微流体辅助轴突线粒体选择性去极化
August 4th, 2022
本协议描述了微流体室中神经元线粒体的播种和染色。这些腔室中的流体压力梯度允许选择性处理轴突中的线粒体，以分析其性质以应对药理学挑战而不影响细胞体区室。
线粒体对神经元健康至关重要。在许多神经退行性疾病中，轴突线粒体是第一个遭受痛苦的疾病，但尚不清楚是什么让轴突线粒体如此特别。本协议中使用的腔室中的流体压力梯度允许对线粒体轴突进行选择性处理。
这使得细胞体过程不受干扰，并使我们能够专注于轴突生物学。我们在这里展示了线粒体用膜电位敏感染料的去极化，但这种方法可以应用于许多不同的神经元细胞类型和荧光读数。首先，将编码的六个孔板放入无菌罩中，并用无菌双蒸水洗涤两次。
让板在倾斜位置干燥三到五分钟。通过真空抽吸或移液去除多余的水分。然后将微流体室浸泡在80%乙醇中。
再次，在倾斜位置干燥微流体室三到五分钟，然后用移液器吸头除去多余的乙醇。完全干燥后，将微流体室放在孔和板的中心。轻轻敲击微流体室的边界和中间的微槽部分，以正确连接到玻璃板上。
首先，在1.5毫升反应管中收集所需数量的解离海马神经元。在室温下以1000倍G离心管四分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于八微升B-27神经基础培养基中。
然后将细胞溶液分配到微流体室的通道入口中。点击板的背面以协助流过通道。使用移液器在通道出口处吸出任何剩余的细胞悬液。
将微流体室与细胞在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育15至20分钟。接下来，用50微升B-27神经基础培养基填充顶部轴突孔，并点击板的背面以辅助流动。用 150 微升 B-27 神经基础培养基填充体侧的每个孔，在顶部形成一个张力气泡。
还要用100微升的B-27神经基础培养基填充轴突侧的两个孔。体外培养七到八天后，确保轴突已通过微凹槽生长，并延伸到轴突隔室。通过去除 B-27 神经基础培养基并加入 100 微升预热的成像培养基到轴突和体细胞通道的顶部孔中来清洗装置。
让培养基流向较低的孔。从下孔中取出培养基，从顶部孔中取出任何剩余的培养基，然后用新鲜培养基重复，在洗涤结束时使孔空。然后将100微升的5纳摩尔TMRE稀释液加入体细胞和轴突顶孔中。
让培养基流过两个隔室，直到所有孔中的体积相等。用含有TMRE的培养基填充。在体细胞隔室中选择一个感兴趣的区域，并跟随它穿过微凹槽进入轴突隔室。
确保在体细胞和轴突隔室中成像的微凹槽彼此匹配。更改文件名后，使用561纳米激发和625纳米发射波长获取红色荧光图像。通过检查体细胞侧是否存在张力气泡来确保体细胞和轴突腔之间的体积差异。
然后从轴突侧的两个孔中取出成像介质，通道内的培养基除外。为了诱导线粒体去极化，将160微升在成像培养基中稀释的20微摩尔抗霉素A添加到顶部轴突孔中。让它流过通道，直到两个轴突孔中的体积相等。
重复成像，通过识别微凹槽，确保成像的位置与基线采集期间相同。使用该协议，原代海马神经元在微流体装置中生长，然后用膜敏感染料TMRE进行线粒体染色。在微槽的两侧观察到线粒体的均匀染色，但在中间没有。
在轴突侧加入抗霉素A后，体细胞线粒体保留TMRE信号，而轴突线粒体的荧光丢失 在组装设备之前，请确保孔中或设备上没有水分。否则，腔室将不会密封。使用这种方法，我们可以研究轴突线粒体功能丧失和局部功能的影响，以及它对逆行信号传导和全局细胞存活的影响。
长期以来，人们一直认为线粒体生物发生只发生在细胞体内。这种方法使我们能够揭示轴突线粒体损伤需要对短蛋白PINK1进行局部翻译。
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概述
本协议概述了微流控室中神经元线粒体的种植和染色，使研究轴突线粒体特性而不干扰细胞体成为可能。该方法利用流体压力梯度进行选择性处理，并允许药理分析，有助于理解神经元中线粒体的功能。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 线粒体动力学
背景
- 线粒体对神经元健康至关重要。
- 轴突线粒体在神经退行性疾病中特别脆弱。
- 本协议旨在探索轴突线粒体的特殊特性。
- 微流控平台增强了处理和观察的特异性。
研究目的
- 选择性研究轴突中的线粒体动力学。
- 分析抗菌素A等药理剂对线粒体功能的影响。
- 研究线粒体的局部功能及其对神经元健康的影响。
使用的方法
- 使用微流控室进行原代海马神经元的生长和观察。
- 将离散神经元在受控环境中培养，使轴突延伸到轴突隔室中。
- 使用TMRE（膜电位敏感染料）进行线粒体染色。
- 药理实验包括用抗菌素A处理，以评估线粒体去极化。
主要结果
- 荧光成像显示，体细胞线粒体在处理后保留了TMRE信号，而轴突线粒体失去了信号。
- 该方法证明线粒体损伤需要局部翻译，突出了对神经元功能的重要见解。
结论
- 本研究使我们更清楚地理解轴突中线粒体的作用与细胞体中的作用之间的差异。
- 结果表明对神经退行性疾病机制和神经元信号传导途径有重要启示。
常见问题
Executive Industry Relevance
Selective depolarization of axonal mitochondria using microfluidic platforms enables precise modeling of early neurodegenerative mechanisms in vitro. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating axonal mitochondrial dysfunction, a key inflection point in neuronal disease progression. The method enhances portfolio decision-making by providing actionable insights into compartment-specific mitochondrial responses to pharmacological challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of axonal mitochondrial vulnerability distinct from somatic compartments.
- Supports mechanistic de-risking by isolating local mitochondrial dysfunction in disease-relevant systems.
- Facilitates functional target validation for mitochondrial pathways implicated in neurodegeneration.
Screening & Assay Development
- Prepares validated neuronal microenvironments for compound screening targeting axonal mitochondria.
- Standardizes quantitative readouts using membrane potential-sensitive dyes for reproducibility.
- Enables scalable, compartment-specific assays for high-content imaging and pharmacological profiling.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro axonal dysfunction models with translational biomarker strategies for neurodegenerative diseases.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by modeling early axonal pathology.
- Provides predictive de-risking for therapeutic candidates targeting mitochondrial health.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidics-assisted protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling selective manipulation and analysis of axonal mitochondria.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on axonal mitochondrial roles in neuronal survival and retrograde signaling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative fluorescence-based outputs for compound evaluation.
- Analytics: Provides compartment-specific measurements of mitochondrial membrane potential for comparative analysis.
- Translational Research: Models early axonal dysfunction relevant to neurodegenerative biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple neuronal subtypes and pharmacological perturbations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of neuronal assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying compartment-specific drug effects.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neurodegenerative disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuronal culture and microfluidic device handling.
- Demands access to fluorescence microscopy and quantitative imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible compartmentalization.
- Adaptable to various neuronal subtypes and fluorescent readouts as supported by the protocol.
- Dependent on precise fluidic control to maintain selective treatment and prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Assembly of the Microfluidic Device
1:46
Seeding and Maintaining of Neurons
3:13
Staining with Mitochondrial Membrane Potential Sensitive Dye
4:14
Live‐Cell Imaging
5:33
Results: Mitochondrial Staining in Primary Hippocampal Neurons
6:10
Conclusion
