Name: 重组和表征具有可调电机驱动动力学和力学的肌动蛋白-微管复合材料 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 了解利用驱动蛋白和肌球蛋白马达驱动的肌动蛋白-微管复合材料，通过共聚焦成像和差示动态显微镜技术表征其收缩与重组动力学，为合成生物学和仿生材料设计提供新方法。

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我们感谢Maya Hendija和Jonathan Michel博士在数据分析方面提供的帮助，感谢Janet Sheung博士、Moumita Das博士和Michael Rust博士提供的有益讨论与指导。本研究得到了授予RMRA和JLR的威廉·M·凯克基金会研究资助以及美国国家科学基金会DMREF奖（DMR 2119663），以及授予RMR-A和RJM的美国国立卫生研究院R15资助（R15GM123420，2R15GM123420-02）的支持。

1. 准备硅烷化盖玻片和显微镜载玻片，以防止蛋白质吸附到样品池表面
注意：此过程需要2天。硅烷化载玻片可提前最多1个月制备，以备后续使用。
<ol>
	<li>将1号盖玻片（24 mm × 24 mm）和载玻片（1英寸 × 3英寸）放入可适配等离子清洗仪的专用支架中，将支架放入等离子清洗仪中运行20分钟。</li>
	<li>将盖玻片和载玻片转移至仅用于硅烷处理的专用支架中，并将支架放入玻璃容器内，按以下步骤清洗玻片：
	<ol>
		<li>将盖玻片和载玻片浸入100%丙酮中1小时，随后浸入100%乙醇中10分钟。</li>
		<li>将盖玻片和载玻片浸入去离子水（DI）中5分钟，重复清洗步骤共三次。</li>
		<li>将盖玻片和载玻片浸入新配制的0.1 M KOH溶液中15分钟，再浸入新鲜去离子水中5分钟，重复此步骤共三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将盖玻片和载玻片在空气中干燥10分钟，随后对已清洗的盖玻片和载玻片进行硅烷处理，以形成疏水表面，具体步骤如下： 
	注意：以下步骤需在通风橱中完成。
	<ol>
		<li>将&#160;干燥的盖玻片和载玻片浸入2%硅烷（溶于甲苯）中5分钟。使用漏斗将硅烷溶液倒回指定瓶中，可重复使用最多五次。</li>
		<li>将盖玻片和载玻片浸入100%乙醇中5分钟，随后更换为新鲜乙醇，再次浸入5分钟。</li>
		<li>将盖玻片和载玻片浸入新鲜去离子水中5分钟，重复乙醇和去离子水洗涤步骤共三次，每次均使用新鲜乙醇和去离子水。最后将盖玻片和载玻片在空气中干燥10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 制备由肌球蛋白迷你丝驱动的活性肌动蛋白-微管复合物
<ol>
	<li>去除无活性的肌球蛋白 通过 肌动蛋白丝结合及拉下实验 通过 超速离心，具体步骤如下。
	<ol>
		<li>将肌动蛋白聚合为纤维。使用精密微量移液器和无菌吸头，在微量离心管中加入： 1.87 &#181;L 去离子水 1.3 &#181;L 10倍G缓冲液 1.3 &#181;L 10倍F缓冲液 1.63 &#181;L 4 M KCl 溶液 4.53 &#181;L 的肌动蛋白（47.6 &#181;M），以及 1.08 &#181;L 的 100 &#181;M phalloidin 
		注意：为了确保充分聚合，肌动蛋白浓度及肌动蛋白与鬼笔环肽的摩尔比应 18.4 &#181;M 分别为2:1。</li>
		<li>轻轻吹打溶液以混匀，然后在避光条件下冰浴放置 ≥1 h。将超速离心机预冷至 4 &#176;C. 从 -80 °C 取出肌球蛋白等分试样80 &#176;C 置于冰上。 
		注意：在肌动蛋白聚合的同时，执行步骤 2.2。</li>
		<li>在肌动蛋白聚合 ≥1 h 后，加入 1.3 &#181;L 10 mM ATP 2 &#181;L 的 19 &#181;M 肌球蛋白与聚合的肌动蛋白结合。 
		注意：肌动蛋白与肌球蛋白的摩尔比应为 &#62;5，以确保充分去除无活性的肌球蛋白马达（即失活的头部）。</li>
		<li>轻轻吹打溶液以混匀，转移至超速离心管中。 
		&#8203;离心 4 &#176;C 和 121,968 x g 30分钟</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下所述制备肌动蛋白丝与微管的共缠结复合网络。 
	注意：在肌球蛋白沉降实验（步骤 2.1.4）开始前 30 分钟进行。
	<ol>
		<li>将加热块设定至 37 &#176;C使用精密移液器和无菌吸头，将以下成分加入微量离心管中： 13.9 &#181;L PEM的 3 &#181;L 含 1% Tween20， 1.55 &#181;L 的 47.6 &#181;M 肌动蛋白, 0.36 &#181;L 的 34.8 &#181;M R-肌动蛋白， 0.3 &#181;L 250 mM ATP 0.87 &#181;L 的 100 &#181;M 鬼笔环肽, 1.91 &#181;L 5-488-微管蛋白 0.3 &#181;L 100 mM GTP 0.75 &#181;L 的 200 &#181;M 紫杉醇，加至总体积 23 &#181;L. 
		注意：所列出的肌动蛋白和微管蛋白浓度是针对复合物的 2.9 &#181;M 肌动蛋白和 2.9 &#181;M 微管蛋白。总蛋白浓度为 c = cA + cT&#160;= 5.8 &#956;M&#160;以及摩尔肌动蛋白分数为 cA/(cA + cT) = &#934;A = 0.5。请参见步骤 2.5 以调整这些数值。</li>
		<li>轻轻吹打溶液以混匀，并置于 37 &#176;C 避光条件下，37℃金属浴中孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下说明准备共聚焦成像实验所需的样品腔室。 
	注意：在等待期间完成步骤 2.1.4 和 2.2.2。
	<ol>
		<li>将两张硅烷化载玻片并排置于关闭的加热板上，在载玻片上相距约3 mm处横向放置两条热塑性封片膜，再将两张硅烷化盖玻片覆盖于热塑性封片膜上，形成样品腔室。</li>
		<li>将热板调至低温档，加热至盖玻片通过熔化的热塑性封片膜牢固粘附于载玻片上（约1–2分钟）。均匀施压以确保粘合效果，同时保持约100 &#181;m 两个表面之间的间距。</li>
		<li>移除腔室并关闭加热板。用（+）和（-）标记腔室。（+）腔室用于活性样品（含肌球蛋白），（-）腔室用于对照（无肌球蛋白）。确保每个腔室可容纳 ≤10 &#181;L 液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照下述方法制备待成像样品。 
	注意：在完成步骤 2.1 和 2.2 后，必须立即执行此步骤。
	<ol>
		<li>小心地从超速离心机（步骤 2.1.4）中取出肌球蛋白-肌动蛋白样品，并立即用移液器吸取上层 7.5 &#181;L 上清液转移至新的微量离心管中。</li>
