Name: 使用氧化氘定量测定棕色脂肪组织中 从头 脂肪酸合成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 了解使用氧化氘和GCMS定量测定棕色脂肪组织中脂肪酸从头合成的方法。该技术可非侵入性评估代谢状态，适用于小鼠模型中多种组织的脂质代谢研究。

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我们感谢Sanchez-Gurmaches和Wallace实验室成员的宝贵讨论。本工作获得了美国心脏协会（18CDA34080527授予JSG，19POST34380545授予RM）、美国国立卫生研究院（NIH R21OD031907授予JSG）、辛辛那提儿童医院医疗中心（CCHMC）董事会奖、CCHMC儿科基因组学中心奖以及CCHMC孟德尔基因组学中心的资助。 &amp;#38; 治疗学奖。本工作部分由辛辛那提消化系统疾病研究中心核心设施 NIH P30 DK078392 项目资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。RT 和 MW 获都柏林大学学院 Ad Astra 博士后奖学金支持。

所有实验均经辛辛那提儿童医院医疗中心机构动物照护与使用委员会批准。
1. D2O的制备
注意：为避免实验误差，需为所有小鼠在整个实验期间准备充足的溶液或饮用水。
<ol>
	<li>用于腹腔注射：制备0.9% w/v的生理盐水D2O，通过将每升D中溶解9 g NaCl2O. 通过无热原的过滤器过滤 0.2 &#181;m 过滤除菌。</li>
	<li>用于饮用2O-水：制备8% v/v D2将80 mL的D与O-富集水混合，作为饮用水使用2O 型血920 mL普通饮用水。普通饮用水可从小鼠饲养设施获取。通过无热原的滤器过滤 0.2 &#181;m 过滤除菌。</li>
</ol>
2. 温度适应对棕色脂肪组织活性的调节
<ol>
	<li>在开始温度适应前两周，将小鼠分笼饲养，每笼两只。将小鼠的饮水更换为水瓶供水，使其适应，并将所有笼盒维持在 22 °C 环境中。</li>
	<li>在开始温度适应前一周，设置小鼠环境培养箱的相应温度：30 °C 用于热中性环境，22 °C 用于室温，18 °C 用于冷暴露。</li>
	<li>在温度适应开始时，更换为无环境富集的新笼盒（以避免筑巢），并将笼盒转移至相应温度条件下。 
	注意：分配至热中性环境的笼盒将在 30 °C 下持续 4 周；分配至室温的笼盒将在 22 °C 下持续 4 周；分配至冷暴露的笼盒将按每周递减的方案逐步降温：第一周 18 °C，第二周 14 °C，第三周 10 °C，第四周 6 °C。</li>
	<li>每周定期更换所有条件下的脏污笼盒。同时，更换食物和水瓶，使用已在相应温度下预适应至少 24 小时的新瓶和新料。 
	注意：每周添加食物时需特别注意添加量，尤其是冷暴露组小鼠，其摄食量将显著高于正常条件。食物应自由供应（ad libitum）。</li>
</ol>
3. D&#8203;2O 给药
<ol>
	<li>向每只动物注射 0.9% w/v 生理盐水-D。2氧原子 35 &#181;L/g 按每公斤体重计算，于组织采集前12小时至3天给药， 通过 使用 1 mL 注射器和 26 G 针头进行腹腔注射。 
	注意：关于如何选择合适的标记时间，请参阅讨论部分以获取更多信息。</li>
	<li>将水瓶更换为装有8%体积比D的水瓶。2氧同位素富集饮用水。</li>
</ol>
4. 血浆和组织的采集、处理与保存
<ol>
	<li>实验结束时，采用批准的方法处死小鼠（例如，过量二氧化碳吸入后进行颈椎脱位）。
	<ol>
		<li>在实施安乐死前，使用加热/冷却垫或其他方法避免温度骤变，以免影响实验结果。按照批准的方法对小鼠实施安乐死，随后立即进行血液和组织采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用26 G针头经心脏穿刺采集血液，并收集至含乙二胺四乙酸（EDTA）的采血管中。将血液置于冰上，直至进一步处理。</li>
	<li>沿小鼠背部中线从胸腔下部至颈部上部切开皮肤，同时将皮肤向上提起，避免损伤皮下组织。肩胛间棕色脂肪组织（BAT）位于肩胛骨之间、一层白色脂肪组织下方，由两个呈金字塔形的叶组成。
	<ol>
		<li>用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织以去除杂质。用纸巾轻拍以除去多余液体，使用分析天平称重后，转移至微量离心管中。</li>
