东方果实蝇 Bactrocera dorsalis 的 CRISPR/Cas9 诱变实验方案

东方果蝇是一种入侵性极强且适应能力高的害虫物种。高效的功能基因研究方法有助于我们开发环境友好的害虫管理策略。该方法具有高效、低成本的优点。

本方案将为东方果蝇研究人员提供一种有效的突变果蝇制备指南。首先，通过橘小实蝇基因组的生物信息学分析，预测目标基因的结构，并确定外显子与内含子之间的边界。使用市售的gRNA合成试剂盒来合成设计好的sgRNA。

用无核酸酶水重悬gRNA产物。使用紫外-可见分光光度计测定浓度，并在使用前于-80摄氏度保存。将橘小实蝇蛹放入塑料饲养笼中，在55%相对湿度、26.5摄氏度及14:10光/暗周期的条件下进行培养。

成虫羽化后，提供糖和酵母的混合物作为食物，并供给水分。大多数成虫在羽化后10天达到性成熟。使用光照强度为30至50勒克斯的光源装置，以提高雌虫的繁殖力，从而提升胚胎收集的效率。

接下来，将一个200目筛网放入产卵室中，距离室盖约1至2毫米。当显微注射装置准备就绪后，将新的产卵室放入笼中。使用湿润的细毛刷每10分钟收集一次胚胎，并将其整齐排列在自制的注射板上。

在注射过程中将胚胎浸入卤代烃油中，以避免进一步脱水。通过将Cas9蛋白与相应的sgRNA混合，配制工作液，使两者的浓度均为每微升300纳克。然后，向混合物中加入1微升酚红，以便于标记已注射的胚胎。

将制备好的混合物置于冰上，以防止sgRNA降解。使用微量移液器拉针仪制备玻璃注射针。向注射针中加入3 µL混合物，避免引入气泡。

然后，使用微型研磨器打开针头，并根据用户指南将其连接到显微操作器。将注射仪的参数设置为：Pi 500 百帕，Ti 0.5 秒，PC 200 百帕。

将排列好胚胎的培养皿放置在显微镜载物台上。然后，在精细的光学显微镜下调整微量移液器的位置，使微量移液器与胚胎处于同一焦平面。将针尖插入胚胎的后部，即植物极。

然后，踩下注射器的脚踏板，将混合物注入胚胎中。出现轻微的红色是由于混合物中添加了酚红。将含有已注射胚胎的注射板放入人工气候箱中。

36小时后，用细头毛刷将孵化的幼虫转移至幼虫饲料中。每天收集幼虫三到四次，直至不再有幼虫孵化。随后，将成熟的幼虫放入湿沙中化蛹。

化蛹阶段持续10天。化蛹后，在羽化开始前将蛹转移至塑料饲养笼中。从新鲜的蛹壳或单个成虫的中足提取基因组DNA，并设计特异性引物以扩增目标区域，随后按照文稿中描述的循环条件进行聚合酶链式反应（PCR）。

然后，对纯化的PCR产物进行测序。若在靶位点附近检测到多个重叠峰，则表明突变成功。对于亚克隆，将纯化的PCR产物与平末端载体混合，并在25摄氏度下连接15分钟。

然后，加入转T1细胞，置于冰上30分钟。接着加入500 µL LB培养基，于37°C振荡培养1小时。离心后弃去上清液。

重悬菌体沉淀，并将其涂布于LB平板上。将平板置于37摄氏度条件下过夜培养。随后，挑取单个细菌菌落进行测序，以验证突变体的基因型。

本研究中，所选基因的靶位点位于第三外显子。该靶位点高度保守，对用于合成gRNA和体外转录获得gRNA的DNA模板进行凝胶电泳检测时，均仅观察到单一条带。此处展示了微注射后橘小实蝇的存活情况及诱变结果。

测序PCR产物后，80%的G0个体为嵌合突变体。在突变体筛选中，发现一个缺失8个碱基对的突变导致氨基酸翻译提前终止。将针插入胚胎的后部区域或植物极是关键步骤，因为这直接影响卵子的存活。

该技术为研究橘小实蝇基因功能区域提供了参考，研究人员可通过此方法快速获得所需的突变体。