Name: 基于声流体微器件的细胞和细胞核可压缩性测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习使用声流体微器件快速无损测量肿瘤细胞和细胞核的可压缩性，探索上皮-间质转化或电离辐射后细胞力学特性的变化，为癌症诊断和临床研究提供新方法。

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本研究由国家自然科学基金（项目编号 12075330 和 U1932165）以及中国广东省自然科学基金（项目编号 2020A1515010270）资助。

1. 声流控微装置的制备与组装
<ol>
	<li>微流控芯片的制备
	<ol>
		<li>设计一个仅有一个入口和一个出口的单通道芯片，如图所示 图1用于测量细胞时，保持微通道的矩形横截面 740 µm 宽 100 µm 深。为测量细胞核，需改变微通道的宽度和深度 250 µm 和 100 µm分别。</li>
		<li>在硅片上制备微通道 通过 反应离子刻蚀。通过阳极键合将一块透明耐热玻璃密封在微通道顶部15用超声波清洗器清洗芯片10分钟，然后在干燥箱中干燥 50 °C 以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）块。
	<ol>
		<li>向一个直径为100 mm的玻璃培养皿中加入30 mL预聚物。用注射器向预聚物中加入3 mL固化剂。 
		注意：固化剂与预聚物的体积比为1:10。</li>
		<li>用玻璃棒剧烈搅拌PDMS预聚物和固化剂约10分钟。观察溶液中是否出现细小且均匀分散的气泡，这表明PDMS预聚物与固化剂已充分混合。</li>
		<li>将玻璃培养皿放入真空干燥器中，抽真空15-25秒。重复此过程，直至混合物中无气泡。</li>
		<li>将玻璃培养皿放入设定温度的干燥烘箱中 50 °C 孵育1小时，使混合物固化。孵育结束后，用手术刀将PDMS切割成大小合适的块状，每块长约1.2 cm，宽约1 cm。 
		注意：PDMS 块的长度与芯片宽度一致，宽度的选择需确保当两个 PDMS 块粘附在芯片上时，中间有足够空间放置压电陶瓷。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将PDMS块与芯片键合。
	<ol>
		<li>使用直径为1 mm的空心针在PDMS块上打孔，作为进样口和出样口。将PDMS块和芯片（背面朝上）放入等离子清洗仪中处理1分钟。</li>
		<li>将PDMS块上的孔与芯片的进样口和出样口对齐。轻轻将PDMS块按压在芯片上持续15秒，以使PDMS块与芯片表面发生键合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将聚四氟乙烯（PTFE）导管连接至芯片图2B).
	<ol>
		<li>剪取两段内径为0.8 mm、长度为10 cm的PTFE导管。将一根内径为0.7 mm、长度为1.5 cm的不锈钢针弯曲 90° 呈L形。将其连接至导管的一端。准备两根带有针头的此类导管。</li>
		<li>将不锈钢针插入PDMS块的孔中。在入口端，将19 G点样针连接到导管的另一端，作为与注射器连接的接头。</li>
		<li>完成上述步骤后，注入去离子水以检测整个通道的密封性。不漏水表示密封良好。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>压电陶瓷组件（图2C)
	<ol>
		<li>使用金刚石线切割机将直径为2 cm的压电陶瓷片切割成四条宽度为5 mm的条状。</li>
		<li>确保压电陶瓷的共振频率与芯片微通道的宽度相匹配。对于 740 µm 和 250 µm 分别使用共振频率为1 MHz和3 MHz的压电陶瓷，以适应宽微通道。</li>
		<li>在压电陶瓷一端的两侧焊接导线。</li>
		<li>使用氰基丙烯酸酯胶水将压电陶瓷粘接到芯片背面的中央。</li>
		<li>为使胶水均匀分布，先在压电陶瓷上滴一滴胶水，用牙签将胶水涂匀并除去多余胶水。然后迅速将其压在芯片上，持续按压约1分钟，确保压电陶瓷与芯片牢固粘合且接触均匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装微装置（图 2D).
	<ol>
		<li>裁剪一块聚二甲基硅氧烷（PDMS）作为微装置的基底（长约1.5 cm，宽约1 cm）。使用双面胶带将基底的一侧粘附在进样口和出样口的PDMS模块上，另一侧粘附在透明玻璃载片上。将整个微装置固定在显微镜载物台上，以确保芯片处于同一焦平面上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 样品制备
<ol>
	<li>聚苯乙烯标准颗粒溶液的制备。
	<ol>
		<li>取0.05 mL聚苯乙烯颗粒（直径6 µm）溶液（2.1 x 108 颗粒/mL）加入至10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，充分混匀。 
		注意：为减少声能密度变化引起的测量误差，每次实验中均将聚苯乙烯颗粒溶液与样品溶液混合用作校准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞悬液的制备。
	<ol>
		<li>用PBS洗涤贴壁生长至90%融合度（约5 x 105 个细胞）的细胞（如MCF7、MDA-MB-231、HCT116）。加入500 µL 0.25%胰蛋白酶（1x），室温（25 °C）孵育1–2分钟。吸除胰蛋白酶，加入1 mL完全培养基，通过移液形成细胞悬液。</li>
		<li>将细胞悬液在100 x g 条件下离心5分钟。弃上清，用0.5–1 mL PBS重悬，获得细胞悬液。使用血细胞计数板计数细胞，浓度约为3–5 x 105 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞核悬液的制备
	<ol>