		<li>从热块中取出肌动蛋白-微管样品，并轻轻混匀 1.5 &#181;L 10× D-葡萄糖， 1.5 &#181;L 10x GOC 的 1.5 &#181;L 1 mM 比比斯坦溶液分成两份 13.7 &#181;L 分装并标记为 (+) 和 (-)。</li>
		<li>混合 1.28 &#181;L 将步骤 2.4.1 中的上清液加入 (+) 分装管中。混合 1.28 &#181;L 将DI加入至(-)等分试样中。缓慢将每种溶液流入相应的腔室（步骤2.3） 通过 毛细作用。注意避免将气泡引入通道中。</li>
		<li>用快干环氧树脂或紫外胶密封每个通道的两个开口端。在将样品置于显微镜前，确保胶水完全干燥。按照步骤3所述立即进行成像。 
		注意：UV 胶具有优势&#160;因为它在紫外光照射下几乎瞬间固化。然而，由于blebbistatin对紫外线敏感，必须仅使用小型紫外光笔对胶水局部照射（在样品腔边缘处），以避免使blebbistatin失活。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：调整蛋白质浓度以调控复合物的动力学特性和结构。 
	注意：如果需要，可对上述步骤进行如下调整，以改变肌动蛋白、微管和肌球蛋白的浓度。
	<ol>
		<li>除步骤 2.2.1 和 2.4.3 中所述修改外，其余步骤均按照上述描述进行。</li>
		<li>通过改变肌动蛋白和微管的浓度，从而进行调节 c 和 &#934;A，可根据需要增加或减少步骤 2.2.1 中所用的肌动蛋白、R-actin 和 5-488-tubulin 的体积26. 在改变肌动蛋白浓度时，应按比例调整R-actin和鬼笔环肽的摩尔浓度，以保持与肌动蛋白的摩尔比不变。同时调整PEM的体积，使混合物的最终体积保持不变 23 &#181;L所有其他组分的体积和浓度保持不变。</li>
		<li>通过调整第 2.4.3 步中加入 (+) 分样中的肌球蛋白体积，以调节肌球蛋白浓度。相应调整加入 (-) 分样中的去离子水体积。调整第 2.2.1 步中的 PEM 体积，以补偿肌球蛋白 (+) 和去离子水 (-) 体积的增减，确保每个样品 ((+) 和 (-)) 的最终体积为 14.98&#160;&#956;L.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用共聚焦显微镜对活性复合材料进行成像与表征
<ol>
	<li>为观察步骤2中制备的肌动球蛋白-微管复合物，使用配备60倍、1.4数值孔径（NA）油浸物镜的激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）或类似显微镜。为在不同荧光通道中同时观察肌动蛋白纤维和微管，分别采用561 nm激光配合565/591 nm激发/发射滤光片，以及488 nm激光配合488/525 nm激发/发射滤光片。</li>
	<li>将样品室置于显微镜上，使控制通道正对物镜下方。确保物镜与盖玻片之间有油相界面。</li>
	<li>使用载物台控制装置将对照复合样品调至清晰对焦，然后找到样品室的上下两个表面。将 z 轴位置移至样品室中心。检查是否存在清晰的丝状网络结构，如图所示。 图2.</li>
	<li>在观察对照室的同时，调节各激光器的强度，以便同时观察肌动蛋白丝和微管。应保持尽可能低的激光强度，以防止光漂白（在肌动蛋白通道中更为明显）和串色（通常从微管通道渗入肌动蛋白通道）。</li>
	<li>为表征非活性对照样本，采集三段256 × 256像素的方形像素时间序列（视频），213 &#181;m x 213 &#181;m) 以2.65帧/秒的速度采集图像，总帧数不少于1000帧。每个时间序列在样品腔的不同区域采集，区域之间间隔不少于≥500 &#181;m确保可检测到的运动最小，且无流动或结构重组。</li>
	<li>关闭488 nm激光器，使用载物台控制装置移动至(+)室。</li>
	<li>使用 568 nm 激光，在 (+) 通道中观察微管，以确保网络结构正常形成（图2）并确定样品室的轴向中心（该位置可能与对照室的中心 z 位置不同）。</li>
	<li>打开488 nm激光器，并对上述步骤3.5进行修改后重复操作。采集时间序列最长至45分钟，在样品移出视野、发生破裂或发生光漂白时停止采集。记录5–10个时间序列，并记录每个时间序列相对于第一个时间序列开始时刻的时间。</li>
	<li>使用 DDM、SIA 和 PIV 分析数据，具体方法如所述 图3, 图4, 图5，以及先前17,48,50,51. 
	&#8203;注意：488 nm 激光通过解除对肌球蛋白ATP酶活性的抑制（即失活blebbistatin）实现局部激活，因此仅应在实验开始时开启&#160;数据采集时，将 t = 0 设为时间序列的起始点。这些采集参数已针对差分动态显微镜（DDM）分析进行了优化，方法与先前研究一致。26.</li>
</ol>
4. 由驱动蛋白马达驱动的活性肌动蛋白-微管复合物的制备
注意：以下步骤将创建由驱动蛋白马达或驱动蛋白与肌球蛋白50共同驱动而偏离平衡态的肌动蛋白-微管复合物。
<ol>
	<li>按照下述方法准备驱动蛋白和肌球蛋白马达。
	<ol>
		<li>若需加入肌球蛋白，请执行步骤 2.1。</li>
		<li>为形成可结合并施加作用力于微管对之间的驱动蛋白马达簇，使用微量移液器和无菌移液器吸头，向一个无菌的1.5 mL微量离心管中加入以下成分：1.16 &#181;L PEM 2.74 &#181;L 8.87 &#181;M 驱动蛋白二聚体， 7.29 &#181;L 83.3 &#181;M NeutrAvidin 0.81 &#181;L 2 mM DTT。用移液器轻轻吹打混匀，避光孵育（使用黑色微量离心管或用锡箔纸包裹）30分钟，于 4 &#176;C. 
		注意：驱动蛋白二聚体与 NA 的摩尔比为 1:25。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照步骤2.3准备样品腔室，制备三个腔室而非两个。在驱动蛋白孵育（步骤4.1.2）和肌球蛋白超速离心（步骤4.1.1）期间执行此步骤。</li>
	<li>制备肌动蛋白纤维与微管的共缠结复合网络。
	<ol>
		<li>将加热块设定为 37 &#176;C使用微量移液器和无菌吸头，将以下成分加入一支无菌的1.5 mL微量离心管中： 3.21 &#181;L PEM, 4.5 &#181;L 1% Tween20 2.18 &#181;L 的 47.6 &#181;M 肌动蛋白, 3.46 &#181;L 5-R-微管蛋白，4.5&#160;&#181;L 100 mM ATP 4.5 &#181;L 10 mM GTP 1.13 &#181;L 的 200 &#181;M 紫杉醇，以及 1.57 &#181;L 的 20 &#181;M 488-鬼笔环肽。确保总体积为 25 &#181;L.</li>
