Name: 使用双光子全息显微镜评估和操纵神经活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: 了解双光子全息显微镜技术，用于高时空分辨率评估和操控神经活动，揭示神经精神疾病的发病机制。该方法结合光遗传刺激与钙成像，为研究神经元功能连接提供关键工具。

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本研究得到了以下资助：创新领域研究资助项目（19H04753、19H05219 和 25110732，授予 H. W.），变革性研究领域资助项目（A 类）（20H05899，授予 H. W.；20H05886，授予 O. M.；21H05587，授予 D. K.），促进国际联合研究资助项目（B 类）（20KK0170，授予 H. W.），科学研究资助项目（B 类）（18H02598，授予 H. W.），科学研究资助项目（A 类）（21H04663，授予 O. M.），早期职业科学家资助项目（20K15193，授予 X. Q.），日本科学技术振兴机构（JST）CREST 项目编号 JPMJCR1755，以及日本科学技术振兴机构（JST）A-STEP 项目编号 JPMJTR204C。

所有实验方案均经名古屋大学医学院研究生院动物护理与使用委员会批准（批准编号：M220295-003）。
1. 头部固定板植入（图1A）
<ol>
	<li>腹腔注射麻醉剂（74 mg/kg 氯胺酮和 10 mg/kg 赛拉嗪的混合物）以麻醉小鼠。通过频繁检测足底反射来评估小鼠的麻醉状态。</li>
	<li>麻醉后，将小鼠固定于立体定位仪中。涂抹眼膏（见材料表），以防止在植入头板时角膜干燥。</li>
	<li>剃除手术区域的毛发，并使用聚维酮碘或氯己定溶液与 70% 酒精棉片交替擦拭三遍，对皮肤进行消毒&#160;。小心暴露颅骨，并用棉签清洁。 
	注意：所有手术器械均应灭菌，所有操作均应遵循无菌原则。任何残留物（如毛发或干涸的血液）都可能引发炎症反应。因此，应在体视显微镜下使用无菌水或 70% 酒精润湿的棉签清除所有残留物。</li>
	<li>利用立体定位坐标（前后方向 = bregma 前 0.5 mm，内外侧方向 = bregma 两侧 1.5 mm）确定开颅中心位置，并用记号笔标记。</li>
	<li>将定制的头板置于颅骨中央。随后，涂抹牙科水泥（见材料表）将其牢固固定在颅骨上。轻压头板，直至其与颅骨前后部紧密贴合。 
	注意：此步骤约需 20 分钟完成，对于减少双光子成像过程中脑组织的运动伪影至关重要。头板尺寸为 20 mm × 40 mm × 1 mm，中央开孔呈家形，其中一边长 15 mm，两个相邻边各长 3 mm，另两边各长 10 mm。</li>
	<li>按以下比例混合丙烯酸类牙科粘接树脂水泥：半勺粉末、三滴液体和一滴催化剂（见材料表）。为防止干燥，将混合好的牙科粘接树脂水泥涂抹于带有头板的小鼠完整颅骨表面。</li>
	<li>将小鼠置于保温笼中，直至其从麻醉中恢复。在小鼠恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护。</li>
</ol>
2. 手术与腺相关病毒（AAV）注射（图1B）
<ol>
	<li>在植入头固定板1天后，不移除颅骨上的牙科粘接树脂胶进行开颅或病毒注射。 
	注意：在此操作过程中，通过腹腔注射给予小鼠麻醉剂（74 mg/kg 氯胺酮和10 mg/kg 赛拉嗪的混合物）&#160;。</li>
	<li>为避免脑水肿，在手术前1小时通过腹腔注射给予地塞米松磷酸钠（1.32 mg/kg）。</li>
	<li>使用异氟烷蒸发器（麻醉输送系统）以1%异氟烷对安装头固定板的小鼠进行麻醉，同时使用加热垫维持体温。涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>在体视显微镜下，使用牙科钻进行直径约2 mm的环形开颅。为减少脑组织损伤，操作牙科钻时应小心谨慎，保持轻微持续移动并施加轻柔向下的压力。</li>
	<li>多次使用吸引系统清除骨碎片。清除骨碎片后，使用人工脑脊液（ACSF）溶液冲洗并去除脑表面残留的碎屑。重复此清洗步骤数次，以抑制炎症反应。 
	注意：ACSF溶液（140 mM NaCl、2.5 mM KCl、5 mM HEPES、2.0 mM CaCl2 和 1.0 mM MgCl2）在试剂溶解并过滤（孔径 = 0.22 µm）后于4 °C保存1个月。</li>
	<li>使用压力注射系统（见材料表），设定适当压力（约10 PSI，脉冲持续时间为4 ms），通过尖端直径为10–20 µm的玻璃毛细管（使用微电极拉制仪制备）在10分钟内注射500 nL AAV溶液。</li>
	<li>通过观察玻璃毛细管中AAV溶液液面是否逐渐下降，判断AAV溶液是否正在注入脑内。</li>
	<li>将玻璃毛细管留置原位额外10分钟，以防止回流。重复该过程三次，共向脑内注射1.5 µL AAV溶液。</li>
	<li>为评估和操控第2/3层（L2/3）锥体细胞的神经活动，将AAV溶液（用于Ca2+成像：AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE，滴度为1.28 × 1014 载体基因组/mL，用生理盐水1:1稀释；用于结合光遗传学的Ca2+成像：AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE，滴度为1.73 × 1014 载体基因组/mL，用生理盐水1:1稀释）注射至野生型小鼠初级躯体感觉皮层的后爪区域（S1，以bregma后0.5 mm、外侧1.5 mm为中心，深度为脑表面下150 µm）。 
	注意：jGCaMP8f和GCaMP6m-P2A-ChRmine的表达分别应在成像前2–3周和1–2周进行AAV溶液注射。</li>
	<li>使用移液器将2%（w/v）低熔点琼脂糖滴加至S1脑表面后，将玻璃窗覆盖于开颅区域，玻璃窗由两片盖玻片组成。使用紫外光固化胶将两片盖玻片（小片直径2.0 mm，大片直径4.5 mm；见材料表）粘合固定。</li>
	<li>在琼脂糖仍处于液态时将其压紧至盖玻片，以防止琼脂糖中形成气泡。使用牙科粘接树脂胶密封颅窗边缘（图1C）。</li>
	<li>将小鼠从立体定位仪中取出并放回笼中。将其置于保温笼中，并在其完全从麻醉中恢复之前不得与其他动物合笼。在存活手术期间严格维持无菌条件。</li>
	<li>术后前72小时内，通过观察一般行为来检查小鼠的健康状况。若发现行为异常，应皮下注射抗炎和镇痛药物。</li>
</ol>
3. 全息刺激或照明系统的准备（图3）
<ol>
	<li>通过将红色荧光载玻片（亚克力基底）的表面置于样品平面来校准全息刺激系统。将显微镜置于实时成像模式并使用弱激发光，运行 calibration_GUI.m 文件。检查&#160;参数面板，然后点击 保存 按钮。</li>
	<li>点击步骤1面板中的 Z 扫描 按钮。系统将自动生成三个随机光斑，分布于全部21个轴向平面，各平面之间相距 2 µm。</li>
	<li>移动滑动条并观察实时图像。找到一个光斑最小且最亮的最佳焦平面，然后点击 保存 按钮。这将自动为数字全息图生成一个偏移的球面波前。 
