>NA</td><td>NA</td><td>sgRNA设计&lt;br/&gt; http://123.57.239.141:8080/home</td></tr><tr><td>Sutter 微量移液器拉制仪 Sutter&amp;nbsp;</td><td>Instrument Company&amp;nbsp;</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Trans2K DNA Marker</td><td>TransGen Biotech</td><td>BM101-02</td><td></td></tr><tr><td>Transdecoder</td><td>NA</td><td>NA</td><td>用于整合转录本组装结果与基因位点信息&lt;br/&gt; https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0</td></tr><tr><td>TrueCut Cas9 蛋白 v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A36498</td><td></td></tr><tr><td>超微量生物检测仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000C</td><td></td></tr></tbody></table>

东方果实蝇 bactrocera dorsalis 的 crispr/cas9 诱变实验方案

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

东方果实蝇（Bactrocera dorsalis）是一种高度侵入性和适应性强的害虫，对柑橘类及全球超过150种其他水果作物造成严重危害。由于成虫具有较强的飞行能力，且雌虫将卵产于果实表皮之下，需要与害虫直接接触的杀虫剂在田间通常效果不佳。随着分子生物学工具和高通量测序技术的发展，许多科学家正致力于开发环境友好的害虫管理策略。这些策略包括基于RNA干扰（RNAi）或基因编辑的杀虫剂，通过下调或沉默多种害虫中与搜寻行为相关的嗅觉基因等关键基因（分子靶标）。为了将这些策略应用于东方果实蝇的防控，亟需建立有效的功能基因研究方法。在B. dorsalis的生存与繁殖中发挥关键作用的基因，是进行基因敲低和/或沉默的理想分子靶点。CRISPR/Cas9系统是一种可靠的基因编辑技术，尤其适用于昆虫研究。本文介绍了一套针对B. dorsalis的CRISPR/Cas9诱变系统化方法，包括向导RNA的设计与合成、胚胎收集、胚胎显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选。这些实验方案将为致力于B. dorsalis功能基因研究的研究人员提供有价值的参考指南。

本方案介绍了利用CRISPR/Cas9技术创制B. dorsalis突变体的详细步骤，包括基因组DNA筛选、胚胎收集与显微注射、昆虫饲养以及突变体筛选的代表性结果。
所选基因的靶位点示例位于第三外显子图1C）。该位点高度保守，通过凝胶电泳检测到合成gRNA的DNA模板仅有一条条带图1D）以及通过获取的gRNA 体外 转录（图1E).
按照第3节所述方法，对200个 freshly harvested 卵进行显微注射。胚胎的培养按照步骤4.1–4.3中描述的方案进行。通过PCR产物测序检测发现，80%的G0代个体为嵌合突变体（表1）。在此，选择在G1代中发生8 bp缺失并导致氨基酸翻译提前终止的突变体（图3C）。这将导致该基...

本文介绍了对东方果蝇Bactrocera dorsalis进行CRISPR/Cas9诱变的逐步实验方案。该标准化方案提供的详细步骤将为开展B. dorsalis基因功能研究中的突变果蝇制备提供有益的指导。