		<li>轻轻吹打溶液以混匀，并置于 37 &#176;C 避光条件下在加热块中孵育1小时。将离心管从加热块中取出，使用微量移液器轻轻混匀 0.84 &#181;L 100分之&#160;&#956;M 鬼笔环肽。室温避光孵育5-10分钟。 
		注意：在此步骤中加入鬼笔环肽，而非步骤 4.3.1，可改善肌动蛋白丝的荧光标记效果，因为 488-鬼笔环肽无需与未标记的鬼笔环肽竞争肌动蛋白结合位点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为共聚焦成像制备活性复合材料。
	<ol>
		<li>添加 1.13 &#181;L 的 200 &#956;M blebbistatin, 1.35 &#181;L 10倍浓度的Glu，以及 1.35 &#181;L 将10倍浓度的GOC溶液加入步骤4.3.2所得溶液中，轻轻吹打混匀。将溶液均分为三份 10 &#181;L 分装并标记为 (K)、(K+M) 和 (-)。</li>
		<li>混合 2.54 &#181;L 将步骤 2.1.4 中的肌球蛋白加入 (K+M) 等分试样中。混匀 2.54 &#181;L 将 PEM 分装至 (K) 和 (-) 管中。</li>
		<li>使用微量移液器和无菌吸头添加 2.5 &#181;L 将4.1.2步骤中的驱动蛋白聚集体分别加入到（K）和（K+M）分装液中。用移液器上下吹打混匀。充分混匀 2.5 &#181;L 使用相同技术将 PEM 转换至 (-)。 
		注意：所列出的肌动蛋白和微管蛋白浓度适用于复合物 2.32 &#181;M 肌动蛋白和 3.48 &#181;M 微管蛋白。总蛋白浓度为 c = cA&#160;+ cT&#160;= 5.8&#160;&#956;M&#160;以及摩尔肌动蛋白分数为 cA/(cA&#160;+ cT) =&#160;&#934;A&#160;= 0.4。驱动蛋白和肌球蛋白的浓度为 0.35 &#181;M 和 0.47 &#181;M，分别参见步骤 2.5 中关于调整 c 的通用指南A，cT，c，和 &#934;A.</li>
		<li>使用微量移液器，将每种溶液缓慢注入已制备的样品室（步骤 4.2）对应的通道中 通过 毛细作用。缓慢而轻柔地向下按压移液管，以避免将气泡引入通道中。</li>
		<li>用快干环氧树脂或紫外固化胶密封每个通道的两个开口端。在将样品置于显微镜前，确保胶体完全干燥。 
		注意：此步骤需快速完成，以尽量减少驱动蛋白在未受监测情况下发挥作用的时间。因此，建议使用1分钟内固化的环氧树脂（而非5或10分钟固化的类型）。在此方面，紫外光固化胶具有优势，因其在紫外光照射下可几乎瞬间固化。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在完成第3步后立即制备用于成像的样品，但需进行以下重要修改。由于驱动蛋白（kinesin）不受光激活控制，其在第4.4.3步之后即立即开始发挥作用，因此将此时刻标记为 t = 0。为了尽可能接近初始非活性状态（t = 0）对复合物进行成像，应首先对（K）和（K+M）通道进行成像，并记录从第4.4.3步到数据采集开始（第3.8步）之间经过的时间。实际操作中，该时间间隔约为5 min。</li>
</ol>
5. 将被动交联剂掺入活性复合材料
注意：这些步骤描述了如何使用生物素标记的肌动蛋白和微管蛋白亚基以及中性亲和素（NA）在步骤4所述的活性复合物中被动交联肌动蛋白与肌动蛋白（A-A）或微管与微管（M-M）。
<ol>
	<li>制备含有生物素化蛋白（生物素-肌动蛋白或生物素-微管蛋白）、NA 和生物素的 A-A 或 M-M 交联剂复合物，其比例为 2:2:1（生物素-肌动蛋白/微管蛋白 : 生物素 : NA）。此步骤应在第 4 步之前开始。
	<ol>
		<li>对于 A-A 交联剂，使用微量移液器和无菌移液吸头，向微量离心管中加入 2 µL 的 11.6 µM 生物素-肌动蛋白、1.39 µL 的 8.33 µM NA、2.27 µL 的 1.02 µM 生物素，以及 4.34 µL 的 PEM。通过上下吹打轻轻混匀。</li>
		<li>对于 M-M 交联剂，使用微量移液器和无菌移液吸头，向微量离心管中加入 1.86 µL 的 4.55 µM 生物素-微管蛋白、1.11 µL 的 8.33 µM NA、1.82 µL 的 1.02 µM 生物素，以及 5.21 µL 的 PEM。通过上下吹打轻轻混匀。</li>
		<li>用热塑性密封膜包裹第 5.1.1 和/或 5.1.2 步骤中的离心管，形成防水密封。将管子放入浮力浮板中，并置于设定为 4 °C 的温控超声水浴中。</li>
		<li>在 4 °C 下超声处理 90 分钟。实际操作中，最好将超声仪置于冷室中，并在超声水浴中加入冰袋以维持低温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为将交联剂复合物掺入成像样品，请遵循第 4.3 步，并根据以下说明修改第 4.3.1 步，分别用于 A-A 交联（第 5.2.1 步）或 M-M 交联（第 5.2.2 步）。
	<ol>
		<li>对于 A-A 交联，在微量离心管中混合以下组分：1.94&#160;µL PEM、4.50 µL 1% Tween20、2.18 µL 47.6 µM 肌动蛋白、3.46 µL 45.5 µM 5-R-微管蛋白、1.13 µL A-A 交联剂（第 5.1.1 步）、4.50 µL 100&#160;mM ATP、4.50 µL 10 mM GTP、1.13 µL 200 µM 紫杉醇，以及 1.57 µL 20 µM 488-鬼笔环肽。确保总体积为 25 µL。</li>
		<li>对于 M-M 交联，在微量离心管中混合以下组分：1.97&#160;µL PEM、4.50 µL 1% Tween20、2.18 µL 47.6 µM 肌动蛋白、3.76 µL 45.5 µM 5-R-微管蛋白、1.13 µL 经 1:4 稀释的 M-M 交联剂（第 5.1.2 步）、4.50 µL 100 mM ATP、4.50 µL 10 mM GTP、1.13 µL 200 µM 紫杉醇，以及 1.57 µL 20 µM 488-鬼笔环肽。确保总体积为 25 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照第 4.3.2–4.5 步操作，使用特定浓度，使交联剂与肌动蛋白的摩尔比为 RA = 0.02，交联剂与微管蛋白的摩尔比为 RT =&#160;0.005。这些 RA 和 RT 值可使交联剂在肌动蛋白丝和微管上的间距相近（dA <img alt="方程 1" src="/files/ftp_upload/64228/64228eq1.png" />&#160;60 nm 和 dMT&#160;<img alt="方程 1" src="/files/ftp_upload/64228/64228eq1.png" /> 67 nm），估算公式为 dA = I单体/2RA，其中 I单体 为肌动蛋白单体的长度；dMT = I环/26RT，其中 I环 为由 13 个微管蛋白组成的环的长度15,17。</li>
</ol>