		<li>执行步骤2.2后，弃上清，按每20 µL细胞沉淀（约500万个细胞）加入200 µL胞浆蛋白提取试剂A（含1% PMSF），充分混匀。</li>
		<li>将上述混合物在220 x g 条件下涡旋5秒，然后置于冰浴中10分钟。孵育结束后，向溶液中加入10 µL胞浆蛋白提取试剂B。</li>
		<li>在220 x g 条件下涡旋5秒，再置于冰浴中1分钟，再次在220 x g 条件下涡旋5秒。最后在4 °C、1,000 x g 条件下离心5分钟。 
		注意：胞浆蛋白提取试剂A与B的体积比为20:1。</li>
		<li>弃上清，将沉淀用1 mL PBS重悬。然后在4 °C、1,000 x g 条件下离心4分钟。弃上清，用100 µL PBS重悬，制成细胞核悬液。</li>
		<li>向上述细胞核悬液中加入台盼蓝，室温（25 °C）染色4分钟。台盼蓝溶液与细胞核悬液的体积比为1:1。在倒置显微镜下使用10倍物镜计数细胞核数量。 
		注意：为在显微镜下清晰识别细胞核，需进行台盼蓝染色。台盼蓝溶液使用前需在37 °C水浴中预热10分钟以确保有效染色。</li>
		<li>用PBS缓冲液将上述细胞核悬液稀释至浓度为2–3 x 105 个核/mL。通过70 µm滤网过滤细胞核悬液。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 测定细胞和细胞核的可压缩性
<ol>
	<li>搭建测量系统（图3）
	<ol>
		<li>打开显微镜光源并启动相机软件。使用4倍物镜找到微通道的中间位置，即压电陶瓷的位置。</li>
		<li>连接导线，并将其分别焊接至信号发生器输出端的正负极，对应压电陶瓷的两端。</li>
		<li>将注射器安装在微注射泵上，并连接至入口导管。在出口导管末端放置一个小容器，用于收集从微通道流出的液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定测量参数
	<ol>
		<li>用注射器吸取聚苯乙烯微粒溶液，并将其注入芯片微通道中。避免芯片微通道中产生气泡，以确保测量准确。确保微粒在芯片微通道中均匀分布。 
		注意：测量可在无流动或不使用注射泵的条件下进行。如有需要，应将微注射泵的流速设置为适当值。此处流速范围为0–20 µL/h。</li>
		<li>将信号发生器的输出设置为频率1 MHz（测量细胞核时为3 MHz）、峰峰值电压（Vpp）为10 V的正弦信号。</li>
		<li>微调信号频率，直至观察到微粒向微通道中线移动，并在到达中线后沿中线保持向前运动（图4）。 
		注意：微粒向中线移动的速度由电压幅值决定，可在5 Vpp至20 Vpp之间调节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量细胞与细胞核
	<ol>
		<li>将1 mL细胞或细胞核悬液与标准微粒溶液按1:1比例混合，用注射器注入微通道。</li>
		<li>当细胞或细胞核进入视野时，启动CCD相机开始记录。随后打开信号发生器。当细胞或细胞核到达中线时，停止记录。</li>
		<li>依次使用去离子水、75%酒精和去离子水冲洗微通道，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据处理
<ol>
	<li>绘制颗粒或细胞的运动轨迹。
	<ol>
		<li>将捕获的视频导入 ImageJ 软件：文件 &gt; 打开 &gt; 选择文件夹。点击 ImageJ 软件工具栏中的椭圆形状，选择目标细胞及其相邻颗粒（图5）。</li>
		<li>如图5所示，在 ImageJ 软件中预设测量参数：分析→ 设置测量 → 面积、质心、显示标签。</li>
		<li>以目标细胞或颗粒开始发生纵向位移的帧作为起始帧；记录每一帧中细胞或颗粒的像素位置和尺寸，直至其到达微通道中线。将数据导出为电子表格文件，并重复此步骤，直至获得所有目标细胞的轨迹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>坐标变换与校正。
	<ol>
		<li>记录当前视野下微通道四个角点的像素坐标，分别为 (0, y1)、(0, y2)、(x3, y3)、(x4, y4)，其中 x3 = x4。</li>
		<li>对于每个测量点 (xi, yi)，使用以下公式计算旋转校正后的新坐标 (xi', yi')： 
		<img alt="三角函数方程 θ = atan((y1-y3)/x3) + atan((y2-y4)/x4) 示意图，角度计算。" src="/files/ftp_upload/64225/64225eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 1"> 
		<img alt="二维坐标变换方程，xi'=xi×cosθ+yi×sinθ，用于旋转分析。" src="/files/ftp_upload/64225/64225eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 2"> 
		<img alt="变换方程，\(y' = yi \times \cos\theta - xi \times \sin\theta\)，数学公式。" src="/files/ftp_upload/64225/64225eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 3"></li>
		<li>将像素坐标转换为实际尺寸坐标。通过将像素坐标乘以比例系数获得实际坐标，该比例系数为微通道的实际宽度除以其像素宽度（H）。</li>
		<li>将步骤 4.1 中获得的细胞和颗粒像素坐标进行变换与校正，得到最终的运动轨迹数据。所有坐标减去左下角点坐标，即 (0, y2)。视频帧率为每秒 40 帧，因此将每个坐标对应的帧数乘以 0.025 s，得到颗粒运动的时间，从而获得 y 方向上位置随时间的变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算声能密度（图6A、B）。