		<li>立即使用液氮对组织进行速冻。其他部位的棕色脂肪组织也可一并采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将血液样本在4 °C条件下以10,000 x g 离心10分钟。离心后，小心吸取血浆，避免扰动红细胞沉淀。将血浆转移至新的预冷微量离心管中，并用液氮速冻。</li>
	<li>将棕色脂肪组织和血浆样本储存于-80 °C，待后续使用。</li>
</ol>
5. 从脂肪组织中提取脂质
<ol>
	<li>提取开始前
	<ol>
		<li>在玻璃小瓶中用甲醇配制 1 mM 的十六碳烯酸-d31 溶液。这将作为内标脂肪酸。</li>
		<li>将所需量的氯仿 (CHCl3) 和甲醇 (CH3OH) 在 -80 °C 冰箱或干冰上预冷。 
		注：可在 CHCl3 中添加浓度为 0.01% w/v (2.5 mg/25 mL) 的抗氧化剂二叔丁基-4-甲基苯酚 (BHT)，以防止不饱和脂肪酸中的双键氧化。</li>
		<li>为每个组织样本预标记微量离心管，并额外标记一个管用于空白提取。 
		注意：CH3OH 和 CHCl3 具有高度挥发性，吸入有毒。仅在通风橱中使用。 
		注：不同品牌的微量离心管在背景棕榈酸酯水平以及防止溶剂泄漏的能力方面存在差异。建议首先测试多种类型的离心管，以确保能防止溶剂泄漏且管中污染性棕榈酸酯水平最低。更多讨论请参见 Yao 等人32。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样本从冰箱中取出，置于干冰上。</li>
	<li>将预标记的微量离心管置于分析天平上，并清零天平。将镊子和手术刀/钢制剃须刀片置于干冰上冷却 10-20 秒。
	<ol>
		<li>用镊子取出冷冻的组织样本，置于塑料称量舟中。称量舟可置于平整的干冰块或其他预冷表面上。</li>
		<li>使用手术刀或钢制剃须刀片，切取一小部分组织，重量相当于 5-15 mg。放入微量离心管中并记录精确重量。对每个样本重复此操作。此时样本可储存于冰箱中，或可继续执行以下步骤进行脂质提取。 
		注：确保手术刀在不同样本间用 70% 乙醇妥善清洁，且每个样本使用新的称量舟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个样本中加入 1 µL/mg 的 10 mM 十六碳烯酸-d31(C16:0-d31) 溶液。 
	注意：由于溶剂的吸入风险，以下步骤 (5.4 至 5.8) 应在通风橱内进行。</li>
	<li>向每个样本中加入 250 µL CH3OH、250 µL H2O 和 500 µL CHCl3，并放入三颗 5 mm 不锈钢研磨珠。将管置于预冷的研磨机模块中，以 25 Hz 的振动频率混合样本 5 分钟，或遵循制造商针对组织样本推荐的操作指南。使用磁铁移除研磨珠。</li>
	<li>在 4 °C 下，以 12,000 × g 离心样本 10 分钟。 
		注：离心后，应观察到清晰的两相分离，上层水相含有极性代谢物，下层有机相含有脂质和脂肪酸。若未见分离，则加入 250 µL H2O 并重复涡旋和离心步骤。</li>
	<li>使用微量移液器，从每个样本的底层相中吸取固定体积的液体，转移到相应标记的微量离心管中。</li>
	<li>向剩余样本中加入 500 µL CHCl3，并重复步骤 5.6-5.7。</li>
	<li>将样本置于氮气流下或置于耐 CHCl3 的冷藏离心真空浓缩仪中，在 4 °C 下直至完全干燥。干燥后的样本可储存于 -20 °C，直至准备进行衍生化。 
		注：此时也可收集每个样本的上层相，并按照步骤 5.9 进行干燥，以便分析极性代谢物。</li>
</ol>
6. 脂肪酸甲酯（FAMEs）的制备及气相色谱-质谱分析
<ol>
	<li>酸催化酯化与转酯化制备脂肪酸甲酯 
	警告：由于溶剂具有吸入风险，以下步骤应在通风橱内进行。
	<ol>
		<li>若样本已存放在冷冻柜中，需在氮气下干燥5分钟，以确保无水分残留。</li>
		<li>使用色谱纯溶剂，移取98 mL无水CH3将OH加入玻璃培养基瓶中。在通风橱中缓慢加入2 mL无水硫酸，配制成2% H2SO4 在 CH3OH。轻轻旋转封闭的瓶子进行混匀。</li>
		<li>添加 500 &#181;L 2% H2SO4 在 CH3向每个样品中加入OH溶液，并短暂涡旋。</li>
		<li>在加热块上孵育样品 50 &#176;C 2小时。</li>
		<li>从加热块中取出样品并加入 100 &#181;L 饱和 NaCl 溶液的 500 &#181;L 向每个样品中加入己烷。</li>
		<li>在室温下剧烈涡旋振荡样品1分钟。静置样品1分钟；此时应出现两相。</li>
		<li>将上层相收集到新的微量离心管中（关于微量离心管的适当选择，请参见第5.1.3节中的说明）。</li>