	注意：如果未能找到最亮的荧光光斑，请调整扫描范围的最小值和最大值后重试。</li>
	<li>点击步骤2面板中的 前往 按钮，然后在左侧方框中点击六个光斑。检查实时图像。如果出现六个可区分的荧光光斑，则将其 x 和 y 坐标输入到编辑框中，并点击 保存 按钮。这将自动生成仿射变换系数，以实现全息刺激系统与成像系统之间的坐标校准。 
	注意：坐标对的顺序必须与点击光斑的顺序一致。若不确定，或图像中未出现光斑，请重试并生成独特的光斑图案，或选择围绕视场中心（FOV）更小的范围。</li>
	<li>点击步骤3面板中的 扫描 按钮。系统将生成 441 个数字全息图，以在 21 × 21 步骤内完成在整个视场（FOV）&#160;上的单光斑扫描。
	<ol>
		<li>首先，在列表框中切换图案并观察图像变化。然后，调节激光功率，使光斑图像处于成像设备的动态范围之内（例如，避免图像过度饱和）。</li>
		<li>随后，在编辑框中调节时间间隔；该时间间隔应大于记录时间间隔的两倍。最后，将成像设备设为记录模式并点击 播放 按钮。若播放完成，命令窗口中将显示 &#34;display OK&#34; 字符串。停止记录，并使用最大强度法叠加所记录的序列图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在步骤4面板中点击 生成 WM，并从上述结果中选择一幅叠加图像。然后关闭 calibration_GUI 窗口。系统将自动生成一个权重图，用于补偿各个光斑间不均匀的强度。 
	注意：更详细的描述请参见 2；Matlab 代码可从此处下载（https://github.com/ZenKG/SLM_control）。</li>
</ol>
4. 使用全息照明图像传感器进行 Ca2+ 成像（图4）
<ol>
	<li>将带有头板的AAV注射小鼠置于显微镜下图1D). 
	注意：在该操作过程中，小鼠处于清醒状态并被固定，但能够逃避不适的刺激。</li>
	<li>使用全息显微镜和锁模钛宝石激光器（调谐至920 nm）在点扫描模式下进行双光子成像，配备25倍物镜（参见 材料表).</li>
	<li>打开商用成像软件（参见 材料表）。在活体成像模式下，调节图像检测器的电压（参见 材料表）并调整成像激光的功率，以优化表达 jGCaMP8f 的神经元的亮度。采集表达该蛋白的神经元的图像。 
	注意：成像激光（920 nm）的强度为20–30 mW。视野（FOV）在皮层表面下100–150 µm深度处为512 µm × 512 µm。</li>
	<li>为了通过全息照明激发表达 jGCaMP8f 的特定神经元，请运行 SLMcontrol.m 脚本文件。点击 参考图像 并选择上述获取的图像，然后点击 斑点 按钮，通过连续点击鼠标选择图像中神经元的特定像素（图 4A）。如果选择完成，按下 输入 键盘上的按钮以确认。 
	注意：数字全息图将自动计算并显示在空间光调制器（SLM）上。也可通过点击列表框重新调用该图案。SLM生成的单个光斑的空间分辨率为横向约1.2 µm，轴向约8.3 µm。我们采用高数值孔径（1.1）的物镜，以实现更局域化的全息刺激。 表1 总结了以往研究报道及本系统在全息刺激空间分辨率方面的进展。</li>
	<li>使用图像传感器以高时间分辨率检测神经活动（参见 材料表），设置曝光时间、成像区域和像素合并（binning）图 4B）在进行图像采集之前图4C). 
	注意：用于全息照明的激光（920 nm）持续刺激单个神经元的强度为 2 mW，足以检测神经活动。例如，当成像帧率为 100 Hz 时，曝光时间为 9 ms，成像区域为 400 µm × 400 µm，像素合并（binning）设置为 4。</li>
	<li>实验结束后，将小鼠放回其原居住笼具中。</li>
</ol>
5. 使用全息显微镜进行双光子成像（点扫描模式）结合光遗传学（图2）
<ol>
	<li>重复步骤 4.1 和 4.2。</li>
	<li>打开商用成像软件（参见 材料表）。在活体成像模式下，调节图像检测器的电压（参见 材料表）并调整成像激光的功率，以优化表达GCaMP6m-P2A-ChRmine的神经元的亮度。采集表达这些蛋白的神经元的图像（图1E).</li>
	<li>重复步骤 4.4。</li>
	<li>为了研究L2/3神经元内的功能连接，使用SLM生成光遗传刺激（ChRmine；1,040 nm）的全息模式，并将其与双光子Ca2+ 成像（GCaMP6m；920 nm，512 × 512 像素，2 Hz 或 30 Hz，2 倍数字放大，点扫描模式； 图 4D- H).
	<ol>
		<li>对于本方案，将成像激光的强度设定为920 nm，功率为10–20 mW，视野（FOV）设定为256 µm × 256 µm，测量深度为距皮层表面100–150 µm处。像素驻留时间设定为1.5 µs（2 Hz时）或100 ns（30 Hz时）。</li>
		<li>为了观察单个全息刺激是否在神经元中引发钙反应，采用 2 Hz 和 30 Hz 作为成像帧率。将用于刺激单个神经元的全息刺激激光（1,040 nm）强度设置为 10 mW，该强度足以诱导神经元活动。图 4D). 
		注意：空间光调制器（SLM）产生的单个光斑的空间分辨率在横向方向上约为1.2 µm，在光轴方向上约为8.3 µm。横向可寻址范围约为500 µm × 500 µm，轴向为100 µm。我们进一步通过Ca2+ 以2 Hz或30 Hz的成像帧率进行成像，不仅可对单个神经元，还可同时全息刺激多个神经元（图4E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下方案进行图像采集：同时对 Ca2+ 响应于&#160;920 nm 激光刺激，随后在10秒基线期后，以1,040 nm进行10次全息刺激，每次持续50毫秒，刺激间隔为8秒（0.125 Hz）。所有实验完成后，处死小鼠。 
	注意：Ca2+ 瞬变信号（如果存在）由全息刺激诱发，其峰值出现在刺激后1秒内图4F- H).</li>
</ol>
6. 图像分析与功能连接性评估（图4）
<ol>
	<li>使用 ImageJ 打开在步骤 4.5 或 5.5 中保存的原始图像。为校正焦平面位移，使用 ImageJ 插件 TurboReg。 
	注意：如果使用 TurboReg 进行校正效果不充分，建议使用 CaImAn（http://github.com/simonsfoundation）来校正焦平面位移。</li>
	<li>为评估神经元活动，使用自动化算法（CaImAn）在L2/3层确定感兴趣区域（ROIs），检测并分析Ca2+ 在定义基线荧光强度后出现的瞬时信号（F0）和阈值。 
	注意： F0 是35th 基线成像期间获得的荧光强度的百分位数值。Ca2+ 瞬态用 Δ 表示F/F0 (ΔF = F-F0），其中 F 为瞬时荧光信号。如果 ΔF 值超过2个标准差 F0，我们评估了一个显著的 Ca2+ 瞬时的</li>
	<li>为了定义L2/3神经元中的功能连接性，需刺激目标神经元，并相应地测量被刺激神经元及周围神经元中的GCaMP6m反应。图4F-H).</li>
</ol>