东方果实蝇 Bactrocera dorsalis 的 CRISPR/Cas9 诱变实验方案

东方果蝇（Bactrocera dorsalis）是一种入侵性强且适应能力高的害虫，可危害柑橘及150多种其他果树作物……

东方果蝇是一种入侵性极强且适应能力高的害虫物种。高效的功能基因研究方法有助于我们开发环境友好的害虫管理策略。该方法具有高效、低成本的优点。本方案将为东方果蝇研究人员提供一种有效的突变果蝇制备指南。首先，通过橘小实蝇基因组的生物信息学分析，预测目标基因的结构，并确定外显子与内含子之间的边界。使用市售的gRNA合成试剂盒来合成设计好的sgRNA。用无核酸酶水重悬gRNA产物。使用紫外-可见分光光度计测定浓度，并在使用前于-80摄氏度保存。将橘小实蝇蛹放入塑料饲养笼中，在55%相对湿度、26.5摄氏度及14:10光/暗周期的条件下进行培养。成虫羽化后，提供糖和酵母的混合物作为食物，并供给水分。大多数成虫在羽化后10天达到性成熟。使用光照强度为30至50勒克斯的光源装置，以提高雌虫的繁殖力，从而提升胚胎收集的效率。接下来，将一个200目筛网放入产卵室中，距离室盖约1至2毫米。当显微注射装置准备就绪后，将新的产卵室放入笼中。使用湿润的细毛刷每10分钟收集一次胚胎，并将其整齐排列在自制的注射板上。在注射过程中将胚胎浸入卤代烃油中，以避免进一步脱水。通过将Cas9蛋白与相应的sgRNA混合，配制工作液，使两者的浓度均为每微升300纳克。然后，向混合物中加入1微升酚红，以便于标记已注射的胚胎。将制备好的混合物置于冰上，以防止sgRNA降解。使用微量移液器拉针仪制备玻璃注射针。向注射针中加入3 µL混合物，避免引入气泡。然后，使用微型研磨器打开针头，并根据用户指南将其连接到显微操作器。将注射仪的参数设置为：Pi 500 百帕，Ti 0.5 秒，PC 200 百帕。将排列好胚胎的培养皿放置在显微镜载物台上。然后，在精细的光学显微镜下调整微量移液器的位置，使微量移液器与胚胎处于同一焦平面。将针尖插入胚胎的后部，即植物极。然后，踩下注射器的脚踏板，将混合物注入胚胎中。出现轻微的红色是由于混合物中添加了酚红。将含有已注射胚胎的注射板放入人工气候箱中。36小时后，用细头毛刷将孵化的幼虫转移至幼虫饲料中。每天收集幼虫三到四次，直至不再有幼虫孵化。随后，将成熟的幼虫放入湿沙中化蛹。化蛹阶段持续10天。化蛹后，在羽化开始前将蛹转移至塑料饲养笼中。从新鲜的蛹壳或单个成虫的中足提取基因组DNA，并设计特异性引物以扩增目标区域，随后按照文稿中描述的循环条件进行聚合酶链式反应（PCR）。然后，对纯化的PCR产物进行测序。若在靶位点附近检测到多个重叠峰，则表明突变成功。对于亚克隆，将纯化的PCR产物与平末端载体混合，并在25摄氏度下连接15分钟。然后，加入转T1细胞，置于冰上30分钟。接着加入500 µL LB培养基，于37°C振荡培养1小时。离心后弃去上清液。重悬菌体沉淀，并将其涂布于LB平板上。将平板置于37摄氏度条件下过夜培养。随后，挑取单个细菌菌落进行测序，以验证突变体的基因型。本研究中，所选基因的靶位点位于第三外显子。该靶位点高度保守，对用于合成gRNA和体外转录获得gRNA的DNA模板进行凝胶电泳检测时，均仅观察到单一条带。此处展示了微注射后橘小实蝇的存活情况及诱变结果。测序PCR产物后，80%的G0个体为嵌合突变体。在突变体筛选中，发现一个缺失8个碱基对的突变导致氨基酸翻译提前终止。将针插入胚胎的后部区域或植物极是关键步骤，因为这直接影响卵子的存活。该技术为研究橘小实蝇基因功能区域提供了参考，研究人员可通过此方法快速获得所需的突变体。

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东方果蝇背侧芽孢杆菌CRISPR/Cas9诱变实验方案

本视频介绍了一种用于鉴定基因组经CRISPR-Cas9技术修饰的转基因果蝇（Drosophila）的筛选方法。CRISPR-Cas9是一种强大的基因组编辑工具，彻底改变了科学家操控生物体基因组的方式。在本示例方案中，我们将学习如何鉴定通过CRISPR技术产生的突变体，其中一段转录激活序列的插入取代了branchless（bnl）基因的第一个外显子，从而构建出针对bnl基因的特异性驱动品系bnl-LexA。...

筛选基因组修饰：一种在Drosophila中鉴定CRISPR诱导突变体的方法

本文介绍了一种利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白和同源依赖性修复模板对秀丽隐杆线虫（C.

使用 CRISPR/Cas9 核糖核蛋白在 C. elegans 中快速简便地生成基因组点突变的流程

高效位点特异性突变的胚胎显微注射技术 致倦库蚊

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昆虫真社会性的许多特征依赖于巢群内部的交流与劳动分工。通过显微注射和CRISPR介导的突变技术对蚂蚁胚胎中的关键调控基因进行遗传操作，有助于揭示真社会性昆虫利他行为的本质。...

蚂蚁Harpegnathos saltator中通过胚胎注射实现CRISPR介导的诱变

本实验方案的目的是利用组装的核糖核蛋白复合物以及 dpy-10 共CRISPR标记进行筛选，实现对 C. elegans 基因组的无缝CRISPR/Cas9编辑。该方案可用于在 C. elegans...

使用 dpy-10 共 CRISPR 筛选标记和组装的核糖核蛋白复合物对 C. elegans rbm-3.2 基因进行 CRISPR/Cas9 编辑。

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胚胎显微注射及CRISPR/Cas9基因组编辑棉铃虫（Helicoverpa armigera）（Hübner）敲除突变体的鉴定

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普遍性与组织特异性RNA靶向 黑腹果蝇 使用 CRISPR/CasRx

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利用高分辨率熔解分析在蚊子Aedes aegypti中检测CRISPR/Cas9诱变后的插入缺失

本研究提供了一种基于CRISPR/Cas9核糖核酸酶的蝗虫纯合突变体构建的系统优化流程，以及蝗虫卵的冷冻保存与复苏的详细方法。...

利用CRISPR/Cas9技术构建飞蝗纯合突变体

学习利用CRISPR/Cas9技术在东方果蝇Bactrocera dorsalis中进行基因诱变的高效低成本实验方案。该方法可产生80%嵌合突变体，为入侵害虫的功能基因研究和环境友好型防治策略提供重要技术支持。

东方果实蝇 Bactrocera dorsalis 的 CRISPR/Cas9 诱变实验方案

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