多路复用表面等离子体共振成像芯片上的多模态分析平台，用于分析细胞外囊泡亚群
March 17th, 2023
本文提出了新一代多参数分析平台，具有更高的通量，用于表征细胞外囊泡亚群。该方法基于多重生物传感方法与原子力显微镜的计量和形态力学分析相结合，结合拉曼光谱，以鉴定捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标。
EV的复杂性使得很难识别感兴趣的亚群，并且该协议可以通过其表型，尺寸特征和纳米力学特性来检测它们。这种技术组合是一种无标记方法，它使我们能够从条件培养基和血浆中实时检测电动汽车。该技术能够表征感兴趣的纳米颗粒的深层子集，以便用作病理学的生物指示剂，或也用作药物递送的纳米颗粒。
由于这是一种非常灵敏的方法，因此在注入感兴趣的样品之前必须注意生物芯片的制备。在对芯片进行包衣和功能化后，将生物芯片在 200 毫摩尔乙基二甲氨基丙基碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺和 50 毫摩尔/升 N-羟基琥珀酰亚胺的混合物中孵育至少 30 分钟在室温下黑暗中。使用观察剂，加入300纳升配体溶液，并将生物芯片在声浴下孵育30分钟。
用超纯水从顶部清洗生物芯片。加入一滴与棱镜折射率相同的油滴，在生物芯片和棱镜之间形成均匀的薄层，并将其轻轻地放在与生物芯片折射率相同的棱镜上。对于表面等离子体共振成像，将生物芯片安装在SPRi系统上。
导航到软件左侧的下拉菜单，然后单击工作目录。找到可见不同斑点的图像，然后单击以选择此图像。然后写下配体家族的名称，然后单击完成物种定义。
将带有光标的黑线拖动到最佳工作角度。单击将镜像移动到工作角度，然后选择一个工作角度。现在点击动力学。
当软件提示用户定义阴性对照时，此时选择无阴性对照。以每分钟50微升的速度注射大鼠血清白蛋白四分钟。以每分钟20微升的速度注射乙醇胺10分钟，以使表面上仍然存在并具有反应性的羧基失活。
之后，通过以每分钟 50 微升的速度注射 40 毫摩尔 OG 来洗涤生物芯片，持续四分钟。在生物功能化芯片上以特定浓度注射细胞外囊泡，同时跟踪不同点上囊泡相互作用的动力学。还要确定反射率的值和相互作用的水平。
一旦稳定下来，在芯片上注射戊二醛，在进行AFM成像之前将细胞外囊泡固定在它们所在的位置。将载玻片上面罩顶部的生物芯片对齐。使用AFM顶部的CCD相机将悬臂定位在必须扫描的正确位置。
在接触模式下从三个到五个大区域到小区域开始AFM采集。接下来，通过首先选择高度通道，使用JPK数据处理软件处理AFM图像。选择要从每条线中减去的多项式拟合以获得拉直的扫描线。
选择金晶粒上的高度阈值以消除表面上的粗糙度。晶粒提取模块使用 8.5 纳米的高度阈值标记晶粒。分析白蛋白钝化后的多重生物芯片。
没有默认值的芯片。芯片由于斑点融合、接枝较弱或气泡或污染物而存在一些缺陷。并显示了没有微阵列的裸金芯片，用于检查细胞外囊泡在金上的吸附。
在多重生物芯片上的捕获实验显示出不同配体的良好反射率信号，以及不同配体的良好信噪比，因为阴性对照的反应可以忽略不计。注射细胞外囊泡样品后的细胞外囊泡吸附显示出高反射率信号，表明这些囊泡能够吸附并保持在金芯片上稳定。细胞外囊泡加载后，在生物芯片上生成细胞外囊泡的大规模和小规模AFM图像。
高分辨率近距离观察可实现细胞外囊泡的计量。生物芯片上细胞外囊泡的有效直径范围为30至300纳米，其中绝大多数在60纳米左右。在空气和液体中获得的结果具有可比性。
吸附在裸芯片上的细胞外囊泡的拉曼光谱显示出清晰的光谱，其峰主要对应于亚甲基振动，亚甲基振动与细胞外囊泡膜的脂质有关。严格准备您的生物芯片非常重要，以便能够以可重复的方式准确检测您的电动汽车。可以使用蛋白质印迹和纳米颗粒示踪分析等常规方法来关联和确认表型和尺寸模式。
此外，多组学分析甚至有望更深入地研究 EV 分子表征和潜在的子集区分。
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概述
本研究提出了一个用于高通量表征细胞外囊泡（EV）子集的新型多参数分析平台。该平台结合了多重生物传感方法、原子力显微镜和拉曼光谱，用于实时分析EV，重点关注其表型、尺寸分布和纳米机械特性。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞外囊泡表征
- 多参数分析技术
- 生物传感方法
背景
- EV的复杂性使子群体的识别具有挑战性。
- EV作为病理学和药物递送的生物标志物的重要性。
- 在各种生物样品中需要敏感的检测方法。
使用的方法
- 结合多重生物传感、原子力显微镜和拉曼光谱。
- 利用生物功能化微阵列实时检测EV。
- 无标记方法，以最大限度地减少对EV表征的干扰。
主要结果
- 该技术显示出基于尺寸和组成对EV的有效检测。
- 高分辨率成像揭示了EV的直径在30到300纳米之间，主要集中在60纳米左右。
- 拉曼光谱表明脂质膜组成，证实了该方法的有效性。
结论
- 该研究成功展示了一种可靠的广泛EV表征方法。
- 这项工作对生物标志物研究和治疗应用具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicle (EV) subsets with high specificity and throughput is a critical challenge in early biomarker discovery and therapeutic platform development. The described multimodal analytical platform integrates multiplexed biosensing, atomic force microscopy, and Raman spectroscopy to deliver quantitative, label-free phenotypic and molecular profiling of EVs. This capability enhances predictive confidence in EV-based biomarker validation and supports risk-adjusted portfolio decisions in translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic and nanomechanical profiling of EV subpopulations for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing EV subsets based on size, composition, and molecular features.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of EVs as disease-relevant bioindicators.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, multiplexed biochips for reproducible EV capture and analysis workflows.
- Delivers quantitative, real-time readouts of EV interactions and adsorption profiles.
- Standardizes assay conditions to enable reliable cross-sample and cross-ligand comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Aligns EV subset characterization with translational biomarker strategies for disease monitoring.
- Provides continuity from discovery-stage EV profiling to preclinical validation of candidate biomarkers.
- Reduces mechanistic ambiguity in EV-based therapeutic and diagnostic development.
Pipeline & Workflow Integration
This multimodal platform bridges early discovery, screening, and translational research by enabling comprehensive EV subset analysis from biological fluids.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and mechanistic de-risking through multiplexed, quantitative EV profiling.
- Screening: Delivers reproducible, label-free assay outputs for EV subset discrimination and ligand specificity.
- Analytics: Integrates morphomechanical and molecular readouts to inform cross-condition comparisons and statistical analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and preclinical continuity for EV-based diagnostics.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable analytical platform for diverse EV research and development programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker and therapeutic candidate selection.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and throughput in EV analysis workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and reduces late-stage biological risk in EV-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EV-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiplexed biosensing, AFM, and Raman spectroscopy for optimal platform operation.
- Demands rigorous biochip preparation and functionalization to ensure reproducibility and sensitivity.
- Needs access to advanced instrumentation and analytical infrastructure for high-resolution EV characterization.
- Benefits from cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different biological matrices or EV sources as supported by the platform's flexibility.