	<ol>
		<li>细胞或颗粒在 Y 方向上的运动由声力 Fac 和流体动力 FD 驱动。使用以下公式计算运动轨迹： 
		<img alt="谐振子方程；m(d²y/dt²)=F_ac(y,t)+F_D(y,t)；动力学；公式。" src="/files/ftp_upload/64225/64225eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 4">     (1) 
		<img alt="声辐射力方程示意图，超声颗粒操控研究中的关键公式。" src="/files/ftp_upload/64225/64225eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 5">     (2) 
		<img alt="流体动力拖曳力方程，\(\vec{F}_D=3\pi\mu D(\vec{v}_f-\vec{v}_c)\)，符号表示。" src="/files/ftp_upload/64225/64225eq06.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程 6">     (3) 
		其中 r 和 D 分别为细胞或颗粒的半径和直径，ρ 和 β 分别为其密度和可压缩性，ν 为速度矢量。下标 c 和 f 分别表示细胞和流体。d 为距最近声压节点的距离，μ 为流体的动力黏度，k 为波数，E 为声能密度。 
		注：MCF7、HCT116、A549 和细胞核的密度分别为 1068 kg/m3、1077 kg/m3、1073 kg/m3 和 1155 kg/m312,16,17。</li>
		<li>根据步骤 4.3.1 中所述公式，使用 MATLAB 软件通过有限差分法求解标准颗粒在声场中的运动轨迹数值解。</li>
		<li>在预设的声场范围内，改变声能密度，将数值解（步骤 4.3.2 获得）与标准颗粒的实测运动轨迹（步骤 4.2 获得）进行拟合。根据拟合均方误差选择最佳拟合结果。此处获得的声能密度将作为后续计算细胞可压缩性的参数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>计算细胞可压缩性（图6C、D）。
	<ol>
		<li>将声能密度设置为步骤 4.3.3 中获得的数值。</li>
		<li>根据步骤 4.3.1 中所述公式，使用 MATLAB 软件通过有限差分法求解细胞在声场中的运动轨迹数值解。</li>
		<li>与步骤 4.3.3 类似，在预设的可压缩性范围内，改变可压缩性，将数值解（步骤 4.4.2 获得）与细胞的实测运动轨迹（步骤 4.2 获得）进行拟合。将最佳拟合结果对应的可压缩性系数作为测得的细胞可压缩性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+cancer%3A+the+role+of+physical+interactions+and+mechanical+forces+in+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis.</a> Nature Reviews. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).</li>
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<li>Hirawa, S., Masudo, T., Okada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+recognition+of+counterions+in+ion-exchange+resins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acoustic recognition of counterions in ion-exchange resins.</a> Analytical Chemistry. 79 (7), 3003-3007 (2007).</li>
<li>Joosse, S. A., Gorges, T. M., Biology Pantel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((detection%2C+and+clinical+implications+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">detection, and clinical implications of circulating tumor cells.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (1), 1-11 (2015).</li>
<li>Martin, O. A., Anderson, R. L., Narayan, K., MacManus, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+the+mobilization+of+circulating+tumour+cells+during+cancer+therapy+cause+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Does the mobilization of circulating tumour cells during cancer therapy cause metastasis.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 14 (1), 32-44 (2017).</li>
</ol>

