En Face 小鼠胚胎心内膜垫平面形态发生分析的制备

本方案可实现对原始心内膜进行平面方向的分析。我们能够分析心内膜细胞的分布、其他连接结构的各向异性，并描述瓣膜发育过程中单个心内膜细胞的形态。与传统的组织切片相比，对完整胚胎内心瓣膜再生区域进行正面成像，可实现对瓣膜发育过程中心内膜细胞的平面细胞极性及动态行为的分析。

该方法可用于深入研究心脏发育过程中平面细胞极性。首先将安乐死后的妊娠小鼠子宫取出，置于含有冰冷PBT的培养皿中。在解剖显微镜下，用精细镊子从子宫中分离出各个蜕膜组织。

使用精细镊子在蜕膜的白色部分做切口，此处即为胚胎所在位置。轻柔地取出胚胎，避免牵拉，并用剪去尖端的P-1000移液器将胚胎转移至含有新鲜PBT的新培养皿中，移液器尖端剪开的直径应足够大，以确保胚胎顺利通过而不破损。用于基因分型时，取约0.5平方毫米的卵黄囊组织，或从尾部末端向头部方向数第5至第10个体节处取一小段尾组织，放入100毫升适当的缓冲液中进行消化处理。

在通风橱内，将胚胎转移至含有冰上预冷的4%多聚甲醛的2毫升微量离心管中，于4°C条件下进行固定。在4°C条件下，使用旋转仪固定胚胎，时间可为2小时至过夜。在通风橱内，从微量离心管中移除4%多聚甲醛固定液，注意不要触碰胚胎。

将PFA弃入适当的容器中。用冷的PBT在室温下洗涤胚胎5次，每次10分钟。使用精细镊子取出心脏，并将其转移至含有新鲜PBT的新1.5毫升微量离心管中。

将 PBT 替换为含吐温的 PBS，于摇床中室温孵育，每次五分钟，共洗涤三次。将含吐温的 PBS 替换为封闭液（含 10% 经热灭活的牛血清的含吐温 PBS），于 4 °C 在摇床中孵育两小时至过夜。

用含有目标浓度一抗的封闭液替换原有的封闭液。在4°C下于摇床上孵育过夜。在4°C下过夜孵育后，将样品在室温下于摇床上继续孵育1.5小时。

此步骤对于提高信噪比至关重要。将一抗溶液移除后保存于4°C，可用于后续最多三次实验。为达到最佳保存效果，加入叠氮化钠至终浓度为0.02%。

然后，用含Triton的PBS洗涤胚胎三次，每次三分钟。再用含Triton的PBS洗涤胚胎三次，每次30分钟，并置于4°C的摇床上孵育。最后一次洗涤后，加入1毫升封闭液，其中含有针对一抗宿主物种的荧光标记二抗。

然后向溶液中加入 DAPI，并在 4°C 条件下于旋转摇床上孵育胚胎过夜。在 4°C 过夜孵育后，将胚胎在室温下于旋转摇床上继续孵育 1.5 小时。此步骤对于提高信噪比至关重要。

重复文本稿件中提到的 PBS-Triton 洗涤步骤。将心脏置于含有 PBS 的 35 毫米培养皿中。使用钨丝和精细镊子分离房室管或流出道，并将其纵向切开。

准备盖玻片、载玻片、镊子、配有合适枪头的P-200移液器、纸巾，以及不含DAPI的水性甘油封片剂用于荧光成像。在载玻片上粘贴两条相距0.3至0.6厘米的胶带，以形成一个三维空间，使样本在封片过程中保持原有形态而不被压扁。随后，使用剪去尖端的P-200移液器枪头，吸取约20微升缓冲液，将样本小心滴加在两条胶带之间的载玻片上。

使用解剖显微镜以提高操作准确性。用精细镊子将样本的心内膜朝上、心肌层朝下放置在载玻片上。用纸巾吸去多余的 PBS，避免触碰样本。

然后在室温下干燥样品一到两分钟，使样品粘附在载玻片上。向组织中加入40微升水性封片介质。将盖玻片置于两段胶带之上，并用针或镊子缓慢将其放下，覆盖在组织上。

避免产生气泡。在盖玻片的每个顶点处滴加一滴指甲油以封固盖玻片。待指甲油干燥后，用吸水纸巾擦拭盖玻片侧面多余的封片介质。

避免移动盖玻片。沿盖玻片边缘涂抹指甲油，以完全密封，防止封片剂蒸发。使用正置或倒置共聚焦显微镜，以10倍放大倍数拍摄整体视野图像，以63倍放大倍数结合3倍缩放拍摄详细图像。

在瓣膜形成过程中，以细胞分辨率分析了心内膜细胞的形态。在心内膜中，单个细胞或少数细胞克隆表达GFP。GFP的表达结合VE-钙黏蛋白的亚细胞定位，是研究黏着连接（AJ）动态变化与丝状伪足形成及前上皮-间质转化（pre-EMT）细胞之间关系的有效方法，因为这些细胞在黏着连接解体时会形成膜突起。

心内膜中VE-cadherin染色强度的差异表明，在瓣膜前阶段，房室管胚胎心内膜存在各向异性收缩力。在E8.5和E9.5时对整个心脏进行VE-cadherin抗体染色。在E8.5时，房室管的心内膜倾向于形成稳定的上皮结构，未检测到由四个以上细胞形成的顶点。

在E9.5时期，可观察到多达六个细胞的顶点形成类似玫瑰花结的结构，这种细胞排列方式与先前报道的正在发生活跃细胞重排的上皮组织相似，提示房室管内皮细胞在瓣膜发育过程中正在进行动态的细胞重排。掌握该技术需要一定的学习曲线。此外，强烈建议使用Sovereign镊子和钨丝。

目前，瓣膜前期内皮细胞的可视化研究仅限于横截面观察。我们的方法提供了从平面视角研究胚胎期瓣膜内皮细胞行为的可能性。