<ol><li>Masamizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+distinct+layer-specific+dynamics+of+cortical+ensembles+during+learning+of+a+motor+task%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two distinct layer-specific dynamics of cortical ensembles during learning of a motor task.</a> Nature Neuroscience. 17 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+reproducible+spatiotemporal+activity+during+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning.</a> Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).</li>
<li>Kato, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+learning+requires+myelination+to+reduce+asynchrony+and+spontaneity+in+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Motor learning requires myelination to reduce asynchrony and spontaneity in neural activity.</a> Glia. 68 (1), 193-210 (2020).</li>
<li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+impairs+neural+circuits%2C+dominating+amyloid-%CE%B2+effects%2C+in+Alzheimer+models+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tau impairs neural circuits, dominating amyloid-β effects, in Alzheimer models in vivo.</a> Nature Neuroscience. 22 (1), 57-64 (2019).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Quan, X., Kato, D., Daria, V., Matoba, O., Wake, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+microscope+and+its+biological+application%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Holographic microscope and its biological application.</a> Neuroscience Research. 179, 57-64 (2022).</li>
<li>Adesnik, H., Abdeladim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+neural+codes+with+two-photon+holographic+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Probing neural codes with two-photon holographic optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 24 (10), 1356-1366 (2021).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Carrillo-Reid, L., Han, S., Yang, W., Akrouh, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+visually+guided+behavior+by+holographic+recalling+of+cortical+ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles.</a> Cell. 178 (2), 447-457 (2019).</li>
<li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li>
<li>Gill, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+holographic+manipulation+of+olfactory+circuits+reveals+coding+features+determining+perceptual+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precise holographic manipulation of olfactory circuits reveals coding features determining perceptual detection.</a> Neuron. 108 (2), 382-393 (2020).</li>
<li>Robinson, N. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+activation+of+hippocampal+place+cells+drives+memory-guided+spatial+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted activation of hippocampal place cells drives memory-guided spatial behavior.</a> Cell. 183 (6), 1586-1599 (2020).</li>
<li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Häusser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li>
<li>Mardinly, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+multimodal+optical+control+of+neural+ensemble+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Precise multimodal optical control of neural ensemble activity.</a> Nature Neuroscience. 21 (6), 881-893 (2018).</li>
<li>Yang, W., Carrillo-Reid, L., Bando, Y., Peterka, D. S., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+two-photon+imaging+and+two-photon+optogenetics+of+cortical+circuits+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions.</a> Elife. 7, 32671(2018).</li>
<li>Forli, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+bidirectional+control+and+imaging+of+neuronal+excitability+with+high+spatial+resolution+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Two-photon bidirectional control and imaging of neuronal excitability with high spatial resolution in vivo.</a> Cell Reports. 22 (11), 3087-3098 (2018).</li>
<li>Pégard, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+scanless+holographic+optogenetics+with+temporal+focusing+%283D-SHOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional scanless holographic optogenetics with temporal focusing (3D-SHOT).</a> Nature Communications. 8 (1), 1228(2017).</li>
<li>Dal Maschio, M., Donovan, J. C., Helmbrecht, T. O., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+neurons+to+network+function+and+behavior+by+two-photon+holographic+optogenetics+and+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Linking neurons to network function and behavior by two-photon holographic optogenetics and volumetric imaging.</a> Neuron. 94 (4), 774-789 (2017).</li>
<li>Russell, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+interrogation+of+neural+circuits+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">All-optical interrogation of neural circuits in behaving mice.</a> Nature Protocols. 17 (7), 1579-1620 (2022).</li>
<li>Oron, D., Papagiakoumou, E., Anselmi, F., Emiliani, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetics.</a> Progress in Brain Research. 196, 119-143 (2012).</li>
<li>Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+spatiotemporal+focusing+of+holographic+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional spatiotemporal focusing of holographic patterns.</a> Nature Communications. 7, 11928(2016).</li>
<li>Okada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pain+induces+stable%2C+active+microcircuits+in+the+somatosensory+cortex+that+provide+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Pain induces stable, active microcircuits in the somatosensory cortex that provide a therapeutic target.</a> Science Advances. 7 (12), 8261(2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li>
<li>Gonçalves, J. T., Anstey, J. E., Golshani, P., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+level+defects+in+the+developing+neocortex+of+Fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).</li>
<li>Akiyoshi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+enhance+synapse+activity+to+promote+local+network+synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Microglia enhance synapse activity to promote local network synchronization.</a> eNeuro. 5 (5), (2018).</li>
<li>Haruwaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+microglia+effects+on+blood+brain+barrier+permeability+induced+by+systemic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dual microglia effects on blood brain barrier permeability induced by systemic inflammation.</a> Nature Communications. 10 (1), 5816(2019).</li>
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<li>Villette, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ultrafast+two-photon+imaging+of+a+high-gain+voltage+indicator+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ultrafast two-photon imaging of a high-gain voltage indicator in awake behaving mice.</a> Cell. 179 (7), 1590-1608 (2019).</li>
</ol>

