基于声流控微装置的细胞与细胞核压缩性测量

细胞力学在肿瘤转移、细胞恶性转化以及放射敏感性中起着重要作用。声流控方法可实现悬浮状态下细胞的快速、无损测量。该技术可用于反映上皮-间质转化过程中细胞自身压缩性的变化，并用于分离循环肿瘤细胞，展现出其在癌症诊断中的应用前景。

首先，使用直径为1毫米的空心针在PDMS块上打孔，以制备进样口和出样口，然后将PDMS块与芯片通过等离子体清洗仪进行键合。接着，将PDMS块和芯片背面朝上放入等离子体清洗仪中处理1分钟。随后，对准PDMS块上的孔与芯片的进样口和出样口，轻轻将PDMS块压在芯片上持续15秒，从而使PDMS块与芯片表面实现键合。

为了将PTFE导管连接到芯片上，截取两段内径为0.8毫米、长度为10厘米的导管。将一根内径为0.7毫米、长度为1.5厘米的不锈钢针弯成90度的L形，并将其连接到导管的一端。将不锈钢针插入PDMS块的孔中。

对于入口端，将一个19号规格的分配针连接到导管的另一端，作为注射器的连接头。随后注入去离子水，以检测整个通道的密封性。对于压电陶瓷组件，选择宽度为5毫米的预切割压电陶瓷片。

然后在一端将导线焊接在压电陶瓷的两侧。将一滴氰基丙烯酸酯胶水滴在压电陶瓷上，把压电陶瓷粘接到芯片背面的中央位置。用牙签将胶水抹平，并去除多余的胶水。

然后迅速将其压在芯片上，并持续按压约一分钟。安装微装置时，裁剪一块PDMS作为微装置的基底，使用双面胶带将基底的一侧粘附到进样口和出样口的PDMS模块上，另一侧粘附到透明玻璃载片上。将整个微装置固定在显微镜载物台上，以确保芯片处于同一焦平面上。

为制备聚苯乙烯标准颗粒溶液，将0.05毫升聚苯乙烯颗粒溶液加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并充分混匀。然后通过PBS洗涤90%融合度的贴壁细胞，制备细胞悬液。在室温下加入500微升0.25胰蛋白酶，作用1至2分钟。

消化液去除后，加入一毫升完全培养基，通过移液形成细胞悬液。随后以100 ×g离心五分钟。弃去上清液，并用0.5至一毫升磷酸盐缓冲液重悬，以获得细胞悬液。

然后用血细胞计数板对细胞进行计数，浓度约为每毫升30万至50万个细胞。按照先前所述方法制备细胞核悬液后，去除上清液，每20微升细胞沉淀加入200微升胞浆蛋白提取试剂A，充分混匀。随后将上述混合物在220 ×g条件下涡旋振荡5秒，并置于冰浴中10分钟。

接着，在孵育后的溶液中加入10 µL细胞质蛋白提取试剂B。涡旋混匀后，置于冰浴中1分钟，再于220 ×g条件下涡旋5秒。最后，在4 °C条件下，以1000 ×g离心5分钟。

弃去上清液，将沉淀物重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后在4°C条件下以1000 G离心4分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于100微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，制成细胞核悬液。

向上述细胞核悬液中加入台盼蓝，在室温下染色4分钟。接着，使用倒置显微镜和10倍物镜对细胞核数量进行计数。随后，用PBS缓冲液将上述细胞核悬液稀释至每毫升200,000到300,000个细胞核的浓度。

然后将细胞核悬液通过70微米的滤网过滤。设置测量系统时，打开显微镜的光源并启动相机软件。使用4倍物镜找到微通道的中心位置，即压电陶瓷的位置。

连接导线后，将其分别焊接至压电陶瓷信号发生器输出端的正负极。然后将注射器放置在显微注射泵上，并将其连接至进液导管。为收集微通道中的液体，在出液导管末端放置一个小容器。

为确定测量参数，使用注射器吸取聚苯乙烯微粒溶液，然后将溶液注入芯片微通道中，避免产生气泡，并确保芯片微通道内无气泡，以保证测量的准确性。将信号发生器的输出设置为频率1 MHz、峰峰值电压10 V的正弦信号，持续调节直至观察到微粒向微通道中线移动，并在到达中线后沿中线保持向前运动。

将1毫升细胞或细胞核悬液与标准颗粒溶液按1:1比例混合后，用注射器注入微通道，以测量细胞和细胞核。当细胞或细胞核进入视野时，启动CCD相机记录，并打开信号发生器。随后依次用去离子水、75%酒精和去离子水冲洗微通道，以备后续使用。

在不同时间间隔下，观察到细胞和颗粒在声场力作用下向微通道中线的运动。通过最佳拟合结果，计算了能量、密度和细胞可压缩性，并获得了声能密度以及颗粒的实测运动轨迹。从细胞中分离出高纯度且完整的细胞核，并通过获取细胞核的运动轨迹实现了细胞核可压缩性的测量。

测量并比较了不同类型癌细胞以及经药物诱导发生EMT或不同剂量X射线照射后的细胞的可压缩性。收集了测量后的细胞，发现与未处理组相比，在培养48小时后，细胞增殖和活力无显著差异。表明可压缩性测量对细胞增殖和存活无影响。

最重要的是微调信号频率，直到观察到颗粒向微通道的中线移动。