Name: 利用线性DNA模板从核酸外切酶缺陷细胞提取物中合成无细胞蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学习利用核酸外切酶V缺陷型大肠杆菌BL21 Rosetta2细胞提取物进行无细胞蛋白合成的方法，直接使用线性DNA模板，无需克隆和化学修饰，显著简化实验流程并加速生物设计原型测试。

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ACB 和 JLF 承认获得 ANR SINAPUV 项目（ANR-17-CE07-0046）的资金支持。JLF 和 JB 承认获得 ANR SynBioDiag 项目（ANR-18-CE33-0015）的资金支持。MSA 和 JLF 承认获得 ANR iCFree 项目（ANR-20-BiopNSE）的资金支持。JB 承认获得欧洲研究理事会（ERC）启动基金 &#34;COMPUCELL&#34;（项目编号 657579）的支持。结构生物化学中心承认获得法国整合结构生物学基础设施（FRISBI）（ANR-10-INSB-05-01）的支持&#160;。MK 承认获得法国国家农业、食品与环境研究院（INRAe）MICA 部门、巴黎-萨克雷大学、法兰西岛大区（IdF）DIM-RFSI 项目以及 ANR DREAMY 项目（ANR-21-CE48-003）的资金支持。本研究得到了欧洲研究理事会整合基金（865973 号，授予 CLB）的资助支持。

1. 培养基与缓冲液的配制
<ol>
	<li>2xYT+P 培养基（固体和液体）的制备
	<ol>
		<li>按照 表1 所述方法制备液体和固体培养基，然后通过高压灭菌进行灭菌。 
		注意：本实验方案需要一个含有氯霉素（10 µg/mL）的 2xYT+P 琼脂平板。液体培养基的体积与所需裂解液体积成正比。此处使用 5 L 液体 2xYT+P 培养基作为起始体积。然而，可根据需要调整体积，已知每 1 L 细胞培养物可产生 2 至 3 mL 最终细胞裂解液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氯霉素溶液（34 mg/mL）的制备
	<ol>
		<li>称取 0.34 g 氯霉素，加入乙醇至 10 mL，混匀溶解。将溶液分装至多个试管中，每管 1 mL，于 -20 °C 保存以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>S30A 缓冲液的制备
	<ol>
		<li>根据 表2 配制 S30A 缓冲液，目标体积为 2 L。 
		注意：该缓冲液的体积同样与所需裂解液的体积成正比。</li>
		<li>在高压灭菌前，使用冰醋酸将缓冲液的 pH 调整至 7.7。</li>
		<li>对缓冲液进行高压灭菌。</li>
		<li>高压灭菌后，将该缓冲液保存于 4 °C。</li>
		<li>使用前，向 S30A 缓冲液中加入 DTT（经 0.22 µm 膜过滤），使其终浓度达到 2 mM（每 1 L S30A 缓冲液中加入 2 mL 1 M DTT 储存液）。 
		注意：该缓冲液的体积仍与所需裂解液的体积成正比。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>能量溶液的制备 
	注意：该能量溶液基于 Sun 等人. 的研究13（14 倍储存浓度）。表3 汇总了制备能量溶液储存液所需的组分，并列出了本实验方案中所用化学品的货号。
	<ol>
		<li>根据 表3 配制各储存液，并置于冰上保存。</li>
		<li>根据 表3 所示，使用 2 M Tris 缓冲液（将 60.57 g Tris 碱溶于 250 mL 无菌水中）或 15% KOH 溶液（将 15 g KOH 溶于 100 mL 无菌水中），按需调节各组分的 pH。</li>