<ol>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

上述重建系统的一个重要进展在于其模块化和可调性，因此鼓励用户根据预期目标调整蛋白质、马达蛋白、交联分子等组分的浓度，无论是为了模拟特定的细胞过程，还是为了构建具有特定功能或力学性能的材料。肌动蛋白和微管蛋白的浓度范围受限于其聚合所需的临界浓度下限（肌动蛋白约为0.2 μM）57,58,59 和微管蛋白（约为3 - 4&#160;μM）60，以及上限由肌动蛋白丝向向列相排列转变（约90 μM）61,62 或微管（约35&#160;μM）63 所决定。肌动蛋白单体和微管蛋白二聚体应共同聚合形成纤维，而不是在各自聚合后再混合，以确保形成均匀互穿的渗流网络，从而实现协同支撑。复合物所表现出的新颖动力学行为依赖于这种相互作用。虽然为成功重现文中所示结果，通常需要严格按照方案中列出的所有步骤操作，但其中某些步骤要求更为严格，而另一些步骤则可根据具体需求和可用资源进行适当修改和调整。
例如，确保实验结果可重复的一个重要步骤是按照材料表中提供的指南正确配制和储存试剂。细胞骨架蛋白（如肌动蛋白、微管蛋白、肌球蛋白、驱动蛋白）性质不稳定，应分装后用液氮速冻，并在 -80 °C 下以单次使用量分装保存。一旦从 -80 °C 取出，分装样品应始终保持在冰上。细胞骨架蛋白在经历额外的冻融循环后，其功能无法可靠保持。
微管比肌动蛋白对去聚合和变性更为敏感。微管蛋白从 -80 °C 取出后，应在聚合前始终保持在冰上，并在 12 小时内使用。一旦聚合完成，微管应保存在室温下。使用紫杉醇稳定微管以防止其去聚合也至关重要。同样，用鬼笔环肽稳定肌动蛋白纤维对于抑制消耗 ATP 的肌动蛋白踏车现象非常重要，因为该过程会与肌球蛋白和驱动蛋白的活性相竞争。
肌球蛋白马达的超速离心是另一个关键步骤，因为它可以去除无活性的肌球蛋白“死头”。若不除去这些无酶活性的单体，会导致肌动蛋白网络发生被动交联并丧失活性。为了延长马达的ATP酶活性，可加入ATP再生系统，例如磷酸肌酸和磷酸肌酸激酶64。
最后，维持复合体活性需要抑制微丝和马达蛋白在样品腔壁上的吸附，这可以通过对显微镜盖玻片和载玻片进行钝化处理来实现。马达蛋白尤其容易发生吸附，导致复合体被拉向样品腔表面，移出视野范围，塌陷为二维结构，并不再表现出活性。对盖玻片和载玻片进行硅烷化是一种有效的表面钝化方法，可防止吸附（见步骤1）。另一种被有效使用的钝化方法是 体外 细胞骨架实验中的一种方法是用脂质双层包被表面，类似于细胞膜18该方法的优势在于，若希望将蛋白质固定在表面或引入其他特定的蛋白质-表面相互作用，可通过功能化脂双层实现。对于光镊实验而言，微球的钝化同样至关重要，可通过以牛血清白蛋白（BSA）或聚乙二醇（PEG）包被羧基化微球来实现。 通过 碳二亚胺交联化学48.
研究人员可根据需要考虑对本方案中的某些方面进行调整。首先，研究人员可选择用生物来源的交联剂（如分别交联肌动蛋白和微管的α-辅肌动蛋白或MAP65）替代非天然的生物素-NA交联剂。28,65,66使用非天然交联剂是出于其相较于天然交联剂在可重复性、稳定性和可调控性方面的显著优势。由于生物素与链霉亲和素（biotin-NA）之间具有极强的结合力，可认为此类交联剂是永久性的，而大多数天然交联剂则为瞬时结合，且解离速率差异较大。瞬时交联的动力学特性使得解析交联剂与分子马达对系统动力学各自贡献的过程变得复杂。此外，生物素-链霉亲和素交联系统可灵活用于微丝与微管各自的同源交联，也可实现微丝与微管之间的异源交联。因此，在保持其他所有变量（如交联剂尺寸、结合亲和力、化学计量比等）恒定的条件下，能够对不同交联模式进行明确的比较。最后，引入生物素-链霉亲和素交联所需的试剂 commercially available 广泛、特性明确，且已在众多生物物理实验室中普遍使用。然而，该方法的一个关键优势在于 体外 此处所述平台的模块化特性使其具有灵活性，因此研究人员可根据需要无缝地将生物素-NA连接子替换为天然连接子。
其次，在当前的实验方案中，肌动蛋白单体和微管蛋白二聚体在加入样品室之前，先在离心管中共同聚合形成纤维。将缠结的纤维状蛋白质溶液注入样品室时，可能会引起流动取向，尤其是微管的取向，从而破坏复合物所期望的各向同性和均匀性。事实上，以往在稳态肌动蛋白-微管复合物研究中的一个重要进展，是能够在样品室内（in situ）共聚合肌动蛋白和微管，以确保形成各向同性的相互贯穿网络结构15,16,27。然而，将该方法扩展至活性复合物时，需要在肌动蛋白和微管蛋白聚合之前就将马达蛋白加入样品中，并在整个样品于37 °C条件下孵育后再进行实验。对该方案变体的测试结果显示，肌动蛋白的聚合程度降低，且未观察到明显的马达蛋白活性，这可能是由于马达蛋白存在竞争性ATP酶活性以及在37&#160;°C长时间孵育所致。幸运的是，采用当前方案时，并未观察到复合物存在明显的流动取向现象，这一点可以从图2、图3和图6中看出。尽管如此，仍鼓励研究人员设计能够实现活性复合物原位（in situ）形成的实验方案。
另一个需要考虑的问题是荧光标记方案，该方案涉及对网络中所有肌动蛋白丝和微管进行稀疏标记。这种标记方法经过优化，旨在直接观察网络结构，而非通过推断来获取结构与动态信息 通过 示踪细丝或微球。然而，其权衡在于单个细丝的标记较弱且难以分辨。研究人员可采用的一种兼顾单根细丝分辨与网络结构可视化的策略是掺入预先形成的、用另一种荧光染料标记的细丝，从而实现对周围网络结构和单根细丝的同时成像。然而，当使用两种以上的荧光染料及激发/发射通道时，通道间的串扰通常难以完全消除，因此在选择荧光染料、滤光片和激光强度时必须格外谨慎。
另一个局限性在于无法对复合物中的肌球蛋白或驱动蛋白马达进行可视化观察。实验所用的荧光标记肌动蛋白单体和微管蛋白二聚体均为商业化产品，而对复合物中的肌球蛋白或驱动蛋白进行可视化则需要自行标记。建议研究人员进一步开展马达蛋白的标记工作，正如先前研究所实现的那样18,67，以便明确将马达蛋白的活性和结合行为与本研究中复合物所表现出的动力学特征及结构变化直接关联起来。
最后需要指出的是，在本实验方案中，驱动蛋白活性的起始时间和持续时间无法控制。由于如上所述，肌球蛋白活性是通过光去活化blebbistatin来调控的，因此若要实现对驱动蛋白类似的光激活控制，可采用光激活ATP。
为了增加本文所述设计的复杂性，以更好地模拟细胞环境并拓展动态结构-功能参数空间，未来的研究将致力于引入中间纤维（如波形蛋白68,69）以及其他分子马达（如动力蛋白13,70）。此外，还将引入不同浓度的凝溶胶蛋白以调控肌动蛋白的长度14，以及tau蛋白以调控微管的刚度。
综上所述，本文所述的实验方案介绍了如何设计、构建并表征包含两种独立的、可在单一系统内作用于不同底物的活性力生成组分的细胞骨架仿生活性物质系统的动力学、结构与力学特性。这一可调节且模块化的平台使重建工作在模拟细胞骨架方面向前迈出了重要一步，并提供了通过独立地添加、移除或调节不同组分，在宽广的相空间内编程系统特性的独特能力。此外，该多功能系统的全部组分均可通过商业途径获得（参见材料表），唯独驱动蛋白二聚体需在Ross实验室进行纯化，其方法如前所述50，并可根据需求提供。最后，所有分析代码均可通过GitHub免费获取49，且基于开源编程语言与软件（Python和Fiji）。这些系统设计方法的透明化传播，有望使该平台更易于被具有不同专业背景、研究目标、机构归属的广大用户群体所使用。