		<li>为最大化产量，重复步骤 6.1.5–6.1.7，将第二次样品收集至同一标记的试管中。</li>
		<li>在氮气环境下于室温下干燥样品。</li>
		<li>将样品重悬于 20 &#181;L/mg 六烷相对于原始组织重量的比例，并立即转移至带有玻璃插件的玻璃GC小瓶中。 
		注意：转移样品时应迅速操作，以尽量减少蒸发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气相色谱-质谱分析
	<ol>
		<li>为确定FAME同位素异构体的丰度，将样品注入单四极杆气相色谱-质谱联用仪（GCMS）进行分析。 
		注意：尽管可使用多种色谱柱类型检测棕榈酸，但以下温度程序是针对一种专为分离脂肪酸顺式/反式异构体而开发的气相色谱-质谱联用（GCMS）色谱柱所建立的，具体细节见下文 材料表该色谱柱长度为50 m，内径为0.25 mm。</li>
		<li>注射 1 &#181;L 分流/不分流进样口中的样品，在进样口温度为 270 &#176;C，使用氦气作为载气，流速为1 mL/min。对于低丰度脂肪酸，采用不分流进样，总流量为19 mL/min，隔垫吹扫为3 mL/min，在0.75 min时分流出口的吹扫流量为15 mL/min。对于棕榈酸和油酸等高丰度脂肪酸，采用10:1–40:1的分流比。</li>
		<li>使用以下烘箱参数：初始温度为 80 &#176;C；增加 20 &#176;C/分钟递增至 170 &#176;C；增加 1 &#176;C/分钟递增到 204 &#176;C；增加 20 &#176;C/分钟递增至 250 &#176;C；然后保持在 250 &#176;C 10 分钟。</li>
		<li>使用以下质谱选择性检测器（MSD）参数：电子轰击电离模式为70 eV，扫描范围为50–400 m/z，扫描速度为1,562 (u/s)，扫描频率为4.1 次/秒。使用一根传输线，温度设为 280 &#176;C，一种离子源位于 230 &#176;C，以及一个四极杆 150 &#176;C. 
		&#8203;注：也可使用其他色谱柱，但程序升温条件会有所不同。</li>
		<li>样品进样顺序：随机化样品的进样顺序，并在序列开始时至少注入两到三个正己烷空白样，序列中每五个样品后各注入两到三个正己烷空白样，序列结束时再注入两到三个正己烷空白样。</li>
		<li>使用仪器配套软件，或免费开源软件（如 Metabolite-Detector）33，以将离子整合到 表1 每种脂肪酸甲酯 
		注意：我们已标出覆盖 M1-M5 同位素异构体的离子 表1 我们已发现该标记时间窗口涵盖了氘掺入量。然而，如果需要，可能需扩大该窗口。 从头合成 通量显著更高和/或使用了更长的标记时间。</li>
		<li>利用每个整合离子的丰度生成质量同位素体分布，其中离子强度可转换为相对丰度，使得质量同位素体分布的总和等于一。请参见示例电子表格中的 补充文件. 
		注意：为了准确测定氘掺入量，必须对天然同位素丰度进行校正，以消除自然界中存在的其他同位素（如¹³C、¹⁵N、¹⁸O等）的影响。 13C, 15N，以及 2H. 此步骤通过应用 Fernandez 等人所述的校正矩阵来完成。34,35，且不能通过从标记代谢物的MID中减去未标记代谢物的MID来实现。实践中，我们推荐使用诸如fluxfix等免费软件36，polyMID37，或 IsoCor38 将原始数据转化为分数型质谱峰（fractional MIDs），并提供了脂肪酸合酶（FAS）甲酯化产物同位素校正的计算公式 表1.</li>
		<li>为确定存在的棕榈酸盐含量，请使用以下公式： 
		<img alt="公式 1" src="/files/ftp_upload/64219/64219eq1v2.png" style="margin: auto; height: 37px;" />&#160; 
		其中离子计数指所有棕榈酸同位素异构体积分的总和 表1 和 C16:0-d31 指内标十六碳烯酸-d31内标物与内源性棕榈酸形成分离的色谱峰。其他脂肪酸的相对丰度也可测定，但需使用脂肪酸特异性的同位素内标物（其质荷比位移需大于D所引起的位移）。2O结合）或外标标准曲线可能需要用于完全定量。使用空白提取样品确定背景棕榈酸含量，并从最终的组织数值中减去该值。</li>
		<li>根据以下公式计算棕榈酸的摩尔富集度（ME）： 
		<img alt="公式 2" src="/files/ftp_upload/64219/64219eq2v2.png" style="margin: auto; height: 65px;" /> 