作者声明无任何利益冲突。

为了理解大脑功能，有必要通过提取神经活动的动态特征，准确评估大脑功能背后的神经环路。此外，要阐明神经精神疾病的发生机制，关键在于明确这些神经环路是如何发生改变的。事实上，已知在阿尔茨海默病的小鼠模型4、脆性X综合征小鼠模型26以及白质功能受损的小鼠3中，神经活动水平升高。此外，在炎症性疼痛的小鼠模型中，神经元活动的同步性增强以及神经元之间的功能连接增强与相关症状有关24。双光子全息显微技术使我们能够同时观察单个神经元的活动以及神经元之间的功能连接，这对于理解神经环路至关重要。我们使用了数值孔径为1.1、放大倍数为25倍的物镜，激发波长为1,040 nm。理论上的点扩散函数为高斯分布，横向半高全宽为0.5 µm，轴向为1.7 µm。然而，实际的数值孔径小于1.1，在荧光微珠上测得的光斑尺寸横向为1.2 µm，轴向为8.3 µm。考虑到神经元直径约为15 µm，且校准误差在3 µm以内，因此定位精度总体良好。但轴向上的细胞可能受到较长光斑尺寸的影响6。本文描述了利用我们的显微成像系统，在活体小鼠中评估和操控神经活动所涉及的病毒注射、手术操作、全息刺激或照明系统的校准，以及成像实验方案。
从头颅固定板植入、病毒注射到数据采集，完成所有实验操作需要2-4周。 在体 Ca2+ 使用全息显微镜进行成像。该过程复杂且耗时，实验的最终成功取决于多种因素，包括颅窗的状态（受术后炎症影响）以及Ca2+ 指示剂和视蛋白，以及所获取图像中的运动伪影是否可被校正。具体而言，两个步骤对成功结果至关重要。第一步涉及头板固定和手术操作；关键在于使用牙科水泥将头板牢固地固定在小鼠头部。此外，在手术过程中使用冷人工脑脊液（ACSF）反复清除骨碎片和凝结血液也非常重要。遵循该操作步骤可减少炎症反应，从而使我们能够成功观察小胶质细胞的动态变化——这些细胞负责大脑的免疫功能，且在此过程中未激活其突起或神经元的微结构。27,28第二个问题是神经活动的评估与操控。我们选用 AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1 来表达 Ca2+ 在同一神经元中同时表达指示剂和视蛋白。这是因为使用不同类型的腺相关病毒（AAV）高效感染同一个神经元存在困难。另一个选择该策略的原因是，ChRmine 能够利用双光子激光在 1,040 nm 波长下高效激活神经元活动。12最近有报道称，基于冷冻电镜获得的结构信息，通过对ChRmine的结构进行突变，可改善其功能29，这在神经科学领域的靶向功能分析中被认为具有重要价值。鉴于上述问题，有必要共享有效的方法，以在使用全息显微镜读取神经活动和写入信息时对神经元进行评估与操控。
成像技术和光遗传学的最新进展揭示了学习和记忆等脑功能所涉及的详细神经活动，且已有可能通过人工手段操控这些神经活动以实现特定的脑功能30。然而，传统的神经活动操控方法具有高度侵入性，因其需要将光纤插入脑内，且会同时刺激一群表达视蛋白的细胞，导致无法实现对神经活动在时间和空间上的精确操控。我们的方法仅通过刺激脑内特定神经元，即可实现对神经活动的操控，从而能够以特定的刺激模式和高时空分辨率进行干预。此外，值得注意的是，利用脑切片实验仅能评估少量神经元之间的功能连接性31；而本技术则可在活体动物中同时评估多个神经元的功能连接。
目前全息显微镜的主要局限之一是需要固定小鼠头部，从而限制了小鼠的行为。最近，一种微型化双光子显微镜被开发出来32，并随着设备的进一步小型化， 体内 Ca2+ 在自由活动的小鼠中，全息刺激成像或可实现。此外，通过提高成像的时间分辨率，并将其与高灵敏度的电压敏感型荧光蛋白相结合，该显微镜的潜力有望进一步拓展33.