		<li>在 15 mL 离心管中，按照 表3 所示顺序依次加入各组分的相应体积。</li>
		<li>将能量溶液分装为每管 150 µL。</li>
		<li>在干冰上快速冷冻分装液，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氨基酸（AA）溶液的制备 
	注意：氨基酸溶液由 RTS Amino Acid Sampler 试剂盒制备。该试剂盒中每种 20 种氨基酸均以 1.5 mL 体积提供，浓度为 168 mM，唯亮氨酸为 140 mM。此处制备的储存液为 4 倍浓缩液，而非工作浓度溶液。氨基酸溶液的最终浓度为所有氨基酸均为 6 mM，唯亮氨酸为 5 mM。
	<ol>
		<li>通过涡旋振荡使 20 种氨基酸管解冻，并在 37 °C 下孵育至完全溶解。 
		注意：半胱氨酸可能无法完全溶解。</li>
		<li>在 50 mL 离心管中加入 12 mL 无菌水，并按照 表4 所示顺序依次加入每种氨基酸各 1.5 mL。</li>
		<li>涡旋振荡至溶液基本澄清，必要时可在 37 °C 下孵育。 
		注意：半胱氨酸可能无法完全溶解。</li>
		<li>在冰上将氨基酸溶液分装为每管 500 µL。</li>
		<li>在干冰上快速冷冻分装液，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>缓冲液校准用溶液的制备
	<ol>
		<li>按照 表5 所示方法配制 Mg-glu（100 mM）和 K-glu（3 M）的储存液。为校准步骤需要，从上述储存液中分别进行系列稀释（总体积为 1 mL），Mg-glu 稀释范围为 0 至 20 mM，K-glu 稀释范围为 20 至 300 mM，具体参见 补充文件1&#160;。 
		注意：这些储存液浓度仅用于校准步骤，在设置最终实验时可能需要调整。本实验方案测试的最高储存液浓度分别为 Mg-glu 1 M 和 K-glu 4.5 M。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PEG8000 溶液储存液的制备
	<ol>
		<li>配制 50 mL 的 40% PEG8000 溶液（将 20 g PEG8000 溶于 50 mL 无菌水中）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养与裂解液制备（4天实验）
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>划线接种BL21 Rosetta2菌株 ΔrecBCD (表6从-80 °C甘油菌种中取菌液，划线接种于含10 µg/mL氯霉素的2xYT+P琼脂平板。或者，使用BL21 Rosetta2 ΔrecB (表6）也可使用10.</li>
		<li>37 °C 过夜孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>从上述琼脂平板上挑取单菌落，接种于10 mL添加10 µg/mL氯霉素的2xYT+P培养基中。</li>
		<li>37 °C、200 rpm 振荡过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第3天
	<ol>
		<li>通过将过夜培养物用含10 µg/mL氯霉素的4 L新鲜2xYT+P培养基稀释100倍，进行转接培养。 
		注意：例如，将40 mL过夜培养物加入3960 mL新鲜培养基中。稀释后，将4 L培养基分装至4个（5 L体积）烧瓶中，每个烧瓶含1 L。</li>
		<li>在37 °C、200 rpm条件下培养约3至4小时，使菌液达到OD600 1.5–2.0。若测量OD，则将培养物稀释4倍600 &#62; 0.8. 
