Name: 多路复用表面等离子体共振成像芯片上的多模态分析平台，用于分析细胞外囊泡亚群 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T13:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: 学习多路复用表面等离子体共振成像技术，用于细胞外囊泡亚群的多模态分析。该方法结合原子力显微镜和拉曼光谱，实现无标记实时检测，为生物标志物研究和药物递送应用提供可靠工具。

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感谢巴黎 IVETh 核心设施的 Kelly Aubertin 和 Fabien Picot 进行拉曼成像实验。感谢台北医学大学中国台湾的 Thierry Burnouf 和来自法国赫朗库尔的 Zuzana Krupova 分别提供了源自血小板和牛乳样品的细胞外囊泡样品。本研究工作得到了勃艮第-弗朗什-孔泰大区以及 EUR EIPHI 研究生院（NOVICE 项目，2021–2024）的支持。部分工作在 FEMTO-ENGINEERING 的 CLIPP 平台及 RENATECH 洁净室设施中完成，特此感谢 Rabah Zeggari 的支持。

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</ol>

作者声明无利益冲突。

目前最常用的EV鉴定方法主要包括：通过蛋白质特异性免疫印迹法确认EV的来源，通过透射电子显微镜（TEM）确认其结构，以及通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对样本体积中EV的数量和粒径分布进行定量3。然而，由于（生物）医学研究领域对EV的高度关注，以及现有分析工具的局限性，科学界迫切需要开发新的EV表征、区分与定量方法。
目前大多数研究进展集中于将免疫标记或免疫捕获原理与先进的物理方法相结合，用于细胞外囊泡（EV）的检测。其中一些方法致力于对单个EV进行鉴定，以在纳米级对象尺度上获得最大程度可靠的检测数据；另一些方法则更侧重于开发经济、可靠且适用于临床应用的全局性检测方法。
NBA 平台结合了在多重金基底上对细胞外囊泡（EVs）的生物检测与原子力显微镜（AFM）表征，能够对复杂生物液体中存在的纳米囊泡进行深入的定性分析。事实上，由于生物芯片具有高选择性，可直接注入粗制样品，并凸显囊泡的贡献。
该方法旨在对吸附/接枝或通过亲和力捕获...

