Name: 基于外膜囊泡显示SARS-CoV-2受体结合域的即插即用纳米颗粒疫苗平台 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: 学习外膜囊泡生物工程技术，用于开发"即插即用"纳米颗粒疫苗平台展示SARS-CoV-2受体结合域。该方法通过生物偶联技术增强抗原特异性免疫应答，为疫苗研发提供新策略。

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本工作得到重庆市自然科学基金重点项目（编号：cstc2020jcyj-zdxmX0027）和国家自然科学基金项目（编号：31670936，82041045）的资助。

1. 质粒构建
<ol>
	<li>将编码 SpyCatcher 序列的 DNA（补充文件 1）插入氨苄青霉素抗性的 pThioHisA-ClyA 质粒（参见材料表）的 BamH I 和 Sal I 位点之间，参照先前发表的文献20构建质粒 pThioHisA ClyA-SC。</li>
	<li>将合成的 SpyTag-RBD-Histag 融合基因（补充文件 1）连接至 pcDNA3.1 质粒（参见材料表）的 BamH I 和 EcoR I 位点之间，参照先前发表的文献19构建质粒 pcDNA3.1 RBD-ST。</li>
</ol>
2. OMV-SC 的制备
<ol>
	<li>按照以下步骤进行ClyA-SC转化。
	<ol>
		<li>将5 µL pThioHisA ClyA-SC质粒溶液（50 ng/µL）加入50 µL BL21感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置30 min。</li>
		<li>将混合液置于42 °C水浴中90 s，然后立即放回冰上冷却3 min。</li>
		<li>向菌液中加入500 µL LB培养基，混匀后于37 °C、220 rpm条件下培养1 h。</li>
		<li>将全部转化产物涂布于含氨苄青霉素（100 µg/mL，参见材料表）的LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。 
		注意：在后续实验中，培养基中的氨苄青霉素浓度应保持一致。若未保持该浓度，可能导致细菌丢失质粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行OMV-SC的制备，执行以下步骤。
	<ol>
		<li>从平板（步骤2.1.4）挑取单菌落接种至20 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，于37 °C、220 rpm条件下过夜培养。</li>
		<li>将上述菌液（来自步骤2.2.1）接种至2 L培养基中，于37 °C、220 rpm条件下培养5 h，直至进入对数生长期（OD600nm在0.6至0.8之间）。</li>
		<li>当菌液在600 nm处的OD值达到0.6–0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG，参见材料表），使终浓度为0.5 mM，随后于25 °C、220 rpm条件下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行OMV-SC的纯化。
	<ol>
		<li>在4 °C条件下，以7,000 × g离心菌液30 min。</li>
		<li>用0.22 µm膜过滤上清液，然后使用100 kD超滤膜或中空纤维柱（参见材料表）进行浓缩。</li>
		<li>将浓缩液再次经0.22 µm膜过滤，随后在4 °C条件下，使用超速离心机以150,000 × g离心2 h（参见材料表），弃去上清液。</li>
		<li>用PBS重悬沉淀物，并于−80 °C保存。该溶液在−80 °C下可长期保持稳定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. RBD-ST 的制备
<ol>
	<li>按照以下步骤进行 RBD-ST 转染。
	<ol>
		<li>选择合适的真核表达系统（例如 HEK293F），复苏后在 37 °C、130 rpm 条件下培养过夜。</li>
		<li>取 20 µL HEK293F 细胞溶液加入自动细胞计数仪（见材料表），记录细胞数量，调整浓度至 1 × 106 个细胞/mL，然后在 37 °C、130 rpm 条件下培养 4 小时。</li>
		<li>将 RBD-ST 质粒经 0.22 µm 滤膜过滤后，加入 300 µg 质粒至细胞培养基中（见材料表），定容至 10 mL，振荡 10 秒。</li>
		<li>将 PEI（1 mg/mL，见材料表）在水浴中加热至 65 °C，取 0.7 mL PEI 与 9.3 mL 细胞培养基混合，间歇振荡 10 秒。 
		注意：不要剧烈振荡，否则产生的气泡可能影响转染效率。</li>
		<li>将质粒溶液加入 PEI 溶液中，间歇振荡混合 10 秒，37 °C 孵育 15 分钟。</li>
		<li>将上述混合液加入 280 mL 细胞培养基中，在 37 °C、130 rpm 条件下培养 5 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行 RBD-ST 纯化。
	<ol>
		<li>在 25 °C、6,000 × g 条件下离心细胞 20 分钟，用移液器收集上清液。</li>
		<li>用 2 mL Ni-NTA 琼脂糖（见材料表）装柱，并用 3× PBS 洗柱 3 次。</li>
		<li>向细胞上清液中加入咪唑（见材料表），使终浓度为 20 mM，上样 2 次。</li>
		<li>用含 20 mM 咪唑的 PBS 缓冲液洗涤 3 个柱体积（CV），并收集洗涤液。</li>
		<li>用含咪唑浓度由低至高（例如 0.3 M、0.4 M、0.5 M）的 PBS 缓冲液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱 2 次，每次 3 个柱体积。</li>
		<li>采用 SDS-PAGE21 鉴定不同浓度梯度中的 RBD-ST。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. OMV-RBD 生物偶联与纯化
<ol>
	<li>采用BCA法测定蛋白质浓度（参见 材料表).
	<ol>
		<li>将标准BSA蛋白溶液从2 mg/mL逐级稀释至0.0625 mg/mL，将纯化的OMV-SC和RBD-ST稀释10倍，然后按50:1（v/v）的比例混合BCA工作液A和B（试剂盒中提供）。</li>
		<li>加入稀释的蛋白溶液（25 µL/孔），与BCA工作液（200 µL/孔）混合；37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>在562 nm处测定每孔的吸光度（OD），并根据标准曲线计算蛋白浓度22.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤对OMV-SC和RBD-ST进行生物偶联。
	<ol>
		<li>将OMV-SC与RBD-ST按40:1（w/w）的比例在PBS中混合。</li>
		<li>在4 °C、15 rpm条件下垂直旋转过夜以混匀混合物。 
		注意：不同抗原的反应比例可能不同。可根据抗原的特性尝试不同的反应比例。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>验证反应效率。
	<ol>
		<li>制备10 µL的OMV-SC、RBD-ST及反应产物（步骤4.2）。加入2.5 µL的5x上样缓冲液（参见 材料表），在100 °C下加热样品5分钟。将样品加入凝胶孔中（每孔10 µL）。以60 V电泳20分钟，然后改为120 V电泳1小时。</li>
		<li>将蛋白质从凝胶转移至PVDF印迹膜（参见 材料表在100 V电压下电泳70分钟。</li>
		<li>将膜放入5%脱脂奶粉/TBST中，摇动孵育1小时。随后，用TBST洗涤3次，每次5分钟，摇动洗涤。</li>
		<li>将膜放入 0.1% His-Tag 抗体/TBST 中（参见 材料表）振荡孵育1小时，随后用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>将膜放入0.02%抗小鼠IgG1抗体（HRP）/TBST中（参见 材料表）振荡孵育40分钟，随后用TBST缓冲液振荡洗涤3次，每次5分钟。</li>