作者无竞争性财务利益或其他利益冲突。

常用的细胞力学测量方法包括原子力显微镜（AFM）、微吸管抽吸、微流控方法、平行板技术、光镊、光拉伸器以及声学方法20。微流控方法可通过三种方式实现：微收缩、拉伸流和剪切流。其中，光拉伸器、光镊、声学方法、拉伸流和剪切流属于非接触式测量。与接触式测量相比，非接触式测量能有效避免因接触或局部形变引起的细胞损伤问题。光镊对测量环境非常敏感21，光学条件的扰动可能导致测量结果出现显著差异，且测量过程中较高的激光功率也可能造成细胞损伤。此外，光拉伸器和光镊通常通量较低20,22。微流控方法中的拉伸流和剪切流无法直接测量肿瘤细胞的微力学特性23。与其他方法相比，声学方法在细胞力学测量中具有无损、高通量和广泛适用性的优势。
本文设计的基于声流控微装置的测量方法利用非接触式的声辐射力，最大的优势在于不会对细胞造成损伤，这一点已通过本文展示的...

细胞力学特性在肿瘤转移、细胞恶性转化以及放射敏感性中起着重要作用1,2。为了深入理解细胞力学特性在上述过程中的作用，准确测量细胞力学性能至关重要，且测量过程不应影响细胞的后续培养与分析。测量过程应尽可能快速，否则若细胞长时间脱离培养环境，其活性可能受到影响。
现有的细胞力学测量方法存在一些局限性。某些方法，如磁扭转细胞仪、磁镊和粒子追踪微流变学，由于将颗粒引入细胞而容易造成细胞损伤3,4,5。与细胞接触式测量的方法，如原子力显微镜（AFM）、微吸管抽吸、微收缩通道和平行板技术，也容易导致细胞损伤，且通量难以提高6,7,8。此外，电离辐射会使细胞变扁并增强其黏附性9；因此，有必要在悬浮状态下对完整细胞的力学性质进行测量。
针对上述挑战，已开发出一种基于声流控方法10,11,12,13,14的细胞力学测量系统。微通道宽度与声波半波长匹配，从而在微通道中线处形成一个声压波节。在声辐射力的作用下，细胞或标准微球可迁移至声压节点。由于标准微球的物理性质（尺寸、密度和可压缩性）已知，因此可确定声能密度。随后，通过记录细胞在声场中的运动轨迹，即可获得细胞的可压缩性。该方法可实现对悬浮状态细胞的无损、高通量测量。本文将介绍微流控芯片的设计、系统的构建及测量步骤。已对多种肿瘤细胞进行测量，以验证该方法的准确性。通过调节压电陶瓷的共振频率和微通道的宽度，该方法的应用范围已拓展至亚细胞结构（如细胞核）。此外，还研究了药物诱导的上皮-间质转化（EMT）以及不同剂量X射线辐照后细胞可压缩性的变化。结果表明，该方法作为一种研究生化变化与细胞力学特性之间关联的有力工具，具有广泛的应用前景。