外泌体（EV）研究在诊断和治疗领域的日益受关注1,2,3,4,5，加之该领域所面临的挑战，促使研究人员开发并应用了多种用于定量或表征这些囊泡的方法和技术。目前最常用的EV鉴定方法包括：通过蛋白质特异性免疫印迹和蛋白质组学分析来确认EV的来源，利用透射电子显微镜（TEM）观察其结构，以及采用纳米颗粒追踪分析（NTA）对样本体积中EV的数量及其粒径分布进行定量。
然而，这些技术单独使用时均无法提供表征细胞外囊泡（EV）亚群所需的全部信息。由于EV在生化和物理特性上的多样性，其本身具有高度异质性，这阻碍了对EV（尤其是混合物中的EV，即粗样品）进行可靠且可重复的全局分析。因此，亟需针对EV的检测与表征方法，既能用于单个EV的分析，也能用于总体表征，以补充其他虽快速但缺乏选择性的方法6.
通过透射电子显微镜（TEM 或 cryoTEM）或原子力显微镜（AFM）进行高分辨率成像，可实现对细胞外囊泡（EVs）形态和形貌参数的纳米级分辨率测定7,8,9,10,11,12。然而，电子显微镜用于生物样本（如 EVs）的主要局限在于其观测需在真空条件下进行，因而要求对样品进行固定和脱水处理。此类制样过程使得从观察到的结构推断溶液中 EVs 的真实形态变得困难。为避免样品脱水，冷冻电镜技术（cryoTEM）是表征 EVs 最为合适的方法13，该技术已广泛用于 EVs 超微结构的分析。利用生物功能化金纳米颗粒对囊泡进行免疫标记，还可识别 EVs 的特定亚群，并将其与复杂生物样本中的其他颗粒区分开来。然而，由于电子显微镜所分析的 EVs 数量较少，通常难以对复杂且异质性的样本实现具有代表性的表征。
为了揭示这种尺寸异质性，国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议分析足够数量的宽场图像，并辅以高分辨率的局部放大图像，以清晰显示单个细胞外囊泡（EVs）14。原子力显微镜（AFM）是研究EVs的另一种替代方法，可作为光学方法和电子衍射技术的补充。该技术利用固定在弹性悬臂上的尖锐探针，逐行扫描沉积在支撑基底上的样品，并通过反馈回路调节探针与样品表面各组分之间的距离。这种方法可用于表征样品的表面形貌，并获取形态力学信息15,16,17,18。EVs可通过AFM进行扫描，既可在将其沉积于原子级平整基底后直接成像，也可在利用抗体、肽段或适配体功能化的特异性基底捕获后，用于表征不同的EV亚群18,19。由于AFM能够在无需预处理、标记或脱水的情况下，对复杂生物样本中的EVs结构、生物力学特性及膜结合生物分子含量进行定量和同步检测，因此目前正被越来越多地用于在生理温度和介质条件下，对EVs进行精细且多参数的表征。
本文提出了一种利用可进行多重（生物）化学功能化的核心金质生物芯片的方法。该基底构成了一种强大分析平台的基础，该平台结合了通过表面等离子共振对细胞外囊泡（EV）亚群进行生物检测的技术；当EV被吸附/接枝或通过免疫捕获固定在芯片上后，原子力显微镜（AFM）可实现对EV的计量学及形态力学特性表征。结合芯片上捕获的EV亚群的拉曼特征信号，该分析平台能够以无标记、无需任何预处理步骤的方式对生物样本中存在的EV进行定性分析。本文表明，借助高度严谨的基底制备与数据采集方法，将多种强大技术相结合，可实现对EV深入、明确且稳健的分析。
本方法的原理是制备金基底，吸附/接枝或捕获EV亚型，并通过原子力显微镜（AFM）扫描以评估每种EV亚群的尺寸和形态。此外，对吸附的EV进行拉曼光谱分析。该基底实际上可呈现三种复杂程度递增的界面类型：裸露表面、化学功能化表面或配体微阵列。在描述本实验方案的各个步骤之前，读者可参考图1中所示的纳米生物分析平台（NBA）方法的示意图，该方法结合了表面等离子体共振成像（SPRi）、原子力显微镜（AFM）和光谱技术。
<img alt="纳米生物分析平台示意图，包含 SPRi、AFM 和生物芯片；通过光谱学和分析技术进行细胞外囊泡分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64210/64210fig01v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：纳米生物分析平台。该方法结合了（A）表面等离子体共振成像、（B）原子力显微镜以及红外/拉曼（纳米）光谱技术，所有技术均在同一基底——一种多重金芯片上进行。缩写：NBA = 纳米生物分析平台；SPRi = 表面等离子体共振成像；AFM = 原子力显微镜；EV = 细胞外囊泡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64210/64210fig01largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
核心金质生物芯片构成了该平台的核心，因为所有无标记表征技术均在此生物芯片上进行。根据细胞外囊泡（EV）表征的需求（针对全部EV或特定EV亚群）以及所用方法的局限性或要求，已开发出三种类型的金质生物芯片表面：分别为“裸露”表面、经化学功能化的“C11/C16”表面，以及配体生物功能化的“配体”金表面。
这种裸芯片（称为“裸”）可实现细胞外囊泡（EVs）在金表面的简单吸附。研究者可自行选择所用缓冲液，并采用被动方式（孵育后洗涤）或在流动条件下（如表面等离子体共振成像，SPRi）进行吸附。此外，这种被动吸附既可在整个芯片表面进行（作为宏阵列），也可利用微量移液器点样仪将样品定位在微阵列区域。流动条件下的操作程序可使研究者实时监测EV吸附的动力学过程及吸附程度。当化学修饰层界面可能干扰分析方法时（例如拉曼光谱），通常采用这种基于裸金基底的方法。
这种化学功能化的生物芯片被称为“C11/C16”，当需要对细胞外囊泡（EV）样本进行整体分析时，可用于在金表面通过硫醇盐形成初级酰胺键，共价结合大量且稳定的EV“地毯”。具体而言，金表面通过巯基十一醇（11-MUOH：“C11”）和巯基十六烷酸（16-MHA：“C16”）的硫醇盐混合物进行功能化修饰，并将部分硫醇盐化学活化，以实现与靶标分子的共价结合。该策略既可通过被动方式实现（孵育后冲洗，可在“宏阵列”中操作，也可使用微量移液器点样仪在多个微阵列上操作），也可在流动条件下（如表面等离子体共振成像，SPRi）进行，以实时监测EV在金表面的接枝动力学过程和结合水平。
该 配体生物功能化生物芯片，称为 "配体通过化学活化，可将不同的配体（如抗体、受体）共价接枝到其表面，从而选择性地（通过亲和作用）捕获生物样本中共存的不同EV亚群。