双光子Ca2+成像是一种用于评估神经活动的有效技术。该技术不仅可用于识别正常动物行为和记忆所必需的神经活动1,2，还可用于检测神经精神障碍小鼠模型中出现的异常神经元活动3,4。该技术已被用于阐明脑功能的神经基础。然而，尽管其能够提供高分辨率和高质量的图像，其时间分辨率仍低于电生理学方法1,3。
光遗传学技术已帮助神经科学家革新了对大脑功能的理解5。由于技术上的限制，大多数光遗传学研究采用的是空间分辨率较低的激活方案，从而相应地限制了可实施的神经活动操控类型。然而，在更精细的时空尺度上操控神经活动，可能有助于更全面地理解神经计算机制以及神经精神疾病的发生机制。一种具有空间精确性的全息技术能够调控飞秒近红外激光束的形态，有望克服这一挑战，并开辟出若干类此前无法实现的新型实验6,7。该技术使神经科学家能够揭示以往难以触及的感觉、认知和行为神经编码的基本特征及其病理机制。
全息投影技术通过生成特定的光模式，实现对单个细胞和功能网络的选择性访问。体内实验需要将光信号高效传递至活体大脑中的靶细胞。红外光在生物组织中的穿透深度更大，可用于非线性的双光子激发（2PE）8,9,10。因此，结合了全息投影与双光子激发的双光子全息显微技术，可用于在体内评估和操控神经活动，以研究细胞及功能网络。近年来，双光子全息显微技术在生物学中的应用已揭示了视觉皮层11,12、嗅球13和海马体14中学习过程所必需的神经活动与环路机制。
全球众多实验室已报道了使用全息刺激系统所取得的令人振奋的结果与改进15,16,17,18,19,20,21,22,23。本文所述系统中，全息刺激系统可构建为传统显微镜的附加装置。仅调制相位的空间光调制器（SLM）是将平面波前调制成任意形状的关键器件，利用干涉效应可控制焦点的强度与位置。图2展示了全息刺激与成像的光路。第一条光路用于点扫描成像模式，由扫描头和图像探测器组成。&#160;第二条光路用于波长为1040 nm的全息刺激，包含一个SLM1。第三条光路用于波长为920 nm的全息照明，包含一个SLM2和一个图像传感器。全息成像模式可通过在样品中同时照明多个点，记录来自多个感兴趣区域的强度信号，从而将记录速度提高至每秒数百帧。为实现点扫描成像或全息照明成像，920 nm激光通过分束器以固定的3:7比例分为两束光路。所有光学元件均安装在尺寸为600 mm × 600 mm的光学面包板上。调制后的光通过显微镜主体侧面的光输入端口进入，而点扫描成像光则通过显微镜主体顶部的扫描头进入。这些光束在物镜正上方合并，并在样品平面上形成焦点。此外，定制软件使常规工作流程变得简单且一致。
本文介绍了一种利用全息刺激或照明技术测量神经元活动并评估神经元之间功能连接的完整实验方案。为便于演示，本文描述了针对小鼠大脑初级躯体感觉皮层后肢区（S1HL）的脑部手术操作，以及利用双光子全息显微镜评估和操控神经元活动的方法。实验流程分为四个部分：首先，使用牙科水泥将头固定板固定于小鼠颅骨上；其次，通过立体定位注射将表达jGCaMP8f或GCaMP6m-P2A-ChRmine的病毒载体注入S1HL区域；第三，进行全息刺激或照明&#160;系统经过校准。第四，在术后恢复并表达这两种蛋白质后， 体内 Ca2+ 采用双光子全息显微镜成像技术评估神经元之间的神经活动及功能连接。

<table><tbody><tr><td>25倍物镜</td><td>Nikon</td><td>N25X-APO-MP</td><td>物镜</td></tr><tr><td>A1MP</td><td>Nikon</td><td>A1MP</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>AnesII</td><td>Bio machinery</td><td>AnesII</td><td>麻醉输送系统</td></tr><tr><td>C2 plus</td><td>Nikon</td><td>C2 plus</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>DECADRON&amp;nbsp;Phosphate&amp;nbsp;Injection</td><td>Aspen</td><td>21N024</td><td>预防脑水肿</td></tr><tr><td>牙科钻头</td><td>Jota</td><td>C1.HP.005</td><td>牙科钻</td></tr><tr><td>电动微量注射器</td><td>NARISHIGE</td><td>IM-31</td><td>压力注射系统</td></tr><tr><td>FEATHERS</td><td>FEARGER</td><td>FA-10</td><td>剃毛</td></tr><tr><td>G-CEM ONE ADHESIVE ENHANCING PRIMER</td><td>GC</td><td>2110271</td><td>牙科粘接用树脂水泥底涂剂</td></tr><tr><td>G-CEM ONE neo</td><td>GC</td><td>43093</td><td>牙科粘接用树脂水泥</td></tr><tr><td>带细丝的玻璃毛细管</td><td>NARISHIGE</td><td>GDC-1</td><td>玻璃毛细管</td></tr><tr><td>图像探测器</td><td>Hamamatsu</td><td>H10770PA-40</td><td>GaAsP光阴极光电倍增管</td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Nikon</td><td>NISelements</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>异氟烷吸入溶液</td><td>Pfizer</td><td>229KAR</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>iXon EMCCD 相机</td><td>Andor</td><td>iXon Life 888</td><td>图像传感器</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>daiitisannkyou</td><td>s9-018506</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>Leica-M60</td><td>Leica</td><td>M60</td><td>体视显微镜</td></tr><tr><td>Linicon</td><td>Linicon</td><td>LV-125</td><td>真空泵</td></tr><tr><td>锁模钛宝石Chameleon Ultra II激光器&amp;nbsp;</td><td>Coherent</td><td>Chameleon Discovery NX</td><td>飞秒激光器</td></tr><tr><td>Mos-Cure</td><td>U-VIX</td><td>mini 365</td><td>便携式LED紫外光源</td></tr><tr><td>PEN Bright</td><td>SHOFU INC.</td><td>PEN Bright</td><td>牙科光固化仪</td></tr><tr><td>拉制仪</td><td>SUTTER instaument</td><td>P-97</td><td>拉制仪</td></tr><tr><td>立体定位仪（小鼠用）</td><td>NARISHIGE</td><td>SR-6M-H</td><td>立体定位仪</td></tr><tr><td>立体定位微操作器</td><td>NARISHIGE</td><td>SM-15R</td><td>立体定位微操作器</td></tr><tr><td>Super-Bond CATALYST V</td><td>SUN MEDICAL</td><td>8070</td><td>牙科粘接树脂水泥</td></tr><tr><td>Super-Bond 牙科粘接单体</td><td>SUN MEDICAL</td><td>8071</td><td>牙科粘接单体</td></tr><tr><td>Super-Bond 牙色聚合物粉末</td><td>SUN MEDICAL</td><td>145052000</td><td>牙色聚合物粉末</td></tr><tr><td>Tarivid&amp;nbsp;Ophthalmic&amp;nbsp;Ointment 0.3%</td><td>Santen Pharmaceutical&amp;nbsp;</td><td>TRN3952</td><td>眼膏</td></tr><tr><td>UlTIMATE XL</td><td>NSK</td><td>Y141446</td><td>牙科实验室微电机控制单元</td></tr><tr><td>紫外固化光学胶</td><td>THORLABS</td><td>NOA61</td><td>紫外固化光学胶</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer</td><td>KP0F2BK</td><td>麻醉剂</td></tr></tbody></table>