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Christopher Currie1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University
to:
Mehrzad Sasanpour1 
Daisy H. Achiriloaie1,2 
Gloria Lee1 
Gregor Leech1 
Maya Hendija1 
K. Alice Lindsay3 
Jennifer L. Ross3 
Ryan J. McGorty1 
Rae M. Robertson-Anderson1 
1Department of Physics and Biophysics, University of San Diego 
2W. M. Keck Science Department, Scripps College, Pitzer College, and Claremont McKenna College 
3Department of Physics, Syracuse University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64228">Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

细胞骨架是由相互作用的生物大分子组成的动态复合网络，为细胞提供结构和力学支持。相关的分子马达和结合蛋白可重构并调节细胞骨架，使细胞能够生长、改变形状、硬化、移动甚至自我修复，从而实现从迁移、分裂到机械感知等多种细胞过程1,2。除了在细胞生物物理学中的重要意义外，细胞骨架也是活性物质的典型范例，其在材料科学中的潜在应用广泛，涵盖伤口愈合、药物递送、过滤技术以及软体机器人等领域1,3,4,5,6,7,8,9。
赋予细胞骨架独特结构和力学多样性以及多功能性的两个关键特征是：1）其复合性质，包含多种相互作用的蛋白质纤维，如半柔性肌动蛋白纤维和刚性微管，以及与之相关的结合蛋白和交联蛋白3,5,10；以及其持续重构、移动、粗化和做功的能力 通过 耗能马达蛋白（如肌球蛋白和驱动蛋白）对丝状蛋白进行推拉作用1,7,11,12,13尽管这种精妙的复杂性使细胞骨架能够介导细胞运动、胞质分裂和伤口愈合等多样化的过程3,6,7,11，这会妨碍研究人员重现该特征的能力 体内 重建细胞骨架的特征 体外 系统。
当前前沿的重建研究主要集中在由缠结和交联的肌动蛋白丝与微管组成的复合物上3,10,14,15,16,17，产生作用力的肌动蛋白-肌球蛋白网络2,8,18,19,20,21以及由驱动蛋白-微管相互作用驱动的活性向列相22,23,24,25,26稳态肌动蛋白-微管复合物已被证明具有涌现的力学特性15,16,27，与单组分系统相比，具有增强的丝状物移动性和更高的刚度27. 关于研究 体外 肌动球蛋白系统已报道了多种结构和动态特性，这些特性依赖于肌动蛋白、肌球蛋白和交联蛋白的浓度28,29,30,31例如，在充分交联的情况下，肌动球蛋白网络会发生大尺度的收缩和粗化2,28,30,32,33,34,35,36而无交联剂时，网络会表现出快速的失稳流动和破裂19,29. 已有报道指出，利用驱动蛋白马达簇交联并牵拉微管束的重建微管基活性向列相系统可表现出持久的湍流流动、延伸、屈曲、断裂与自愈合现象12,22,23,24,25,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47.
最近的研究表明，由肌球蛋白II小丝驱动的肌动蛋白-微管复合物相比无交联剂的肌动蛋白-肌球蛋白网络所表现出的无序流动和网络破裂，能够实现更有序的收缩和更高的网络完整性17,26,48。此外，当肌动蛋白和微管以相近浓度存在时，复合物的力学稳定性与力生成能力达到最佳。在此配比范围内的关键涌现特性包括增强的机械强度26、肌动蛋白与微管的协调运动26、持续稳定的收缩以及介观尺度的结构重组17。
本文描述了构建和调控微管与肌动蛋白丝共缠结且交联的复合物的实验方案，这些复合物分别由作用于肌动蛋白丝的肌球蛋白II小丝和作用于微管的驱动蛋白簇驱动，使其处于非平衡状态（图1）。通过调节纤维、马达蛋白和交联分子的相对浓度，可调控此类复合物的动力学行为、结构特征和力学性能，从而呈现出丰富的相态行为，包括对流和湍流流动、各向同性收缩、加速、减速、相分离、刚度增强、松弛以及破裂。本研究的重点在于制备并调控这类活性细胞骨架复合物。然而，为了帮助研究人员对标定和表征所描述的活性复合物，本文还详细介绍了利用多光谱共聚焦显微镜进行有效成像的方法。最后，展示了可用于测量复合物动力学、结构和力学特性的关键计算分析方法的结果。鼓励研究人员采用这些方法——包括差分动力学显微术（DDM）、空间图像自相关分析（SIA）和粒子图像测速技术（PIV）——因为这些方法已针对复合物复杂的动力学行为和结构多样性进行了优化17,26,49。
以下步骤重点介绍复合材料的制备及其利用共聚焦显微镜进行成像。有关采集后数据分析和光镊测量的实验方案可参见先前的研究工作。&#160;17,26,48,50,&#160;应要求提供。所有材料均列于随附的材料表中。