		&#8203;其中 Mi 是棕榈酸同位素异构体的归一化分数丰度，n 是可能的棕榈酸同位素异构体的数量。例如，对于具有以下分数分布的棕榈酸分子：M1 = 0.25，M2 = 0.08，M3 = 0.02，其 ME 为：(0.025×1) + (0.08×2) + (0.02×3) = 0.245（参见 补充文件).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 通过丙酮氘交换法测定血浆样本以确定体内水的富集度
<ol>
	<li>反应
	<ol>
		<li>配制10种体积分数从0%至9%的重水（氘代水）标准品。</li>
		<li>配制5% v/v的丙酮/乙腈溶液，每份样品（包括步骤5.1.1中的标准品）预留4 µL。</li>
		<li>在已标记的防泄漏微量离心管中，分别加入10 µL各血浆样品或标准品、4 µL 10 M NaOH 和 4 µL 5%丙酮/乙腈溶液。每个样品设三个重复。</li>
		<li>用移液器轻轻混匀样品，室温孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>萃取
	<ol>
		<li>孵育结束后，向每个样品中加入450–550 mg Na2SO4。</li>
		<li>在通风橱中，向每根离心管中加入600 µL CHCl3，剧烈涡旋15秒。</li>
		<li>以300 × g离心2分钟。</li>
		<li>在通风橱中，将每份样品的上清液分别取三个80 µL等分试样，转移至带有玻璃插管并已标记的玻璃GCMS小瓶中，盖紧瓶盖。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GCMS分析
	<ol>
		<li>在色谱柱（30 m，0.25 mm内径，Agilent DB-35MS）上分离样品，并在连接的质谱仪上进行分析。
		<ol>
			<li>在不分流/分流进样口进样1 µL，分流比为40:1，氦气流速为1 mL/min，进样口温度为270 °C。</li>
			<li>采用以下程序升温参数：初始温度60 °C，以20 °C/min升至100 °C，再以50 °C/min升至220 °C，然后在220 °C保持1分钟。</li>
			<li>采用以下质谱选择性检测器（MSD）参数：电子轰击电离模式（70 eV），监测m/z为58和59的离子。传输线温度为280 °C，离子源温度为230 °C，四极杆温度为150 °C。 
			注：也可使用其他低流失、键合、交联、中等极性的色谱柱，但程序升温参数需相应调整。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置液体进样器程序，起始为CHCl3清洗，随后为样品的随机进样序列，每六份样品后插入额外的CHCl3清洗步骤。 
		注：若自动进样器使用丙酮作为针头清洗液，应更换为CHCl3或正己烷，并连续注入多个CHCl3空白样品，直至色谱图中不再出现丙酮的干扰峰。</li>
		<li>采用该方法时，丙酮峰在约1.25分钟处洗脱。积分数据后，按照步骤6.2.6–6.2.7计算丙酮富集的分数丰度，并根据表1中所示，调整分析包含m/z 58–60的峰。</li>
		<li>利用标准品绘制标准曲线，根据丙酮的分数富集度确定待测样品的体水富集百分比（p）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 体内 从头合成 脂质生成计算
<ol>
	<li>使用以下公式计算每个样本中由脂肪酸合酶（FAS）直接合成的新生脂肪酸（FNS）所占比例（即棕榈酸、奇数碳链脂肪酸和mmBCFA）： 
	<img alt="公式 3" src="/files/ftp_upload/64219/64219eq3v2.png" style="margin: auto; height: 45px;" /> 
	其中 ME 为棕榈酸分子的平均摩尔富集度（步骤 6.2.9），p 为相应血浆样本中水的氘富集度（步骤 7.3.4），N 为棕榈酸上可被氘取代的可交换氢原子数目。</li>
	<li>使用以下由 Lee 等人建立的公式确定 N 值31： 
	<img alt="公式 4" src="/files/ftp_upload/64219/64219eq4v2.png" style="margin: auto; height: 55px;" /></li>
	<li>通过以下方式确定新生脂肪酸的摩尔量（MNS）： 
	MNS = FNS × 总脂肪酸含量（nmol/mg 组织）。 
	注意：例如，若测得棕榈酸的摩尔富集度（ME）为 0.245，体内水的氘富集度（p）为 0.045，计算得到的 N 值为 22，则棕榈酸的分数合成率为 0.247。若组织中棕榈酸的含量为 2 mmol/mg，则新生棕榈酸的摩尔量为 0.494 mmol/mg（参见 补充文件）。</li>
</ol>