		<li>加入增强型化学发光溶液（参见 材料表）并曝光膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行OMV-RBD的纯化。
	<ol>
		<li>将1 mL反应后的OMV-RBD溶液稀释至10 mL，然后在150,000 x g 4 °C 下孵育 2 小时。</li>
		<li>使用移液器弃去上清液，并用10 mL PBS重悬沉淀物。将悬液在150,000 x g 4 °C 下孵育 2 小时。</li>
		<li>弃去上清液，用1 mL PBS重悬沉淀。 
		&#8203;注意：如果抗原的溶解度低得多，可通过尺寸排阻色谱实现相同的分离效果19.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 表征
<ol>
	<li>进行动态光散射（DLS）。
	<ol>
		<li>将样品稀释至 100 µg/mL 浓度，并向样品池中加入 1 mL 样品。</li>
		<li>选择 &#34;Size&#34; 作为 &#34;Measurement type&#34;，&#34;Protein&#34; 作为 &#34;Sample material&#34;，&#34;Water&#34; 作为 &#34;Dispersant&#34;，&#34;25 °C&#34; 作为 &#34;Temperature&#34;，然后加载样品并自动测量23。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用透射电子显微镜（TEM）拍摄图像。
	<ol>
		<li>将样品稀释至 100 µg/mL。取一个 200 目铜网，加入 20 µL 样品，静置吸附 10 分钟。</li>
		<li>用滤纸吸去溶液，向支持膜上加入 20 µL 3% 醋酸铀酰溶液，染色 30 秒。</li>
		<li>吸去醋酸铀酰溶液，在室温下自然干燥 1 小时。</li>
		<li>将样品载入 TEM 系统（参见 Table of Materials），在 80 kV 下拍摄图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+as+a+platform+for+biomedical+applications%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles as a platform for biomedical applications: An update.</a> Journal of Controlled Release. 323, 253-268 (2020).</li>
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<li>Zanella, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-minimized+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli+as+a+generalized+vaccine+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (4), 12066(2021).</li>
<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncating+the+structure+of+lipopolysaccharide+in+Escherichia+coli+can+effectively+improve+poly-3-hydroxybutyrate+production%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Truncating the structure of lipopolysaccharide in Escherichia coli can effectively improve poly-3-hydroxybutyrate production.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1201-1215 (2020).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+from+flagellin-deficient+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+induce+cross-reactive+immunity+and+provide+cross-protection+against+heterologous+Salmonella+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles from flagellin-deficient Salmonella enterica serovar Typhimurium induce cross-reactive immunity and provide cross-protection against heterologous Salmonella challenge.</a> Scientific Reports. 6, 34776(2016).</li>
<li>Balhuizen, M. D., Veldhuizen, E. J. A., Haagsman, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicle+induction+and+isolation+for+vaccine+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicle induction and isolation for vaccine development.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 629090(2021).</li>
<li>Hua, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+immunomodulator+delivery+platform+based+on+bacterial+biomimetic+vesicles+for+enhanced+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">A novel immunomodulator delivery platform based on bacterial biomimetic vesicles for enhanced antitumor immunity.</a> Advanced Materials. 33 (43), 2103923(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了构建一种&#34;即插即用型&#34;纳米颗粒疫苗平台，将SC融合的ClyA蛋白在BL21(DE3)菌株中进行表达，该菌株因其在蛋白表达方面的优势而成为重组蛋白生产中最广泛使用的模型之一24，从而可在细菌增殖过程中使足够数量的SC片段展示于OMVs表面。同时，制备了ST融合的目标抗原，用于抗原与OMVs之间的化学偶联。该实验方案的优势及未来应用前景主要体现在三个方面：第一，实现了不同抗原与生物纳米颗粒之间的&#34;即插即用&#34;系统，反应与纯化过程快速简便，在应对突发传染病等场景的疫苗开发中具有显著优势；第二，实现了抗原的高密度展示，为某些免疫原性较低的抗原提供了有效的疫苗设计策略；第三，OMVs与RBD（抗原蛋白）的分别表达有利于保持抗原的高活性，因为传统的原核表达系统缺乏特定辅因子、分子伴侣以及翻译后修饰等功能，可能导致蛋白失活或错误折叠。
在质粒构建过程中，选择ClyA作为与SC连接的靶标，主要是由于ClyA的C末端具有较为松散的桶状结构。研究表明，血红蛋白蛋白酶（Hbp）自转运蛋白能够展示来自Streptoc...