<table><tbody><tr><td>(-)-Blebbistatin&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; blebbistatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B0560</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 200 &amp;mu;M 在DMSO中&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 干燥，DMSO中，-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 将1 mg粉末溶解于 200 &amp;mu;M 在DMSO中&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 保质期有限，通常在3至4个月后便无法稳定发挥作用。建议每3个月购买并配制新溶液。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1:20 488-微管蛋白:微管蛋白混合物&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 5-488-微管蛋白</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 5 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 将微管蛋白与488标记的微管蛋白按20:1的比例混合，用液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 每份等分试样在4℃冰上保存时，最长可使用12小时&amp;ordm;避光保护</td></tr><tr><td>1:20 R-微管蛋白:微管蛋白混合物&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 5-R-微管蛋白</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 5 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 将微管蛋白与罗丹明标记的微管蛋白按20:1的比例混合，用液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 每份等分试样置于冰上4℃保存时，最多可使用12小时&amp;ordm;避光保护</td></tr><tr><td>肌动蛋白（生物素标记）：骨骼肌&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 生物素-肌动蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>AB07</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 1 mg/ml，溶于G缓冲液&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用G缓冲液重悬至1 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; (1) 使用前立即用 PEM 稀释至 0.5 mg/ml，(2) 一旦从 -80℃ 取出&amp;ordm;C，储存&amp;nbsp; 4℃冰上分装&amp;ordm;C，最长可保存1周</td></tr><tr><td>肌动蛋白（罗丹明标记）：兔骨骼肌&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; R-肌动蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>AR05</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 1.5 mg/ml，溶于G缓冲液&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用G缓冲液重悬至1.5 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 一旦从 -80 取出&amp;ordm;C，储存&amp;nbsp; 4℃冰上分装&amp;ordm;C，最多可使用1周</td></tr><tr><td>三磷酸腺苷&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; ATP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1048</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 100 mM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 在溶液中（pH 7），-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用去离子水重悬&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0，用 NaOH 调节 pH 至 7&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 定期检查 pH 值并根据需要进行调整，该溶液会随时间水解，每约 6–12 个月更换一次</td></tr><tr><td>AlexaFluor488 Phalloidin&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 488-鬼笔环肽</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A12379</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 100 &amp;mu;M DMSO&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 避光，干燥，-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 重悬至 100 &amp;mu;M 用DMSO处理&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 使用前立即稀释至 20 &amp;mu;M 在 PEM 中1 &amp;mu;L 在 4 &amp;mu;L 质子交换膜（PEM）</td></tr><tr><td>AlexaFluor488&amp;ndash;标记的肌动蛋白&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 488-肌动蛋白</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A12373</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 1.5 mg/ml，溶于G缓冲液&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用G缓冲液重悬至1.5 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 此产品已停产</td></tr><tr><td>基础等离子清洗仪&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>贝米斯&amp;nbsp;Parafilm M 实验室封口膜&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 透明薄膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13-374-5</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt;&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1682836</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 100x&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 于 -20 °C 干燥条件下保存，储存浓度为原液浓度（100 倍）或 10 倍浓度&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 将粉末用去离子水重悬至 4.5 mg/ml&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 溶液中的终浓度应 45 &amp;mu;g/mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>D-生物素&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 生物素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP232-1</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 1.02 mM 在 PEM 中&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 干燥，4&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>去离子纳米纯水&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; DI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲基二氯硅烷&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 硅烷</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D/3820/PB05</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 2% 溶于甲苯</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; DTT</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0861</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 1 M in DMSO&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 干燥，-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 每次实验前用 PEM 立即稀释至 2 mM</td></tr><tr><td>DMSO 无水&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; DMSO</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>F-缓冲液&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; F缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 10x&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 干燥，-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 10 mM 咪唑（pH 7.0），50 mM KCl，1 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM EGTA，0.2 mM ATP</td></tr><tr><td>G-缓冲液&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; G缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 10x&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 干燥，-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 2.0 mM Tris (pH 8), 0.2 mM ATP, 0.5 mM DTT, 0.1 mM CaCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. 储存于 -20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 载玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22-310397</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶 + 过氧化氢酶 + &amp;beta;-巯基乙醇&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; GOC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2133-250KU, C1345, 63689&amp;nbsp;</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 100x&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; -20℃干燥保存，储存浓度（100倍浓缩液）或10倍浓缩液&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 100倍浓度：4.3 mg/ml 葡萄糖氧化酶，0.7 mg/ml 过氧化氢酶，0.5% v/v&amp;nbsp; &amp;beta;-巯基乙醇在去离子水（DI H₂O）中&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 溶液中的终浓度应为：0.005% &amp;beta;-巯基乙醇， 43 &amp;mu;g/mL 葡萄糖氧化酶 7 &amp;mu;g/mL 过氧化氢酶</td></tr><tr><td>谷氨酸-谷氨酰胺氧化还原循环氧清除系统&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 谷氨酸-草酰乙酸转氨酶</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 100x&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 每次使用时新鲜配制&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 等量混合谷氨酸（Glu）和GOC，成像前立即加入，终体积为样品体积的1/100&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 成像前立即由Glu和GOC配制</td></tr><tr><td>三磷酸鸟苷&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; GTP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0461</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 100 mM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 100 &amp;mu;L -20 保存的等分试样&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Instant Mix 1分钟环氧树脂胶&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 环氧树脂</td><td>Loctite</td><td>1366072&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kinesin-1 401 BIO 6x HIS&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 驱动蛋白</td><td>在美国雪城大学JL Ross实验室制备</td><td>NA</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 8.87 &amp;mu;M 在 PEM 中&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 生物素化二聚体形成驱动蛋白簇，每份样品在4℃冰浴中储存可使用长达12小时&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>NeutrAvidin&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; NA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31000</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 5 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 干燥，-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 将粉末用 PEM 重悬至 5 mg/ml</td></tr><tr><td>1 号盖玻片（24 mm × 24 mm）&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 盖玻片</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12-548-CP</td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇&amp;nbsp;&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 紫杉醇</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P3456</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 2 mM DMSO溶液&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 避光，干燥，-20&amp;ordm;C&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用DMSO重悬至2 mM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 使用前立即稀释至 200 &amp;mu;M 在 DMSO 中（0.4 &amp;mu;L 在 3.6 &amp;mu;L DMSO</td></tr><tr><td>PEM-100&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; PEM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 1x&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 室温（RT）&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 100 mM K-PIPES（pH 6.8），2 mM EGTA，2 mM MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 使用KOH调节pH至6.8，频繁重新检测pH并相应调整</td></tr><tr><td>鬼笔环肽&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 鬼笔环肽</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P3457</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 100 &amp;mu;M 在DMSO中&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 避光，干燥，-20&amp;ordm;C，严格遵守储存和操作条件&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 重悬至 100 &amp;mu;M 用DMSO处理&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 易受制备过程中的杂质及变性影响，表现为样品中可识别出的大块无定形肌动蛋白聚集体</td></tr><tr><td>猪脑微管蛋白&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 微管蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>T240</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 5 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用 PEM 将粉末重悬至 5 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 每份等分试样在4℃冰上保存时，最多可使用12小时&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>氯化钾&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; KCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9640G</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 4 M&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; RT</td></tr><tr><td>兔骨骼肌动蛋白&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 肌动蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>AKL99</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 2 mg/ml，溶于G缓冲液&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用G缓冲液重悬至2 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 一旦从 -80 取出&amp;ordm;C，储存&amp;nbsp; 4℃冰上分装&amp;ordm;C，最多可使用1周</td></tr><tr><td>兔骨骼肌肌球蛋白 II&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 肌球蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>MY02</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 10 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用 PEM 将粉末重悬至 10 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 单体在低浓度KCl条件下形成微丝，每份样品在4℃冰上保存可使用长达12小时&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>微管蛋白（生物素标记）：猪脑&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 生物素-微管蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>T333P</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 5 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用 PEM 将粉末重悬至 5 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 使用前立即用 PEM 稀释至 0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>微管蛋白（荧光HiLyte 488标记）：猪脑来源&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 488-微管蛋白</td><td>细胞骨架</td><td>TL488M</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 5 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用 PEM 将粉末重悬至 5 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 每份等分试样在4℃冰浴中储存可使用长达12小时&amp;ordm;C，避光保护</td></tr><tr><td>微管蛋白（罗丹明标记）：猪脑&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; R-tubulin</td><td>细胞骨架</td><td>TL590M</td><td>&lt;strong&gt;储存液浓度：&lt;/strong&gt; 5 mg/ml，溶于 PEM&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; 单次使用分装，-80&amp;ordm;C，避免冻融循环&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储备液与实验配方：&lt;/strong&gt; 用 PEM 将粉末重悬至 5 mg/ml，液氮速冻&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 每份等分试样在4℃冰上保存时最多可使用12小时&amp;ordm;C，避光保护</td></tr><tr><td>Tween 20&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; Tween20</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>J20605.AP</td><td>&lt;strong&gt;储存浓度：&lt;/strong&gt; 1% v/v，溶于去离子水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;储存：&lt;/strong&gt; RT</td></tr><tr><td>超速离心级微量离心管&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 贝克曼库尔特 Optima Max XP&amp;nbsp;</td><td>贝克曼库尔特</td><td>343776</td><td>&lt;strong&gt;储存、操作与故障排除注意事项：&lt;/strong&gt; 8x34 mm PC</td></tr><tr><td>紫外光固化胶&lt;br/&gt; &amp;nbsp;&lt;strong&gt;论文中使用的缩写：&lt;/strong&gt; 紫外胶</td><td>法尔达</td><td>SKG-2869</td><td></td></tr></tbody></table>