<table><tbody><tr><td>0.25% 胰蛋白酶(1x)</td><td>GIBCO</td><td>15050-065</td><td></td></tr><tr><td>502 胶水</td><td>Evo-bond</td><td></td><td>氰基丙烯酸酯胶水</td></tr><tr><td>A549</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td>肺腺癌细胞系</td></tr><tr><td>胞核蛋白与胞质蛋白提取试剂盒</td><td>Beyotime</td><td>P0027</td><td>包含胞质蛋白提取试剂 A 和 B</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基 (DMEM)&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-013-CVRC</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>AUSGENEX</td><td>FBS500-S</td><td></td></tr><tr><td>HCT116</td><td>ATCC</td><td>CCL247</td><td>结直肠癌细胞系</td></tr><tr><td>耐热玻璃</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz&amp;rsquo;s L-15 培养基&amp;nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22&amp;nbsp;</td><td>乳腺腺癌细胞系</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>HTB-26&amp;nbsp;</td><td>乳腺腺癌细胞系</td></tr><tr><td>最低必需培养基 (MEM)</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Corning</td><td>21-040-cvc</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Beyotime</td><td>ST506</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Polybead 聚苯乙烯红色染色微球&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>15714</td><td>微球直径为 6.00&amp;micro;m</td></tr><tr><td>碘化丙啶 (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 硅橡胶弹性体</td><td>Dow-Corning</td><td>1673921</td><td>包含预聚物和固化剂</td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Beyotime</td><td>C0011</td><td></td></tr></tbody></table>

基于声流控微装置的细胞与细胞核压缩性测量

Measurement of the Compressibility of Cell and Nucleus Based on Acoustofluidic Microdevice

细胞力学在肿瘤转移、细胞恶性转化以及放射敏感性中发挥着重要作用。在这些过程中，研究细胞的力学特性往往具有挑战性。基于接触的传统测量方法（如压缩或拉伸）容易造成细胞损伤，影响测量精度以及后续的细胞培养。在贴壁状态下进行测量也会影响准确性，尤其是在电离辐射后，因为辐射会使细胞变扁平并增强其贴附性。本文开发了一种基于声流控技术的细胞力学测量系统。通过记录细胞在声力作用下的运动轨迹，可获得细胞的可压缩性，从而实现悬浮状态下的快速、无损测量。本文详细报道了芯片设计、样品制备、轨迹记录、参数提取与分析的实验方案。基于该方法，测量了多种肿瘤细胞的可压缩性。通过调节压电陶瓷的共振频率和微通道的宽度，还实现了对细胞核可压缩性的测量。结合免疫荧光实验在分子水平的验证，比较了药物诱导上皮-间质转化（EMT）前后细胞可压缩性的变化。进一步揭示了不同剂量X射线辐照后细胞可压缩性的变化。本文提出的细胞力学测量方法具有通用性和灵活性，在科学研究与临床实践中具有广泛的应用前景。

本文介绍了一种基于声流控微装置的快速、非破坏性细胞可压缩性测量系统的构建方案，并展示了其在不同条件下测量细胞及细胞核的优越性。图1展示了微流控通道的示意图。声流控微装置的组成与组装如图2所示。图3展示了测量系统的装置示意图。在声场力的作用下，细胞和颗粒将向微通道中线移动，如图4A所示。细胞或颗粒的尺寸与位置测量如图5所示。通过拟合计算能量密度与细胞可压缩性的方法如图6所示。为了将该装置的应用范围拓展至细胞器，特别是细胞核，实验中从细胞中分离出高纯度且完整的细胞核（图7A）。通过相应调节压电陶瓷的共振频率和微通道的宽度，获得了细胞核的运动轨迹（图4B），并实现了细胞核...