作为一种潜在的疫苗平台，外膜囊泡（OMVs）近年来受到越来越多的关注1,2。OMVs 主要由革兰氏阴性菌自然分泌3，是由脂质双层构成的球形纳米级颗粒，通常大小为 20–300 nm4。OMVs 含有多种亲本细菌成分，包括细菌抗原和病原体相关分子模式（PAMPs），这些成分可作为强效的免疫增强剂5。得益于其独特的成分、天然囊泡结构以及丰富的基因工程改造位点，OMVs 已被开发应用于多种生物医学领域，包括细菌疫苗6、佐剂7、癌症免疫治疗药物8、药物递送载体9以及抗细菌黏附剂10。
自2020年以来，SARS-CoV-2大流行已蔓延全球，对全球社会造成了严重冲击。刺突蛋白（S蛋白）中的受体结合域（RBD）可与人血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，从而介导病毒进入细胞11,12,13。因此，RBD似乎是疫苗研发的主要靶点14,15,16。然而，单体形式的RBD免疫原性较弱，且其分子量较小，难以被免疫系统识别，因此通常需要佐剂17。
为了提高RBD的免疫原性，构建了展示多价RBD的细菌外膜囊泡（OMV）。目前利用OMV展示RBD的研究通常将RBD与OMV融合并在细菌中表达18。然而，RBD是一种病毒来源的蛋白，原核表达可能影响其活性。为解决这一问题，采用来源于Streptococcus pyogenes的SpyTag（ST）/SpyCatcher（SC）系统，在常规缓冲体系中使OMV与RBD之间形成共价异肽键19。SC结构域通过基因工程改造的Escherichia coli以Cytolysin A（ClyA）融合蛋白的形式表达，ST则通过HEK293F细胞表达系统与RBD共同表达。将OMV-SC与RBD-ST混合后过夜孵育，再经超速离心或尺寸排阻色谱法（SEC）纯化，获得OMV-RBD。