作者无任何披露事项。

理解复杂代谢通路之间的平衡与相互作用是揭示代谢相关疾病生物学基础不可或缺的一步。本文展示了一种无创且低成本的方法，用于检测代谢变化 从头合成 脂肪酸合成。该方法改编自先前已发表的方法，这些方法开发了用于估算的计算方式 从头合成 基于脂肪酸氘富集率的合成通量31 以及利用氘代丙酮交换法测定D的相对百分比2体液中的氧39近年来，我们采用此处所述方法，研究了脂肪组织库、脑、肝脏及肿瘤中多种脂肪酸合成的变化。9,22,40该方案包含若干关键步骤和可调整的环节，这些环节涉及整体实验设计以及本方法所采用的分析方法和计算方式。计算的替代方法 从头合成 稳定同位素示踪剂用于脂肪酸合成的研究也广泛应用，其中包括由Hellerstein等人开发的替代性质量同位素异构体分布分析（MIDA）方法。<sup ...

肥胖及相关代谢性疾病是一种危及当代及后代的全球性流行病1,2。尽管常被简化为能量摄入与消耗失衡的结果，但与肥胖相关的代谢紊乱实际上影响着大量由环境和内源性因素调控的代谢通路3。然而，在代谢紊乱动物模型中，仅有少数通路被常规检测。
例如，葡萄糖代谢通常通过葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验来测定，这可能得益于便携式葡萄糖监测仪使用的简便性4。全身体内葡萄糖和脂质氧化的相对速率也通常基于间接热量测定法测得的呼吸交换比进行估算5,6。然而，代谢的大多数其他方面并未被常规地进行功能性评估，这导致对代谢状态的解释不完整，并可能遗漏潜在的治疗选择。其中一个主要的代谢通路是新生脂质合成（de novo lipogenesis）。
从头脂质生成（de novo lipogenesis, DNL）是指由前体物质合成新的脂肪酸的过程。葡萄糖被认为是参与全身DNL的主要前体7，但其他前体如乙酸盐、果糖、乳酸和支链氨基酸也被证明在特定组织和条件下是重要的碳源8,9,10,11,12。DNL在维持代谢稳态中起关键作用，并对正常发育至关重要13。此外，DNL的异常改变与癌症14,15以及代谢性疾病16,17,18和心血管疾病19,20相关。
从头脂肪酸合成（DNL）途径由核心酶组分ATP柠檬酸裂解酶（ACLY）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC1/2）和脂肪酸合酶（FAS）组成，主要生成棕榈酸（一种16碳饱和脂肪酸）。然而，奇数链和支链脂肪酸也可在较低速率下生成9。延长酶和去饱和酶进一步修饰这些脂肪酸，产生多种多样的脂肪酸种类，可用于多种功能（如长期能量储存和调节膜流动性）。
DNL 酶系统表达受少数转录因子调控。迄今为止研究最为充分的包括固醇调节元件结合蛋白（SREBP）家族、碳水化合物反应元件结合蛋白（ChREBP）以及肝X受体（LXR）21,22,23,24,25,26。尽管这些因子在功能上存在明显的重叠，但已有研究报道其在不同细胞类型优势性、生理或病理条件下存在各自独立的调控机制21,22,27,28。
值得注意的是，针对从头脂肪生成（DNL）通路中特定步骤的多种抑制剂已被批准用于临床，或正处于多种疾病的临床前或临床研发阶段，包括肥胖、非酒精性脂肪性肝病/非酒精性脂肪性肝炎（NAFLD/NASH）以及心血管疾病29。这些研究进展凸显了DNL在健康与疾病中的重要意义。
近年来，定量评估方法的应用 从头合成 脂肪酸合成增加30最常用的方法是使用重同位素标记水（D2O），其中重标记的氢在合成过程中直接和间接地掺入酰基链中。 通过 NADPH、乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A等DNL底物氢原子的氘交换。尽管该方法正日益受到关注，但目前尚缺乏适用于该领域新手的公开详细实验方案。本文中，我们概述了一种定量评估 从头合成 使用 D 合成 FAS 产物2O 和气相色谱-质谱联用（GCMS），并采用 Lee 等人先前建立的计算方法31该方法用于测量 从头合成 脂肪酸的合成不依赖于碳源，该方法几乎可适用于任何小鼠模型中的任何组织以及任何外界干扰条件下。本文重点分析棕色脂肪组织（BAT），因其具有较高的从头脂肪生成（DNL）水平，并在维持代谢稳态中发挥关键作用。