本文介绍了一种基于声流控微装置的快速、无损测量细胞或细胞核可压缩性的方法。通过该方法研究了肿瘤细胞在上皮-间质转化或电离辐射后力学特性的变化，展示了该技术在科学研究与临床实践中的应用前景。

细胞力学在肿瘤转移、细胞恶性转化以及放射敏感性中起着重要作用。在这些过程中，研究……

细胞力学在肿瘤转移、细胞恶性转化以及放射敏感性中起着重要作用。声流控方法可实现悬浮状态下细胞的快速、无损测量。该技术可用于反映上皮-间质转化过程中细胞自身压缩性的变化，并用于分离循环肿瘤细胞，展现出其在癌症诊断中的应用前景。首先，使用直径为1毫米的空心针在PDMS块上打孔，以制备进样口和出样口，然后将PDMS块与芯片通过等离子体清洗仪进行键合。接着，将PDMS块和芯片背面朝上放入等离子体清洗仪中处理1分钟。随后，对准PDMS块上的孔与芯片的进样口和出样口，轻轻将PDMS块压在芯片上持续15秒，从而使PDMS块与芯片表面实现键合。为了将PTFE导管连接到芯片上，截取两段内径为0.8毫米、长度为10厘米的导管。将一根内径为0.7毫米、长度为1.5厘米的不锈钢针弯成90度的L形，并将其连接到导管的一端。将不锈钢针插入PDMS块的孔中。对于入口端，将一个19号规格的分配针连接到导管的另一端，作为注射器的连接头。随后注入去离子水，以检测整个通道的密封性。对于压电陶瓷组件，选择宽度为5毫米的预切割压电陶瓷片。然后在一端将导线焊接在压电陶瓷的两侧。将一滴氰基丙烯酸酯胶水滴在压电陶瓷上，把压电陶瓷粘接到芯片背面的中央位置。用牙签将胶水抹平，并去除多余的胶水。然后迅速将其压在芯片上，并持续按压约一分钟。安装微装置时，裁剪一块PDMS作为微装置的基底，使用双面胶带将基底的一侧粘附到进样口和出样口的PDMS模块上，另一侧粘附到透明玻璃载片上。将整个微装置固定在显微镜载物台上，以确保芯片处于同一焦平面上。为制备聚苯乙烯标准颗粒溶液，将0.05毫升聚苯乙烯颗粒溶液加入10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中，并充分混匀。然后通过PBS洗涤90%融合度的贴壁细胞，制备细胞悬液。在室温下加入500微升0.25胰蛋白酶，作用1至2分钟。消化液去除后，加入一毫升完全培养基，通过移液形成细胞悬液。随后以100 ×g离心五分钟。弃去上清液，并用0.5至一毫升磷酸盐缓冲液重悬，以获得细胞悬液。然后用血细胞计数板对细胞进行计数，浓度约为每毫升30万至50万个细胞。按照先前所述方法制备细胞核悬液后，去除上清液，每20微升细胞沉淀加入200微升胞浆蛋白提取试剂A，充分混匀。随后将上述混合物在220 ×g条件下涡旋振荡5秒，并置于冰浴中10分钟。接着，在孵育后的溶液中加入10 µL细胞质蛋白提取试剂B。涡旋混匀后，置于冰浴中1分钟，再于220 ×g条件下涡旋5秒。最后，在4 °C条件下，以1000 ×g离心5分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）中。随后在4°C条件下以1000 G离心4分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于100微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，制成细胞核悬液。向上述细胞核悬液中加入台盼蓝，在室温下染色4分钟。接着，使用倒置显微镜和10倍物镜对细胞核数量进行计数。随后，用PBS缓冲液将上述细胞核悬液稀释至每毫升200,000到300,000个细胞核的浓度。然后将细胞核悬液通过70微米的滤网过滤。设置测量系统时，打开显微镜的光源并启动相机软件。使用4倍物镜找到微通道的中心位置，即压电陶瓷的位置。连接导线后，将其分别焊接至压电陶瓷信号发生器输出端的正负极。然后将注射器放置在显微注射泵上，并将其连接至进液导管。为收集微通道中的液体，在出液导管末端放置一个小容器。为确定测量参数，使用注射器吸取聚苯乙烯微粒溶液，然后将溶液注入芯片微通道中，避免产生气泡，并确保芯片微通道内无气泡，以保证测量的准确性。将信号发生器的输出设置为频率1 MHz、峰峰值电压10 V的正弦信号，持续调节直至观察到微粒向微通道中线移动，并在到达中线后沿中线保持向前运动。将1毫升细胞或细胞核悬液与标准颗粒溶液按1:1比例混合后，用注射器注入微通道，以测量细胞和细胞核。当细胞或细胞核进入视野时，启动CCD相机记录，并打开信号发生器。随后依次用去离子水、75%酒精和去离子水冲洗微通道，以备后续使用。在不同时间间隔下，观察到细胞和颗粒在声场力作用下向微通道中线的运动。通过最佳拟合结果，计算了能量、密度和细胞可压缩性，并获得了声能密度以及颗粒的实测运动轨迹。从细胞中分离出高纯度且完整的细胞核，并通过获取细胞核的运动轨迹实现了细胞核可压缩性的测量。测量并比较了不同类型癌细胞以及经药物诱导发生EMT或不同剂量X射线照射后的细胞的可压缩性。收集了测量后的细胞，发现与未处理组相比，在培养48小时后，细胞增殖和活力无显著差异。表明可压缩性测量对细胞增殖和存活无影响。最重要的是微调信号频率，直到观察到颗粒向微通道的中线移动。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