<table><tbody><tr><td>氨苄青霉素钠</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610028</td><td></td></tr><tr><td>自动细胞计数仪</td><td>Countstar</td><td>BioTech</td><td></td></tr><tr><td>BCA蛋白定量试剂盒</td><td>cwbio</td><td>cw0014s</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Touch成像系统</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>动态光散射仪</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano S90</td><td></td></tr><tr><td>电泳装置</td><td>Cavoy</td><td>Power BV</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Buffers H 10X TBST缓冲液</td><td>Sangon Biotech</td><td>C520009</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG1多克隆抗体</td><td>Abcam</td><td>ab97240</td><td></td></tr><tr><td>高速冷冻离心机</td><td>Bioridge</td><td>H2500R</td><td></td></tr><tr><td>His标签小鼠单克隆抗体</td><td>Cell signaling technology</td><td>2366s</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600277</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600118</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA His-Bind Superflow</td><td>Qiagen</td><td>70691</td><td></td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>OPM-293细胞培养基</td><td>Opm biosciences</td><td>81075-001</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1 RBD-ST质粒</td><td>Wuhan genecreat biological techenology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>ZSGB-bio</td><td>ZLI-9061</td><td></td></tr><tr><td>线性聚乙烯亚胺</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>预染蛋白Marker</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>pThioHisA ClyA-SC质粒</td><td>Wuhan genecreat biological techenology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVDF Western印迹膜</td><td>Roche</td><td>03010040001</td><td></td></tr><tr><td>Quixstand台式系统（100 kD中空纤维柱）</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE上样缓冲液（5x）</td><td>Beyotime</td><td>P0015</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS（增强型化学发光溶液）</td><td>Thermo</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>悬浮仪</td><td>Life Technology</td><td>Hula Mixer</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜</td><td>Hitachi</td><td>HT7800</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Oxoid</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman coulter</td><td>XPN-100</td><td></td></tr><tr><td>紫外分光光度计</td><td>Hitachi</td><td>U-3900</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610961</td><td></td></tr></tbody></table>

