微流控辅助选择性去极化轴突线粒体

线粒体对神经元健康至关重要。在许多神经退行性疾病中，轴突内的线粒体最先受到损害，但目前尚不清楚是什么使得轴突线粒体如此特殊。本实验方案所用腔室中的流体压力梯度可实现对线粒体轴突的选择性处理。

这可以保持细胞体及其过程不受干扰，从而让我们专注于轴突生物学的研究。本文展示了使用对膜电位敏感的染料来检测线粒体去极化的过程，但该方法也可应用于多种不同类型的神经元细胞以及各种荧光检测。首先，将编码的六孔板置于无菌操作台中，并用无菌的双蒸水清洗两次。

将培养皿倾斜放置干燥 3 至 5 分钟。通过真空抽吸或移液去除多余水分。然后将微流控腔室浸入 80% 乙醇中。

再次将微流控腔室倾斜放置，干燥三至五分钟，并用移液器吸头吸除多余的乙醇。完全干燥后，将微流控腔室置于孔板中央。轻轻敲击微流控腔室的边缘及中部的微沟道区域，以确保其与玻片表面牢固贴合。

首先，在1.5毫升反应管中收集所需数量的离解海马神经元。在室温下以1000 × g离心4分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于8微升B-27神经基础培养基中。

然后将细胞溶液加入微流控芯片的通道入口。轻敲培养板背面，以促进溶液流经通道。使用移液器吸取通道出口处残留的细胞悬液。

将含有细胞的微流控腔室在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育15至20分钟。随后，在轴突侧上层小孔中加入50 µL B-27神经基础培养基，并轻敲培养板背面以促进液体流动。在胞体侧的每个小孔中加入150 µL B-27神经基础培养基，使其表面形成张力气泡。

同时向轴突侧的两个孔中各加入 100 微升 B-27 神经基础培养基。体外培养 7 至 8 天后，确认轴突已通过微通道生长并延伸至轴突区。弃去 B-27 神经基础培养基，向轴突侧和胞体侧通道的上部孔中各加入 100 微升预热的成像培养基，洗涤装置。

让培养基流至下方小孔中。移除下方小孔中的培养基以及上方小孔中残留的任何培养基，更换新鲜培养基后重复此步骤，最终将所有小孔中的液体吸干。随后，在体细胞和轴突的上方小孔中各加入 100 微升 5 纳摩尔的 TMRE 稀释液。

让培养基流经两个区室，直至所有孔中的体积相等。用含有TMRE的培养基补足体积。在胞体区室中选择一个感兴趣的区域，并沿微沟槽追踪至轴突区室。

确保体细胞区与轴突区成像的微沟槽相互对应。更改文件名后，使用561纳米激发波长和625纳米发射波长采集红色荧光图像。通过检查体细胞侧是否存在张力气泡，确认体细胞室与轴突室之间存在体积差。

然后除去轴突侧两个小室中的成像培养基，但保留通道内的培养基。为诱导线粒体去极化，在轴突侧上方小室中加入160微升用成像培养基稀释的20微摩尔抗霉素A。让其流经通道，直至两侧轴突小室中的液体体积相等。

通过识别微沟槽，重复成像，确保成像位置与基线采集时相同。采用本方案，将原代海马神经元培养于微流控装置中，随后使用对膜敏感的染料TMRE对线粒体进行染色。在微沟槽两侧均观察到线粒体均匀染色，而中间区域则无染色。

在轴突侧加入抗霉素A后，胞体线粒体仍保留TMRE信号，而轴突线粒体的荧光则消失。在组装装置前，务必确保小室或装置中无任何残留水分，否则会导致腔室无法密封。利用该方法，我们可以研究轴突内线粒体功能丧失及其局部功能的影响，以及其对逆行信号传导和细胞整体存活的影响。

线粒体生物合成长期以来被认为仅发生在细胞体中。该方法使我们能够揭示轴突线粒体损伤需要PINK1蛋白短型的局部翻译。