使用双光子全息显微镜评估与操控神经活动

Evaluation and Manipulation of Neural Activity Using Two-Photon Holographic Microscopy

光学生物成像和光遗传学领域的最新进展使得在活体动物中可视化和操控生物现象（包括细胞活动）成为可能。在神经科学领域，现已揭示出与学习、记忆等脑功能相关的详细神经活动，并且已能够通过人工手段操控这些神经活动以实现特定的脑功能。然而，传统的基于双光子Ca2+成像的神经活动评估方法存在时间分辨率较低的问题。此外，通过光纤进行的传统光遗传学手段只能同时调控具有相同遗传背景的神经元活动，难以实现对单个神经元活动的精确控制。为解决这些问题，我们近期开发了一种结合光遗传学与数字全息技术的显微镜，该技术可调控飞秒红外激光束，从而实现适用于生物学研究的高时空分辨率成像。本文介绍了神经活动的可视化、评估与操控实验方案，包括样品制备及双光子全息显微镜的操作流程（图1）。这些方案可提供精确的神经活动时空信息，有助于阐明由神经活动异常引起的神经精神疾病的发生机制。

采用本方法获得的代表性记录结果如下所示。 在体 钙2+ 使用全息显微镜成像从颅顶板植入和腺相关病毒注射到数据采集需要2-4周时间。因此，为了获得稳定的结果，减少脑部运动伪影至关重要。颅顶板植入（步骤1.5）和颅窗放置（步骤2.9）是该过程中的关键步骤。此外，选择一种能够在单个神经元中同时表达钙指示剂和视蛋白的腺相关病毒（AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1）也非常重要（步骤2.8）。
图4A 展示了使用定制的 MATLAB 脚本对获取的神经元图像进行全息照明的光斑。如果全息照明成功激活了表达 jGCaMP8f 的神经元，则可通过图像传感器获得 Ca2+ 信号轨迹（图4B），如 图4C 所示。
使用全息刺激评估了神经元之间的功能连接性（图4D），如图4E所示。由于神经元之间的功能连接性是疼痛模型小鼠发病过程中发生改变的神经环路特性之一24，我们描述了一种评估该特性的简单方法。图4F展示了利用GCaMP6m可视化S1HL皮层L2/3神经元的典型图像。当对一个神经元（橙色圆圈）进行全息刺激时，另一个神经元（红色圆圈）同时被激活；因此，神经元之间的功能连接数量为1（图4G）。
<img alt="活体成像、立体定位注射用头固定板和颅窗；显微镜操作流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程示意图。（A）将头固定板固定于颅骨上。（B）向初级躯体感觉皮层后肢足部区域（S1HL）进行立体定位注射腺相关病毒（AAV）。（C）植入颅窗。为评估和操控神经活动，在清醒小鼠中进行in vivo Ca2+成像（D），并结合全息刺激（E）。闪光标记表示全息刺激或照明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示激光输入、空间光调制器和光路的全息成像系统示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：全息显微镜所用系统。（A）全息刺激与照明光路（左侧）在显微镜附近（中）及图像传感器（右侧）处的图像。（B）分别为围绕各自空间光调制器（SLM）的全息刺激与照明光路（左、右）以及围绕扫描头的点扫描光路（中、右）的放大图像。（C）刺激与成像光学路径的示意图。采用纯相位型空间光调制器（SLM）显示数字全息图，SLM前后分别放置扩束镜（由L1和L2组成）以及4f中继系统（全息刺激光路使用L3和L4组合，全息照明光路使用L4和L5组合），以确保每个数字全息图均成像于水浸物镜出瞳处，且成像尺寸略小于充满物镜孔径。为抑制残余的零级成分，在中间像平面处放置一个光束挡块。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜校准流程图；设置涉及活体成像、Z轴扫描和强度检查。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：全息刺激或照明系统校准流程图。 该流程图描述了将全息刺激或照明系统校准至样品空间和成像系统的各个步骤。有关详细说明并下载示例程序，请参阅步骤3“全息刺激或照明系统的准备”。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元对全息刺激的反应；光学激发；神经元活动的图表和示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64205/64205fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：使用全息显微镜进行成像和功能连接性分析的代表性结果。 （A）为了照亮表达 jGCaMP8f 或 GCaMP6m-P2A-ChRmine 的特定神经元，首先获取神经元图像，然后通过自行编写的 MATLAB 脚本在目标神经元上形成光斑。（B）图像传感器的设置（曝光时间、成像区域和像素合并）。（C）在 100 Hz 成像条件下，结合全息照明和图像传感器，表达 jGCaMP8f 的神经元的代表性图像及其钙信号轨迹。（D）该图显示了在不同激光功率下，神经元对全息刺激（1,040 nm）的反应（数据来自以 2 Hz 成像帧率记录的表达 GCaMP6m-P2A-ChRmine 的神经元 [n = 16]）。误差条表示均值的标准误差。（E）在 2 Hz（左）和 30 Hz（右）成像帧率下，10 个不同神经元在全息刺激（蓝色竖线）期间的代表性 Ca2+ 信号轨迹。在 2 Hz 和 30 Hz 的 Ca2+ 轨迹中，相同颜色代表同一神经元。（F）评估神经元之间功能连接的示意图。当橙色神经元受到刺激时，红色神经元同时产生反应，表明这些神经元之间存在功能连接。（G）野生型（WT）小鼠 S1HL 区域表达 GCaMP6m 的神经元的典型图像。比例尺 = 10 µm。（H）在 2 Hz（上）和 30 Hz（下）成像帧率下，全息刺激（蓝色竖线）期间典型的 Ca2+ 信号轨迹。受刺激的神经元用橙色圆圈标出，有反应的神经元用红色圆圈标出，无反应的神经元用灰色圆圈标出。在 2 Hz 和 30 Hz 两种成像速度下均可检测到神经元对全息刺激的响应性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64205/64205fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>我们的装置6 </td>
			<td>Prakash, R. 等.25 </td>
			<td>Marshel, J. H. 等.12</td>
			<td>Robinson, N. T. M. 等.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>横向分辨率</td>
			<td>1.2 μm</td>
			<td>1.27 μm</td>
			<td>―</td>
			<td>2.22 μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>轴向分辨率</td>
			<td>8.3 μm</td>
			<td>56.86 μm</td>
			<td>15.5 μm</td>
			<td>10.26 μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>物镜/数值孔径</td>
			<td>25x/1.1</td>
			<td>20x/0.5</td>
			<td>16x/0.8</td>
			<td>16x/0.8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：以往报道与本系统在全息刺激空间分辨率方面的总结。 描述了测量过程中使用的目标镜的横向分辨率、轴向分辨率以及物镜型号。