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

Reconstituting and Characterizing Actin-Microtubule Composites with Tunable Motor-Driven Dynamics and Mechanics

由相互作用的半柔性肌动蛋白丝和刚性微管网络组成的复合细胞骨架，利用如肌球蛋白II和驱动蛋白等马达蛋白来重构结构并产生作用力，从而驱动细胞迁移、胞质分裂、黏附以及机械感知等关键过程。尽管肌动蛋白与微管之间的相互作用对细胞骨架的多功能性和适应性至关重要，但目前对其与肌球蛋白和驱动蛋白活性之间协同作用的理解仍处于初步阶段。本文介绍了如何构建可调控的三维复合网络，其中肌动蛋白丝与微管共缠结，并在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的作用下发生主动重构和弹道式运动，且可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。文中还详细描述了对微管和肌动蛋白丝进行荧光标记的实验方案，以通过多光谱共聚焦成像最有效地观察复合结构的重构过程与运动行为。最后，展示了可用于定量表征非平衡态结构、动力学及力学特性的数据分析方法的结果。重建并研究这一可调的仿生平台，为理解马达蛋白活性、复合力学性能与丝状结构动力学的耦合如何导致从有丝分裂、细胞极化到机械感知等多种细胞过程提供了重要见解。

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。

由半柔性肌动蛋白丝和刚性微管相互作用形成的复合细胞骨架，会发生重构并产生力学作用……

我们的研究通过构建由驱动蛋白和肌球蛋白马达驱动的肌动蛋白与微管复合物，实现了对细胞条件的更精确模拟，使细胞骨架重建工作向前迈出了重要一步。通过独立添加、移除和调节不同组分，可精确调控这些复合物的动态行为与结构，使其表现出丰富的相态行为，包括收缩、聚集、消散、粗化和破裂。该方法具有广泛适用性，可用于设计、构建和表征包含多种作用于不同底物的力生成组分的活性物质平台。演示该实验步骤的是来自我们实验室的本科研究人员 Daisy Achiriloaie 和 Maya Hendija。首先，使用微量移液器和无菌移液器吸头，将试剂加入一个无菌的黑色 1.5 毫升微量离心管中，以形成驱动蛋白马达簇，这些马达簇可结合微管对并施加作用力。用移液器轻轻吹打溶液使其混合均匀。然后将溶液在4 °C条件下孵育30分钟，并避光保存。为制备肌动蛋白丝与微管的共交联复合网络，将加热块预热至37 °C。将试剂加入一个无菌的0.6毫升微量离心管中。确保总体积为25微升。轻轻吹打溶液以混匀，并将管子置于37摄氏度的加热块中避光孵育1小时。随后，将离心管从加热块中取出，使用微量移液器轻轻加入 0.84 µL 的 100 µM Phalloidin。室温避光孵育 5 至 10 分钟。为制备用于共聚焦成像的活性复合物，将试剂加入溶液中，并通过上下吹打轻轻混匀。将溶液分成三份，每份10 µL，分别标记为K、K加M和阴性对照。向K加M样品中加入2.54 µL肌球蛋白，向K和阴性对照样品中各加入2.54 µL PEM缓冲液。然后向K和K加M样品中各加入2.5 µL驱动蛋白聚集体，用移液器吹打混匀。接下来，使用相同技术向阴性对照中加入 2.5 µL PEM。用微量移液器通过毛细作用将每种溶液缓慢注入样品室的相应通道中。按压移液器时应非常缓慢且轻柔，以避免将气泡引入通道内。用快干环氧树脂或紫外光固化胶密封每个通道的两个开口端。待粘合剂完全干燥后，将通道置于显微镜下，尽可能接近初始非活性状态时对复合材料进行成像。首先对 K 通道和 K 加 M 通道成像，随后对对照通道成像。记录将驱动蛋白聚集体加入 K 和 K 加 M 的等分试样后至开始数据采集之间的时间间隔。制备肌动蛋白-肌动蛋白（AA）交联剂时，将生物素标记的肌动蛋白（Biotin-Actin）、中性亲和素（NeutrAvidin）、生物素（Biotin）和 PEM 缓冲液加入微量离心管中，通过上下轻柔吹打混匀。类似地，制备微管-微管（MM）交联剂时，将生物素标记的微管蛋白（Biotin-tubulin）、中性亲和素（NeutrAvidin）、生物素（Biotin）和 PEM 缓冲液加入微量离心管中，同样通过上下轻柔吹打混匀。用热塑性天花板膜包裹离心管，形成防水密封，并将其置于漂浮筏中，放入温度控制在4 °C的超声水浴仪内，处理90分钟。为将A-A交联复合物引入成像样品，将试剂加入微量离心管中，确保总体积为25 μL。同样，对于 M-M 交联剂复合物，将屏幕上显示的试剂加入一个微量离心管中。通过反复吹打混匀溶液，并将管子置于37°C金属浴中避光孵育1小时。孵育结束后，从金属浴中取出离心管，使用微量移液器加入0.84 µL的100 µM鬼笔环肽（Phalloidin），并混匀。室温避光孵育5至10分钟，然后重复前述步骤，制备用于共聚焦成像的活性复合物。肌动蛋白单纤维与微管蛋白二聚体共聚合，形成相互缠结的肌动蛋白丝与微管网络。