<table><tbody><tr><td>4 mL 玻璃小瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 滤膜</td><td>Olympus Plastic</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>26G 带针头注射器</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Merck</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Merck</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>带隔垫的蓝色 GC 螺口盖</td><td>Agilent</td><td>5190-1599</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>重水</td><td>Sigma</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>二叔丁基-4-甲基苯酚 (BHT)&lt;br/&gt; Select FAME 气相色谱柱</td><td>Merck</td><td>B1378</td><td></td></tr><tr><td>二叔丁基-4-甲基苯酚 (BHT)&lt;br/&gt; Select FAME 气相色谱柱</td><td>Agilent</td><td>CP7419</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 采血管</td><td>Sarstedt</td><td>411395105</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>十六碳烯-d31 酸</td><td>Larodan</td><td>71-1631</td><td></td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Merck</td><td>34859</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Olympus Plastic</td><td>24-282</td><td></td></tr><tr><td>小鼠环境控制舱</td><td>Caron</td><td>Caron 7001-33</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>MP Biomedicals</td><td>194727</td><td></td></tr><tr><td>SafeLock 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>螺口棕色 GC 小瓶</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>Merck</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Merck</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>小瓶内插管</td><td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

定量测定 从头合成 利用重水研究棕色脂肪组织中的脂肪酸合成

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

脂肪酸合成是一条复杂且高度耗能的代谢通路，在调控全身代谢稳态及其他生理与病理过程中具有重要的功能作用。与其他关键代谢通路（如葡萄糖代谢）不同，脂肪酸合成功能通常未被常规评估，导致对代谢状态的解读不完整。此外，目前尚缺乏面向领域新手、公开可用的详细实验方案。本文介绍一种经济的定量方法，利用重水（deuterium oxide）结合气相色谱-质谱联用技术（GCMS），用于分析总脂肪酸 从头合成 棕色脂肪组织中的合成 体内该方法可独立于碳源来测量脂肪酸合酶产物的合成，几乎适用于任何小鼠模型中的任何组织以及任何外界干扰条件下的分析。本文提供了气相色谱-质谱联用（GCMS）的样品制备细节及后续计算方法。我们重点分析棕色脂肪，因其具有较高的 从头合成 脂肪酸合成及其在维持代谢稳态中的关键作用