基于展示sars-cov-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

A "Plug-And-Display" Nanoparticle Vaccine Platform Based on Outer Membrane Vesicles Displaying SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain

由细菌或病毒获得的仿生纳米颗粒在疫苗研究与开发中引起了广泛关注。外膜囊泡（OMVs）主要由革兰氏阴性菌在正常生长过程中分泌，具有纳米级直径和自佐剂活性，可能非常适合作为疫苗递送载体。OMVs 已被用作蛋白质、核酸和小分子的多功能递送系统。为了充分利用 OMVs 的生物学特性，本研究采用经生物工程改造的 Escherichia coli-来源&#160;OMVs 作为载体，并以 SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）作为抗原，构建了一种“即插即显”&#34;（Plug-and-Display&#34;）疫苗平台。利用化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）中的 SpyCatcher（SC）和 SpyTag（ST）结构域实现 OMVs 与 RBD 的偶联。质粒转染后，Cytolysin A（ClyA）基因与 SC 基因翻译为融合蛋白，从而在 OMVs 表面暴露出反应性位点。将 RBD-ST 在常规缓冲体系中与 OMVs 混合过夜后，OMVs 与 RBD 之间形成共价结合，从而获得一种多价展示的 OMV 疫苗。通过替换不同的抗原，该 OMV 疫苗平台可高效展示多种异源抗原，有望快速应对传染病疫情。本实验方案详细描述了构建 OMV 疫苗平台的精确方法，包括 OMV 的制备、纯化、生物偶联及表征。

本方案的流程图见图1。该方案可作为利用OMVs作为疫苗平台的通用方法；只需根据抗原类型选择合适的表达系统即可。
图2 提供了一种可行的质粒设计策略。SC基因通过一个柔性连接子与ClyA基因相连，而ST则在RBD基因的5'端连接了一个用于纯化和验证的His标签基因。Western blot结果显示，随着OMV-SC的增加，反应逐渐趋于完全（图3A）。经过超速离心后，几乎所有未反应的RBD-ST均保留在上清液中。第二次超速离心并未比第一次带来显著的进一步提升（图3B）。
通过DLS测定颗粒尺寸分布（图4）。OMV-SC的Z平均水动力学直径为133 nm，而OMV-RBD为152.6 nm（表1）。这些差...