基于声流体微器件的细胞和细胞核可压缩性测量

我们介绍了两种独立的基于显微镜的技术，用于测量单个活体贴壁细胞在整体或局部应变作用下所诱导的细胞核和细胞骨架形变。这些技术可用于测定细胞核的刚度（即形变能力），并探究细胞核与细胞骨架之间的细胞内力传递。...

探测间期细胞核机械特性的生物物理实验方法：基底应变施加与微针操控

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

我们展示了一种基于微流控的检测方法，用于测量细胞通过一系列微米级狭窄通道的通过时间尺度。...

一种用于探测细胞变形能力的微流控技术

本方案描述了一种利用微流控装置实现小体积（0.15–1.5...

用于精确小体积样品处理的微流控平台及其在声学微装置中按尺寸分离生物颗粒的应用

在本实验方案中，我们描述了一种使用微移液管的方法，可直接对活细胞中的细胞核施加可控的力。该检测方法可用于研究活体贴壁细胞中细胞核的力学特性。...

用于测量细胞核与细胞骨架之间机械整合的直接力探针

本方案描述了一种低成本声流控装置的组装与操作方法，该装置通过超声造影剂诱导的声孔效应，实现分子对细胞的快速递送。...

用于增强分子化合物向细胞递送的声流控装置的组装与操作

本文介绍了一种利用光镊进行直接力测量，在三维受限条件下研究分离的斑马鱼胚胎细胞内机械特性的实验方案。...

使用光镊在受限环境中进行亚细胞力学的直接力测量

我们介绍一种通过无针水射流技术进行细胞注射的方法，并结合一系列递送后的检测，评估细胞的活力、增殖能力及弹性测量。...

通过水射流技术注射猪脂肪组织来源的基质细胞

本研究提出了一种新方案，通过将磁性微珠递送至细胞质，直接对细胞核施加机械力，同时进行活细胞荧光成像。...

结合三维磁力驱动装置与多功能荧光成像技术研究细胞核力学生物学

量化原子力显微镜（AFM）探针尖端与样品表面之间的接触面积及施加的力，可实现纳米尺度力学性能的测定。本文讨论了在空气或液体环境中，对软质和硬质样品实施基于AFM悬臂梁的纳米压痕技术以测量弹性模量或其他纳米力学性能的最佳实践方法。...

基于原子力显微镜悬臂的纳米压痕技术：在空气与液体环境中进行纳米尺度力学性能测量

本文介绍一种利用基于电子学的微流控平台——机械节点孔传感（mechano-NPS）技术，对单个细胞进行机械表型分析的方法。该平台在测量细胞弹性与黏性等生物物理特性的同时，可保持每秒1至10个细胞的中等通量。...

机械-节点-孔传感：一种用于多参数单细胞黏弹性测量的快速无标记平台

学习使用声流体微器件快速无损测量肿瘤细胞和细胞核的可压缩性，探索上皮-间质转化或电离辐射后细胞力学特性的变化，为癌症诊断和临床研究提供新方法。

基于声流控微装置的细胞与细胞核压缩性测量

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