根据 D2在步骤1所述的O剂量下，我们通常发现体内水的富集度范围为2.5%至6%，且体内水中的氘基线富集水平在1小时内迅速达到，并在整个研究期间保持稳定。 通过 8% 富集饮用水（图1）。连续稳态的体水富集是第6步计算中所采用的假设，因此我们建议在新的实验模型中对体水富集的动力学进行实验验证。
我们发现，其数量 从头合成 在室温下，相对于热中性条件下的棕色脂肪组织（BAT），合成脂肪酸的含量增加图2）。在热中性环境和室温下饲养3天后，小鼠棕色脂肪组织（BAT）中棕榈酸盐的同位素异构体质量分布2O 给药在室温下显示出更高的 M1 和 M2 氘代富集度图 2A）。这种低温富集现象不仅发生在棕榈酸盐中，也广泛存在于棕色脂肪组织（BAT）中的多种脂肪酸中。图2B）。在室温下，...

本文介绍了一种利用重水（deuterium oxide）和气相色谱-质谱联用技术（GCMS）分析总脂肪酸的经济型定量方法 从头合成 棕色脂肪组织中的脂质生成 体内.

脂肪酸合成是一条复杂且高度耗能的代谢途径，在调控全身代谢稳态中具有重要的功能作用。

与其他代谢途径（如葡萄糖代谢）不同，脂肪酸合成通常未被常规检测，导致对代谢状态的解释不完整。该方法的主要优势在于其相对无创性，并且相较于使用同位素标记的葡萄糖，它能更真实地反映脂肪酸合成通量，因为上游葡萄糖处理过程的变化可能会影响后者的结果。本文我们重点关注棕色脂肪组织，但该方法也可能适用于研究任何小鼠模型中的任何组织。首先，将样品置于干冰上。取预先标记好的微量离心管，放在分析天平上并归零。然后将镊子、手术刀或钢制剃刀刀片放在干冰上冷却10至20秒。用镊子将冻存的组织样本从管中取出，置于塑料称量皿上，塑料称量皿可放置在干冰块或其他预冷的平面上。使用解剖刀或钢制剃刀切取一小块组织，重量相当于 5 至 15 毫克，并将其放入微量离心管中。记录确切重量，并对每个样本重复此操作。每毫克样品中加入1微升10毫摩尔的十六烷酸D31，然后向每个样品中加入三颗直径5毫米的不锈钢珠。接着，向含珠的每个样品中加入250微升甲醇、250微升水和500微升氯仿。将试管置于研磨机的预冷金属块中，以25赫兹的振动频率混合样品5分钟。使用磁铁去除珠子，并在4°C下以12,000 G离心样品10分钟。用微量移液器吸取每个样品下相的固定体积，转移至相应标记的微量离心管中。向剩余样品中加入500微升氯仿，重复上述步骤。将含有合并下相的离心管置于氮气环境中，或置于耐氯仿的低温离心真空干燥仪中，在4摄氏度下保存直至完全干燥。用移液器将98毫升无水甲醇加入玻璃培养瓶中，然后在通风橱内缓慢加入2毫升无水硫酸，配制成含2%硫酸的甲醇溶液。轻轻旋转封闭的瓶子进行混匀。向每个样品中加入500 µL的2%硫酸甲醇溶液，并短暂涡旋。将样品置于50 °C的加热块上孵育2小时，然后向每个样品中加入100 µL饱和氯化钠溶液和500 µL正己烷。在室温下剧烈涡旋振荡样品1分钟，然后静置样品1分钟。此时应能明显看到两相。将上层相收集至新的微量离心管中。然后重复加入正己烷。相分离后，将第二次的上相样品收集到同一标记的试管中。在室温下用氮气干燥样品，并根据原始组织重量，按每毫克组织加入20微升正己烷重新悬浮样品。立即将样品转移至带有玻璃衬管的玻璃气相色谱小瓶中。将样品注入单四极杆气相色谱-质谱联用仪，以测定脂肪酸甲酯（FAMEs）同位素异构体的丰度。使用氦气作为载气，在270摄氏度的进样口温度下，将1微升样品注入分流或不分流进样口。在标记好的安全锁微型离心管中，分别加入10微升每种血浆样品或标准品、4微升10摩尔氢氧化钠以及4微升乙腈中5%丙酮溶液。每种样品均需做三个重复。将样品于室温孵育过夜后，向每个样品中加入450至550毫克硫酸钠，在通风橱中向每根离心管加入600微升氯仿，并剧烈涡旋震荡15秒。将样品在300 G条件下离心两分钟。取带有玻璃衬管的已标记玻璃GCMS小瓶，将每个样品的三份80微升上清液等分试样转移至小瓶中。盖紧瓶盖，用于GCMS分析。此处展示了小鼠血浆中D2O富集率在多个时间点的变化。研究发现，体内水的氘代富集水平在2.5%至6%范围内，基线水平的氘代富集在体内水中可在1小时内迅速达到，并在整个研究期间保持稳定。此处还展示了在室温和热中性条件下，连续三天给予D2O后，棕色脂肪组织中棕榈酸的质谱同位素分布情况。该结果表明，在室温下M1和M2的氘富集程度更高。本图展示了在室温和热中性条件下，给予D2O三天后，棕色脂肪组织及血浆中多种脂肪酸的摩尔富集度。在棕色脂肪组织中，较低温度下多种脂肪酸的富集更为广泛。值得注意的是，血浆总脂肪酸富集程度并不遵循棕色脂肪组织的变化趋势，反而在热中性条件下脂肪酸富集程度升高。这些图像显示了给予D2O三天后棕色脂肪组织中总脂肪酸丰度及新生合成的棕榈酸情况。结果显示，在室温条件下总棕榈酸的合成增加。使用气相色谱-质谱联用仪（GCMS）分析脂肪酸时需谨慎。确保棕榈酸（palmitate）不过载，否则可能导致同位素富集值出现假性升高。此外，在分析丙酮时，上样前应确认无背景丙酮峰存在，因此需先运行空白样品以去除系统中可能残留的丙酮。该方法可检测多种脂质类别中的总脂肪酸，但若要了解脂肪酸合成如何影响特定的脂质类别，可首先通过色谱法分离这些脂质类别，然后从各组分中提取脂肪酸。由于脂肪生成是正常发育的关键因素，同时也与多种疾病相关，因此该实验方案在多个研究领域中均具有应用价值。