本方案描述了外膜囊泡的生物工程化，以构建“即插即用”型疫苗平台，包括其制备、纯化、生物偶联及表征。

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

由细菌或病毒获得的仿生纳米颗粒在疫苗研究与开发中已引起广泛关注。外膜……

纳米科学可通过将抗原展示在载体表面，有效增强抗原特异性免疫反应。该疫苗平台的主要优势在于能够实现抗原的脱离与展示。换句话说，该平台能够展示多种抗原。此方法也可应用于其他生物纳米颗粒，以实现向纳米级载体的抗原展示。进行Cytolysin A Spy导管转化时，首先向50微升BL21感受态菌株中加入5微升质粒溶液。轻轻吹打后，在冰上冷却30分钟。将溶液置于42摄氏度水浴中90秒，然后立即转移到冰上孵育3分钟。向细菌悬液中加入500 µL LB（Luria Bertani）培养基，混匀后于37摄氏度、220 rpm条件下培养1小时。接下来，将所有转化产物接种到含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上，并在37摄氏度下过夜培养。对于OMV SpyCatcher的生产，首先从平板上挑取单菌落接种至20毫升LB培养基中，在37摄氏度、220转/分钟的条件下过夜培养。将菌液转接至2升培养基中，在37摄氏度、220转/分钟的条件下继续培养5小时，直至达到对数生长期。加入异丙基-β-D-异硫氰酸酯（IPTG），使细菌溶液的终浓度为 0.5 毫摩尔，并在 25 摄氏度、220 转/分钟条件下过夜培养。接着进行 OMV spycatcher 纯化。首先将细菌溶液进行离心。用 0.22 微米膜过滤器过滤上清液，然后使用中空纤维柱进行浓缩。将浓缩液通过 0.22 微米膜过滤器再次过滤，随后在 4 摄氏度条件下以 150,000 ×g 离心 2 小时，使用超速离心机去除上清液。用 PBS 重悬沉淀物，并于 -80 摄氏度保存。进行RBD spytag转染时，首先选择合适的真核表达系统，在复苏后于37摄氏度、130转/分钟条件下培养细胞过夜。取20微升HEK 293F细胞溶液加入自动细胞计数仪中，记录细胞数量，并将浓度调整至每毫升1×10⁶个细胞。然后在37摄氏度、130转/分钟的条件下培养细胞4小时。将RBD spy tag质粒通过0.22微米膜过滤器过滤，并向细胞培养基中加入300微克质粒，直至终体积为10毫升。振荡10秒。将PEI在水浴中加热至65摄氏度。取0.7毫升PEI与9.3毫升细胞培养基混合，间歇震荡10秒。将质粒溶液加入PEI溶液中。间歇振荡混合物10秒，于37°C孵育15分钟。将混合物加入280毫升细胞培养基中，在37°C、130转/分钟条件下培养5天。随后进行RBD spytag纯化。以6,000 × g在25°C下离心细胞20分钟，然后用移液器收集上清液。用2毫升镍-NTA琼脂糖填充层析柱，并用PBS洗涤三次。向细胞上清液中加入咪唑，使其终浓度为20 mmol/L，然后将细胞上清液上样至层析柱中。加入三倍柱体积含 20 毫摩尔咪唑的 PBS 进行洗涤，并收集洗涤组分。用三倍柱体积含低至高浓度咪唑的 PBS 进行梯度洗脱，每个浓度洗脱两次。采用 BCA 法测定蛋白浓度时，将标准 BSA 蛋白溶液从 2 毫克/毫升至 0.0625 毫克/毫升进行系列稀释，将纯化的 OMV spycatcher 和 RBD spy tag 样品各稀释 10 倍。然后按50:1的比例混合BCA工作液A和B。加入稀释后的蛋白质溶液，并与BCA工作液混匀。37摄氏度孵育30分钟。测定每个孔在562纳米处的吸光度，并根据标准曲线计算蛋白质浓度。为进行OMV spycatcher与RBD spy tag的生物偶联，将OMV spycatcher、RBD spytag和PBS按40:1的比例混合。在4摄氏度下，以每分钟15转的速度垂直旋转混合物过夜。使用 PBS 溶液通过类似于 OMV spycatcher 纯化的方法对 OMV RBD 进行纯化。质粒设计示意图显示，spycatcher 基因通过柔性连接子与 clyA 基因相连，而 spytag 则通过一个用于纯化和验证的 hys tag 基因连接至 RBD 基因的 5' 末端。超速离心后，几乎所有未反应的 RBD spytag 均保留在上清液中。第二次超速离心并未比第一次带来进一步的显著优势。OMV spycatcher 的 z 平均流体动力学直径为 133 纳米，而 OMV-RBD 为 152.6 纳米。这些差异可能是由于 RBD 在大量展示后增加了 OMV 颗粒的尺寸。透射电子显微镜（TEM）的结果与动态光散射（DLS）测得的粒径分布结果一致。混合物搅拌时的旋转操作至关重要。若不进行旋转，反应效率可能会显著降低。

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基于外膜囊泡显示SARS-CoV-2受体结合域的"即插即用"纳米颗粒疫苗平台

本方案描述了研究基于重组受体结合域（RBD）的SARS亚单位疫苗的一般步骤。内容包括在293T细胞中转染和表达RBD蛋白的方法、用RBD免疫小鼠，以及利用已建立的SARS假病毒中和实验检测小鼠血清的中和活性。...