<table><tbody><tr><td>CD41a 抗体</td><td>Diaclone SAS (法国)</td><td>447528</td><td></td></tr><tr><td>CP920</td><td>Microparticles GmbH，德国</td><td>448303</td><td></td></tr><tr><td>DXR3xi&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1502</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma</td><td>A6272</td><td></td></tr><tr><td>乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>血小板浓缩物来源的细胞外囊泡（Evs）</td><td>合作单位：T. Burnouf 教授（TMU，中国台湾台北）</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>牛乳来源的细胞外囊泡（Evs）</td><td>合作单位：Z. Krupova 博士（Excilone，Helincourt—法国）</td><td>3450</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma</td><td>56845</td><td></td></tr><tr><td>Gwyddion&amp;nbsp;</td><td></td><td>853.223.020</td><td></td></tr><tr><td>磁控溅射设备</td><td>PLASSYS</td><td>SAB5300165</td><td></td></tr><tr><td>巯基十六烷酸（mercapto-1-hexadecanoic acid）</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>巯基-1-十一醇（Mercapto-1-undecanol）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>O8001</td><td></td></tr><tr><td>Mountains SPIP 图像分析软件</td><td>Digital Surf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoWizard 3 Bioscience&amp;nbsp;</td><td>Bruker-JPK&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>辛基葡萄糖苷（Octyl Glucoside, OG）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>卵清蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline, PBS）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大鼠血清白蛋白（Rat Albumin Serum, RSA）</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>醋酸钠缓冲液（Sodium acetate buffer）&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPR-Biacore 3000</td><td>GE Healthcare / Cytiva life sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRi 生物芯片</td><td>MIMENTO 技术平台</td><td></td><td>生物芯片于贝桑松洁净室内部制备</td></tr><tr><td>SPRi Plex II</td><td>Horiba Scientific&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

Multimodal Analytical Platform on a Multiplexed Surface Plasmon Resonance Imaging Chip for the Analysis of Extracellular Vesicle Subsets

细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞产生的一类膜源性微小囊泡，直径范围从50到数百纳米不等，是细胞间通讯的重要媒介。它们正逐渐成为多种疾病诊断和治疗的有前景工具。细胞通过两种主要的生物发生途径产生EVs，这些EVs在大小、组成和内容物上存在差异。由于其在尺寸、组成及细胞来源方面的高度复杂性，对EVs的表征需要结合多种分析技术。本项目旨在开发新一代高通量多参数分析平台，用于EVs亚群的表征。为实现这一目标，研究基于课题组已建立的纳米生物分析平台（NBA），该平台通过将多重生物传感方法与原子力显微镜（AFM）对微阵列生物芯片上捕获的囊泡目标进行的计量学和形貌力学分析相结合，实现了对EVs的创新性研究。本工作的目标是进一步结合拉曼光谱技术，对EVs进行表型和分子水平的分析。这些技术发展使得能够提出一种多模态且易于使用的分析解决方案，用于临床相关生物液体中EV亚群的区分。

确定配体接枝的最佳pH条件 
用于制备生物芯片的不同配体在不同pH条件下进行测试，以评估其与硫醇盐化学层相互作用的能力（图3）。将配体溶于不同pH值的乙酸盐缓冲液中，注入经C11C16化学功能化修饰的生物芯片表面。溶液在表面随机注入，每次配体注入后均注入去垢剂（40 mM OG）以恢复基线。该预富集测试可用于确定每种配体接枝的最佳pH值。如图3所示示例中，根据接枝斜率和接枝水平，选择pH 6作为最佳pH值。
SPRi CCD 图像 
将生物芯片（裸金表面、化学功能化表面或带有微阵列的表面）插入 SPRi 仪器后，所记录的 SPRi CCD 图像如图4所示。对于带有微阵列的生物芯片，图像采集于表面经白蛋白钝化之后。芯片上系统性地设置了点样的重复孔（双复孔或三复孔），同时芯片上自动包含一个阴性对照...