我们开发了一种双光子全息显微镜，能够以高时空分辨率可视化、评估和操控神经活动，旨在阐明与异常神经活动相关的神经精神障碍的发病机制。

光学生物成像与光遗传学领域的最新进展使得包括细胞过程在内的多种生物现象得以可视化与操控

本方案可提供关于神经活动的精确时空信息。该技术的主要优势在于能够以高时空分辨率操控和评估神经活动。该方法可能有助于阐明导致神经活动异常的神经精神障碍的致病机制。该方法可应用于神经元及其他器官健康状况的研究。本实验操作由本实验室的博士研究生郭中天（Zhongtian Guo）进行演示。在颅骨窗植入术后一天，于手术前一小时按每公斤体重1.32毫克的剂量腹腔注射地塞米松磷酸钠，以预防脑水肿。在体视显微镜下，使用牙科钻进行直径约两毫米的环形开颅。为减少脑组织损伤，操作牙科钻时应谨慎，保持持续轻微移动和轻度向下的压力。多次使用吸引系统清除骨碎片。去除骨片后，使用人工脑脊液或ACSF溶液清除并冲洗脑表面残留的任何碎片。重复此清洗步骤数次，以抑制炎症反应。使用压力注射系统，设定适当压力，通过尖端直径为10至20微米的玻璃毛细管在10分钟内注射500纳升AAV溶液。如果玻璃毛细管中 AAV 溶液的液面逐渐下降，说明 AAV 溶液正在被注入脑内。将玻璃毛细管原位保留额外 10 分钟，以防止回流。重复此操作三次，共计向脑内注入 1.5 µL 的 AAV 溶液。使用微量移液器将2%低熔点琼脂糖涂抹于S1脑区表面，然后在颅骨开窗处放置一片玻璃窗，两侧用盖玻片固定。在琼脂糖仍处于液态时，将盖玻片轻轻压紧，以防止琼脂糖中产生气泡。使用牙科粘接树脂胶封闭颅窗边缘。为校准全息刺激系统，将红色荧光载玻片表面置于样本平面，并将显微镜设置为活体成像模式，使用弱激发光照射。运行校准图形用户界面（GUI）。mfile，检查参数面板并点击保存按钮。在第一步面板中点击Z扫描按钮，系统将自动生成21个不同的轴向平面，每个平面之间相距两微米，并在每个平面上随机生成三个点。移动滑动条并查看实时图像。找到一个最佳平面，使光斑呈现最小且最亮的状态，然后点击保存按钮。这将为数字全息图自动生成一个偏移的球面波前。在第二步面板中点击“运行”按钮，然后在左侧方框上点击六个光斑。检查实时图像。如果存在六个可区分的荧光点，则将它们的 X 轴和 Y 轴坐标输入到编辑框中，然后点击保存按钮。这将自动生成精细的变换系数，用于全息刺激与成像系统之间的坐标校准。然后，点击步骤三面板中的“扫描”按钮。系统将生成 441 个数字全息图，以在 21×21 步的范围内对视场进行单点扫描。在列表框中切换图案时，同步查看图像变化。调整激光功率，以获得处于成像设备动态范围内的光斑图像。将成像设备置于记录模式，然后点击播放按钮。播放完成后，在第四步窗格中点击生成权重图，并选择一幅堆叠图像。然后关闭校准图形用户界面窗口。系统将自动生成权重图，以补偿每个光斑中不均匀的强度。将带有头固定板的AAV注射小鼠置于显微镜下，使用全息显微镜和锁模钛宝石激光器（波长调至920纳米）配合25倍物镜进行双光子成像。打开商用成像软件的实时成像模式。调节图像探测器的电压和成像激光的功率，以优化表达GCaMP8f的神经元的亮度。采集表达该蛋白的神经元图像。为了使用全息照明技术照亮特定神经元，请运行 SLMcontrol.m 脚本文件。单击参考图像并选择已获取的图像。然后，单击“Spot”按钮以选择图像中神经元上的特定像素，并按键盘上的回车键完成操作。为了利用图像传感器以高时间分辨率检测神经活动，需设置曝光时间、成像区域和像素合并（binning）参数，然后进行图像采集。将小鼠放置在显微镜下并完成双光子成像后，打开商用成像软件。在活体成像模式下，调节图像探测器的电压和成像激光的功率，以优化表达GCaMP-6m-p2A-ChRmine的神经元的亮度。采集表达这些蛋白的神经元图像，随后按照前述步骤照射特定神经元。为研究第二层和第三层神经元之间的功能连接，使用空间光调制器生成光遗传学刺激的全息模式，并将其与双光子钙成像相结合。将成像激光的强度设置为920纳米，功率为10至20毫瓦，视野设置为256微米×256微米，测量深度为距皮层表面100至150微米处。像素驻留时间设为1.5微秒（对应2赫兹）或100纳秒（对应30赫兹）。采用2赫兹和30赫兹两种成像帧率，以检测单次全息刺激是否引发神经元的钙反应。将全息刺激激光的强度设置为10毫瓦，该强度足以激活单个神经元。同时，在10秒基线期后，以1040纳米进行10次全息刺激，每次刺激持续50毫秒，刺激间隔为8秒，并在920纳米下成像钙离子反应。之后，将小鼠放回其饲养笼中。此处展示了在100赫兹成像条件下，表达GCaMP8f的神经元在接受全息刺激并由图像传感器记录时的代表性图像及信号轨迹。该图显示了神经元在不同激光功率下对全息刺激的响应。此处还展示了在2赫兹和30赫兹成像帧率下，对10个不同神经元进行全息刺激期间的代表性钙离子（Ca²⁺）信号轨迹。相同颜色表示相同的神经元。此处展示了一个评估神经元之间功能连接的示意图。当刺激橙色神经元时，红色神经元同时产生反应，表明这些神经元之间存在功能连接。此处展示的是野生型小鼠初级体感皮层表达GCaMP6m的神经元典型图像。这些图形图像代表了在全息刺激下，以2 Hz和30 Hz成像帧率记录的典型钙离子（Ca²⁺）信号动态。在2 Hz和30 Hz两种成像速度下均可检测到神经元对全息刺激的响应性。这些步骤对于减少脑部运动以及获得稳定结果至关重要。我们认为，该显微镜能够诱导神经元以特定模式产生行为活动。利用这一技术，我们现在能够评估并操控单个神经元的活动，并详细表征神经精神活动。