基于重组RBD的SARS疫苗方案：蛋白制备、动物免疫与中和检测

本视频展示了一种制备可展示多种抗原的外膜囊泡（OMV）疫苗的方法。首先，转染哺乳动物细胞，使其表达并分泌与SpyTag及多聚组氨酸标签融合的病毒抗原。随后，利用镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析柱纯化这些抗原。将纯化后的抗原与表面表达SpyCatcher（SC）蛋白的外膜囊泡混合。多个抗原通过其SpyTag（ST）与SpyCatcher发生共价结合，从而在OMV表面展示抗原，形成多价疫苗。...

生成多价展示外膜囊泡疫苗

我们已将戊型肝炎病毒的衣壳蛋白设计为一种诊疗一体化的纳米颗粒（HEVNP）。HEVNP 在黏膜递送过程中可自组装成稳定的二十面体笼状结构。本文描述了通过将表面暴露的残基突变为半胱氨酸，从而对 HEVNP...

利用化学偶联方法对戊型肝炎病毒纳米颗粒进行表面功能化

本文介绍了一种在BSL-2条件下生成假病毒颗粒的实验方案，该假病毒颗粒携带高致病性病毒——中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒的刺突蛋白。这些假病毒颗粒含有荧光素酶报告基因，可用于定量检测病毒进入靶宿主细胞的过程。...

在生物安全二级条件下制备假病毒颗粒以研究高致病性冠状病毒

本文提供了一种详细的方法，用于自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的纯化、复性及表征，以应用于疫苗开发。...

E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

本文介绍了一种用于检测抗原展示型病毒样颗粒（VLPs）上中和表位的实验方案。利用与蛋白G偶联磁珠结合的包膜糖蛋白特异性单克隆抗体，对来源于人类免疫缺陷病毒（HIV）的VLPs进行免疫沉淀。捕获的VLPs随后通过SDS-PAGE分离，并使用针对病毒核心蛋白Gag的特异性抗体进行Western印迹分析。...

利用捕获法检测基于病毒样颗粒（VLP）疫苗中抗原的中和敏感性表位

在本方案中，与重组 SARS-CoV-2 刺突蛋白结合的量子点可用于基于细胞的检测，以监测刺突蛋白在质膜上与 hACE2...

高通量共聚焦成像技术观察量子点标记的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞过程

本方案介绍了用于 SPR 结合分析的新工具，以研究 CV-N 与 HA、S 糖蛋白、相关杂合型聚糖以及高甘露糖寡糖的结合。SPR 用于测定二聚体或单体 CV-N 与这些聚糖结合的 KD...

设计抗病毒药物 通过 表面等离子体共振

本文介绍了一种新开发的多重荧光免疫测定法，该方法利用双报告系统流式细胞术，同时检测完整严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）病毒颗粒上的两个独特刺突蛋白表位，这些病毒颗粒已被血管紧张素转换酶2偶联的磁性微球捕获。...

通过多重双报告基因策略对病毒颗粒表面蛋白表位进行分析

我们提出了一种优化的体外（in...

生产一种SARS-CoV-2病毒样颗粒系统以在体外研究病毒生命周期 In Vitro

本文介绍了利用荧光素酶报告系统制备SARS-CoV-2假病毒颗粒的方法及其在筛选病毒进入抑制剂中的应用。本方案以两种不同的进入抑制剂为例进行演示：重组人ACE2-Fc融合蛋白和小分子化合物阿比多尔。...

使用基于MLV的假病毒鉴定SARS-CoV-2进入抑制剂作为潜在抗病毒药物的实验方案

学习外膜囊泡生物工程技术，用于开发"即插即用"纳米颗粒疫苗平台展示SARS-CoV-2受体结合域。该方法通过生物偶联技术增强抗原特异性免疫应答，为疫苗研发提供新策略。

基于展示SARS-CoV-2受体结合域的外膜囊泡的“即插即用”纳米颗粒疫苗平台

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