本文提出了一种新一代的多参数分析平台，可提高细胞外囊泡亚群表征的通量。该方法结合了多重生物传感技术与原子力显微镜的计量学和形貌力学分析，并耦合拉曼光谱，用于对捕获在微阵列生物芯片上的囊泡靶标进行定性分析。

细胞外囊泡（EVs）是由所有细胞产生的膜源性微小囊泡，直径范围从50到数百纳米不等。

细胞外囊泡（EVs）结构复杂，难以识别其中特定的亚群，而本方案可通过其表型、尺寸分布及纳米力学特性对其进行检测。该技术组合是一种无标记方法，可实现从培养基及血液血浆中实时检测EVs。该技术能够深入表征目标纳米颗粒的亚群，既可用于病理状态的生物标志物，也可作为药物递送载体的纳米颗粒。由于该方法非常灵敏，在注入目标样品前，必须注意生物芯片的制备。在完成芯片的包被和功能化后，将生物芯片置于含有200毫摩尔/升的乙基二甲基氨基丙基碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺和50毫摩尔/升的N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中，在室温避光条件下孵育至少30分钟。使用点样仪加入300纳升配体溶液，并将生物芯片置于超声水浴中孵育30分钟。用超纯水从上方冲洗生物芯片。加入一滴与棱镜折射率相同的油，以在生物芯片和棱镜之间形成均匀的薄层，并轻轻将其放置在与生物芯片折射率相同的棱镜上。进行表面等离子体共振成像时，将生物芯片安装到SPRi系统中。在软件左侧的下拉菜单中，点击“工作目录”。找到显示不同斑点的图像，然后点击选择该图像。接着输入配体家族的名称，点击“完成物种定义”。使用光标将黑线拖动至最佳工作角度。点击“将镜片移至工作角度”，并选择一个工作角度。然后点击“动力学”。当软件提示用户定义阴性对照时，此时选择“无阴性对照”。以每分钟50微升的速度注入大鼠血清白蛋白，持续4分钟。然后以每分钟20微升的速度注入乙醇胺，持续10分钟，以灭活仍存在于表面且具有反应性的羧基基团。随后，以每分钟 50 微升的速度注入 40 毫摩尔的 OG，清洗生物芯片 4 分钟。在遵循不同位点上囊泡相互作用动力学的同时，将细胞外囊泡以特定浓度注入生物功能化的芯片上。同时测定反射率值及相互作用水平。待其稳定后，在芯片上注入戊二醛，以固定细胞外囊泡，防止其在进行原子力显微镜成像前发生位移。将生物芯片对准玻璃载片上的掩膜顶部。利用原子力显微镜上方的CCD相机，将悬臂定位至需要扫描的正确位置。以接触模式开始原子力显微镜（AFM）采集，从三到五个由大到小的区域进行扫描。随后，使用 JPK 数据处理软件处理 AFM 图像，首先选择高度通道。选择多项式拟合以从每条扫描线中减去，从而获得校正后的扫描线。选择金颗粒的高度阈值以消除表面粗糙度。颗粒提取模块采用8.5纳米的高度阈值来标记颗粒。在白蛋白钝化后对多重生物芯片进行了分析。无默认状态的芯片。存在一些缺陷的芯片，这些缺陷由斑点融合、接枝弱化、气泡或污染物引起。同时展示了一个无微阵列的裸金芯片，用于检测细胞外囊泡在金表面的吸附情况。在多重生物芯片上的捕获实验显示出不同配体具有良好的反射信号，且不同配体的信噪比较高，因为阴性对照的响应可忽略不计。细胞外囊泡样品注入后，细胞外囊泡在芯片上的吸附表现出高反射信号，表明这些囊泡能够吸附并稳定地停留在金芯片表面。在加载细胞外囊泡后，获得了生物芯片上细胞外囊泡的大尺度和小尺度原子力显微镜（AFM）图像。高分辨率的近距离视图可实现对细胞外囊泡的计量分析。生物芯片上细胞外囊泡的有效直径范围为 30 至 300 纳米，其中大多数集中在 60 纳米左右。在空气和液体中获得的结果具有可比性。裸芯片上吸附的细胞外囊泡的拉曼光谱显示出清晰的谱图，其峰位主要对应于与细胞外囊泡膜脂质相关的亚甲基振动。为了能够准确且可重复地检测您的细胞外囊泡（EVs），必须严格制备您的生物芯片。可采用蛋白质印迹（Western blotting）和纳米颗粒追踪分析等常规方法，以关联并验证表型和粒径分布模式。此外，多组学分析有望进一步深入外泌体的分子表征，并实现潜在亚群的区分。