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科研

JoVE Journal

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生物学

使用氧化氘定量测定棕色脂肪组织中 从头 脂肪酸合成

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结合间接热量测定法、红外热成像和血糖水平检测来测量人体棕色脂肪组织产热活性

前脂肪细胞从小鼠肩胛间棕色脂肪组织的基质血管组分中分离获得，并分化为能够积累脂滴、表达分子标志物并呈现成熟棕色脂肪细胞线粒体形态的细胞。这些细胞进一步通过免疫荧光和透射电子显微镜进行分析。...

从新生小鼠肩胛间脂肪组织基质血管组分中分化与成像棕色脂肪细胞

我们介绍一种针对脂肪细胞的高通量测序转座酶可及染色质分析（ATAC-seq）方案，该方法专门利用携带核荧光标记的转基因报告小鼠分离的脂肪组织，通过细胞核分选实现。...

使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性ATAC-Seq

本方案概述了在小鼠模型中利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行棕色脂肪组织优化的动静脉代谢组学研究的相关方法。这些方法有助于获取关于棕色脂肪组织介导的代谢物交换在整体机体水平上的宝贵信息。...

动静脉代谢组学用于测量棕色脂肪组织中的体内代谢物交换

利用低温裂解、尿素溶解、HILIC分级和IMAC富集磷酸化肽段的定量磷酸化实验方案描述。...

脂肪酸刺激下的定量磷酸化蛋白质组学 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

了解使用氧化氘和GCMS定量测定棕色脂肪组织中脂肪酸从头合成的方法。该技术可非侵入性评估代谢状态，适用于小鼠模型中多种组织的脂质代谢研究。

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