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神经科学

使用双光子全息显微镜评估和操纵神经活动

理解脊椎动物中枢神经系统功能需要对大量神经元进行记录，因为皮层功能是在神经元群体水平上产生的。本文描述了一种光学方法，可实现单细胞和单动作电位分辨率的阈上神经活动记录，即抖动式随机访问扫描技术。该方法能够以高时间分辨率记录多达100个神经元的胞体荧光钙信号。通过最大似然算法，从胞体荧光钙信号中反卷积出潜在的阈上神经活动。该方法可高效率、低假阳性率地可靠检测动作电位，适用于神经元群体活动的研究 关键词：中枢神经系统，神经元群体，光学记录，单细胞分辨率，单动作电位检测，钙成像，抖动式随机访问扫描，最大似然反卷积 体外 和 在体.

以单细胞和单峰分辨记录超阈值神经活动的光学成像

来源： Maruoka, H., et. al. 清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。J. Vis. Exp. (2022)...

在清醒小鼠中同步成像小胶质细胞动态与神经元活动

来源： Mizuno, H., et al. In Vivo 新生小鼠皮层神经元的双光子成像. J. Vis. Exp.

双光子显微镜用于成像小鼠幼崽的神经元形态

来源：Kato, D. 等.，利用双光子全息显微镜评估与操控神经活动。J. Vis. Exp.

双光子全息显微技术用于研究小鼠模型中的神经活动与连接性

本文描述了一种在新皮层预定义的功能微区中用荧光染料标记神经元的方法。首先，利用内在信号光学成像获取功能图谱；然后，采用双光子显微镜对图谱中特定微区内的神经元进行标记和成像。...

结合内在信号成像与双光子成像技术实现新皮层特定功能微区神经元的靶向标记

本文描述了在虚拟现实环境中对小鼠行为期间进行皮层双光子成像所涉及的实验步骤。...

小鼠在虚拟现实环境中导航时的双光子钙成像

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry...

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

我们介绍一种结合全细胞膜片钳记录与双光子成像的方法，用于在急性脑片中的神经元树突内记录 Ca2+...

脑片中神经元树突的双光子钙成像

本方法描述了一种慢性制备技术，可实现对活体小鼠海马体的光学观察。该技术可用于在数周时间内对神经元结构可塑性以及活动诱导的细胞可塑性进行纵向光学成像。...

活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

当与头部固定板及兼容单光子和双光子显微镜的光学设计结合使用时，微棱镜透镜在多种条件下测量垂直神经元柱中的神经反应方面具有显著优势，包括在头部固定状态下的精确控制实验，或在自由活动动物中进行的自然行为任务。...

使用微棱镜对自由活动和头部固定动物中已鉴定的神经元群体进行长期成像

了解双光子全息显微镜技术，用于高时空分辨率评估和操控神经活动，揭示神经精神疾病的发病机制。该方法结合光遗传刺激与钙成像，为研究神经元功能连接提供关键工具。

使用双光子全息显微镜评估与操控神经活动

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