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多路复用表面等离子体共振成像芯片上的多模态分析平台，用于分析细胞外囊泡亚群

我们开发了一种用于微尺度细胞刺激实验的自动化细胞培养与检测平台。该平台在培养和刺激少量细胞群体以及回收裂解液用于分子分析方面，具有操作简便、功能多样和控制精确的优点。该平台非常适合使用珍贵细胞和/或试剂的研究。...

一种用于微尺度细胞刺激实验的多功能自动化平台

我们展示了一种集成表面电极网络的微流控平台，该平台结合了电阻脉冲传感（RPS）与码分多址（CDMA）技术，可实现多个微流控通道中颗粒的多重检测与尺寸测量。...

用于颗粒空间追踪的多路复用电子检测微流控平台

在本实验方案中，我们描述了从人全血中快速分离细胞外囊泡并通过基于荧光的纳米颗粒追踪分析对特定标志物进行表征的完整流程。所展示的结果具有高度可重复性，且该方法可调整用于细胞培养上清液的分析。...

基于纳米颗粒示踪分析的单个细胞外囊泡在人血中快速荧光表征

本方案描述了一种可重复的方法，专为使用细胞培养上清液检测小细胞外囊泡（EV）表面表位而设计。该方法利用与识别表面抗原CD9、CD63和CD81的抗体偶联的磁珠，对EV进行特异性免疫沉淀。本方法已针对后续的流式细胞术分析进行了优化。...

细胞条件培养基中外泌体的流式细胞术分析

外泌体来源的疾病及恶性细胞生物标志物在临床转化中受到缺乏快速且准确定量方法的限制。本报告描述了利用低倍暗场显微镜图像对外泌体特定亚型在少量血清或血浆样本中进行定量分析的方法。...

利用纳米等离子体增强散射与低倍显微镜成像定量肿瘤来源的外泌体

细胞外囊泡（EVs）在细胞生物学和细胞间通讯中发挥重要作用。目前亟需实用的检测方法来可视化并定量分析细胞对EVs的摄取。本实验方案提出利用三维荧光成像技术进行EVs摄取检测。 通过 共聚焦显微镜，继以基于纳米过滤的微流控装置分离细胞外囊泡。...

细胞外囊泡摄取实验 通过 共聚焦显微镜成像分析

最新一代的细胞外囊泡（EV）表征工具能够同时对单个EV的多个参数进行分析。纳米流式细胞术可对大于45...

单个细胞外囊泡跨膜蛋白的纳米流式检测表征

本文展示了从人体受试者的生物液体（如泪液和唾液）中收集的细胞外囊泡（EVs）的表征方法。该方法所使用的扫描仪能够检测仅1...

表征生物体液中的细胞外囊泡

本文介绍了一种利用无标记表面增强拉曼光谱法（SERS）分析单个小细胞外囊泡（sEVs）的实验方案，该方法可实现疾病无创诊断，并评估sEVs作为治疗递送载体的应用潜力。...

探索基于表面增强拉曼散射的单个sEV生物传感在疾病诊断与治疗中的应用

分析型超速离心机（AUC）样品池用于盛装样品和参考缓冲液，在实验过程中暴露于高真空环境，并以高达 60,000 rpm 的转子速度运行。本视频将演示组装、加样和校准这一 AUC...

分析型超速离心机样品池的组装、装载与校准

学习多路复用表面等离子体共振成像技术，用于细胞外囊泡亚群的多模态分析。该方法结合原子力显微镜和拉曼光谱，实现无标记实时检测，为生物标志物研究和药物递送应用提供可靠工具。

基于多重表面等离子体共振成像芯片的多模态分析平台用于细胞外囊泡亚群分析

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