肌球蛋白II小纤维与驱动蛋白簇对纤维施加推拉作用，驱使复合物偏离稳态。利用NeutrAvidin通过生物素化连接肌动蛋白细丝或微管，实现被动交联。将肌球蛋白II小细丝、驱动蛋白聚集体或两种马达蛋白分别整合到不含被动交联、含有肌动蛋白-肌动蛋白交联以及微管-微管交联的复合物中。本研究展示了在不同肌球蛋白浓度和摩尔肌动蛋白比例条件下，由肌球蛋白驱动的细胞骨架复合物的双色共聚焦成像结果。粒子图像测速技术显示，肌动蛋白-肌球蛋白活性可触发共缠结复合物中肌动蛋白与微管的协调性收缩动力学。此处，不同颜色的箭头对应不同的速度，具体数值可参考矢量场右侧的颜色标尺。对时间序列中的微管和肌动蛋白通道进行时间分辨差分动力学显微成像，以确定肌动蛋白和微管的衰减时间随波数变化的特征。通过拟合衰减时间曲线来确定收缩速度，并对每个45分钟时间序列全程的所有延迟时间取平均值。时间分辨的差分动态显微技术通过评估肌动蛋白和微管在45分钟激活时间内连续六分钟间隔的衰减时间，量化动力学随时间的变化。肌动蛋白纤维和微管的时间分辨收缩速度由对应衰减时间曲线的拟合结果确定。空间图像自相关分析通过比较实验开始和结束时不同网络的自相关曲线，量化由马达蛋白驱动的活性细胞骨架组分的重构过程。通过指数拟合自相关曲线确定的时间分辨相关长度，可区分出未发生重构的复合物与发生显著重构的复合物。双色共聚焦显微图像显示，在无交联剂条件下，驱动蛋白介导的肌动蛋白-微管复合物随时间推移表现出依赖于配方的重构行为，最终形成富含微管且连接松散的簇状结构。肌动蛋白-肌动蛋白交联支持肌动蛋白与微管的共定位，而微管-微管交联则增强D混合。差分动力学显微镜和空间图像自相关分析揭示了交联作用以及肌球蛋白与驱动蛋白马达之间的竞争对复合物随时间变化的动力学行为和结构的影响。为了更接近模拟细胞内环境，研究人员可引入中间纤维、其他分子马达以及调控纤维长度和刚度的结合蛋白。还可以进行光镊计量测量以表征复合材料的力学性能。利用我们的方法，研究人员可以在前所未有的相空间范围内精确调控仿细胞骨架复合活性物质的动力学行为和结构，从而模拟多种细胞过程，并设计可重构、可编程的功能材料。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

重组和表征具有可调电机驱动动力学和力学的肌动蛋白-微管复合材料

我们提出一种构建分子穿梭装置的方案，其中表面附着的驱动蛋白马达推动带有染料标记的微管。驱动蛋白与表面之间的弱相互作用使其能够可逆地附着于表面，从而形成一种纳米尺度系统，该系统在保持功能完整性的同时，展现出组分的动态组装与解聚行为。...

组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

利用光镊探测肌球蛋白在肌动蛋白细丝束中的集合力学行为

此处，我们介绍一种微管束的重建方案 体外...

直接测量重建的活性微管束内部作用力

我们介绍了简单的肌动蛋白丝微流控实验方案，结合荧光显微镜技术，可实时准确监测单个肌动蛋白丝，并依次将其暴露于不同的蛋白质溶液中。...

利用微流控技术与荧光显微镜研究单根肌动蛋白丝及其束状结构的组装动力学

本文介绍了一种使用植物微管交联蛋白MAP65和聚乙二醇（PEG）作为拥挤剂，形成类 tactoid...

微管束状聚集体的自组装

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

在本文中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架包封进巨大单层脂质囊泡（也称为脂质体）的实验技术，以及在脂质体膜内小叶形成模拟细胞皮层的F-肌动蛋白层的方法。...

体外 在巨大单层囊泡内重建肌动蛋白细胞骨架

本方案旨在通过可视化动态微丝和微管提供操作指南 体外 全内反射荧光（TIRF）显微镜检测...

可视化肌动蛋白与微管耦合动力学 体外 通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术

本方案描述了如何使用市售蛋白质组分在微珠表面产生肌动蛋白彗尾结构。此类系统可模拟细胞中的突出结构，能够以简化的方式研究力生成的生理机制。...

使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

本方案详细介绍了适用于研究微管聚合力学的微流控装置的设计与制备方法。通过结合微加工技术、自动流体控制和计算建模技术，构建了一个灵活的系统，特别适用于细胞骨架的力学特性探究。 体外.

基于微流控技术的微管聚合力学研究方法的开发

了解利用驱动蛋白和肌球蛋白马达驱动的肌动蛋白-微管复合材料，通过共聚焦成像和差示动态显微镜技术表征其收缩与重组动力学，为合成生物学和仿生材料设计提供新方法。

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

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