		注意：具体的孵育时间可能因菌株、初始接种量、实验器皿和所用仪器的不同而有所变化。ΔrecB/ΔrecBCD 敲除菌株的生长速率与 BL21 Rosetta2 亲本菌株相当补充图1).</li>
		<li>将培养物置于冰上。</li>
		<li>以 5,000 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 12 分钟，然后倾倒弃去上清液。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于800 mL预冷的S30A+DTT溶液中。 
		&#8203;注意：S30A+DTT 的体积为原始细胞培养液体积的 1/5。例如，若起始细胞培养液体积为 1 L，则用 200 mL 的 S30A+DTT 重悬细胞沉淀。建议在 4 °C 的冷藏室中进行此步骤，并将所有材料保持在冰上。</li>
		<li>以 5,000 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 12 分钟，然后倾倒弃去上清液。</li>
		<li>重复步骤 2.3.5 和 2.3.6。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于160 mL预冷的S30A+DTT溶液中。 
		注意：此次 S30A+DTT 的体积为原始细胞培养体积的 1/25。例如，若起始细胞培养体积为 1 L，则用 40 mL 的 S30A+DTT 重悬细胞沉淀。同样建议在 4 °C 的冷室中进行此步骤，并将材料置于冰上保存。</li>
		<li>将细胞转移至预冷并预先称重的50 mL离心管中。</li>
		<li>以 2,000 x g 离心细胞 g 4 °C下离心8分钟，然后倾倒弃去上清液。</li>
		<li>以 2,000 x g 离心细胞 g 4 °C 下离心 4 分钟，然后用移液器小心吸除剩余上清液。</li>
		<li>重新测量管子的重量，以计算细胞沉淀的重量。</li>
		<li>将细胞沉淀保存在 -80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第4天
	<ol>
		<li>从 -80 °C 取出细胞沉淀，在冰上解冻 1–2 小时。</li>
		<li>每克细胞沉淀加入0.9 mL S30A+DTT缓冲液重悬细胞沉淀。&#160;缓慢吹打以重悬细胞，尽量避免接触上层泡沫（如有）。</li>
		<li>将重悬的细胞每1 mL分装至1.5 mL离心管中，置于冰上或预冷的4 °C金属块中（建议使用金属块）。&#160; 
		注意：如果最后一份分装样品远少于1 mL，则最好弃去，而非对非最佳体积进行超声处理。本实验装置（试管、超声仪和探头）的超声处理最佳体积确定为1 mL，若装置不同，该体积可能有所变化。</li>
		<li>将每支试管置于超声波破碎仪中（3 mm 探头，频率 20 kHz），设置为 20% 振幅，进行三个循环（每个循环超声 30 s，暂停 1 min）。 
		注意：三个循环中输送的总能量约为 266 焦耳（每个循环约 80–110 焦耳）。在此步骤中，将离心管置于被冰包围的预冷金属块上。为避免探头过热，需在两个预冷金属块之间交替使用（备用的金属块也需保持在冰上冷却）。这两个金属块均于超声处理前一天预先在冰箱中预冷。</li>
		<li>以 12,000 x g 离心裂解液 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>用移液器收集上清液（细胞裂解液），转移至50 mL离心管中。</li>
		<li>将细胞裂解液在37 °C、200 rpm振荡条件下孵育80分钟。</li>
		<li>以 12,000 x g 离心裂解液 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
		<li>收集上清液，分装至预冷的1.5 mL离心管中，每管30 µL，并将所有离心管置于冰上。</li>
		<li>将裂解液分装样品在干冰上速冻，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 线性DNA的无细胞缓冲液校准
注意：无细胞缓冲液的镁葡萄糖酸盐（Mg-glu）和钾葡萄糖酸盐（K-glu）浓度已根据 Sun 等人13所述方法进行优化校准。校准步骤需要使用补充文件 1。每个反应体系最终体积设定为 10.5 µL。提取物使用 1 nM 的线性 DNA（见下文第 4 节）或质粒 DNA 进行校准。实验可在缓冲液配制当天进行，也可将配制好的缓冲液于 -80 °C 冻存，以便在其他时间进行实验。所有校准步骤中，各组分均需先在冰上解冻，再混合并移液至 384 孔板中。
<ol>
	<li>根据 Excel 文件 Supplementary File 1 中的“缓冲液制备”标签页，配制主混合液，包含以下组分：(a) 细胞提取物（占总反应体积的 33%），(b) 报告基因 DNA（线性 DNA 和/或质粒 DNA），终浓度为 1 nM，(c) 无细胞缓冲液（含 PEG8000、氨基酸溶液和能量溶液），以及 (d) K-glu，终浓度为 80 mM。</li>
	<li>对于 10.5 µL 的反应体系，取不同浓度的 10 倍浓缩 Mg-glu 储存液 1.05 µL（占总反应体积的 10%）（终浓度范围：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15 和 20 mM），加入 9.45 µL（占总反应体积的 90%）主混合液，轻轻混匀。 
	注意：使用 PCR 八联管配制稀释液，并用多通道移液器混匀。如有需要，可使用其他范围的 Mg-glu 浓度。</li>
	<li>将上述反应液各取 10 µL 加入 384 孔平底微孔板中，用粘性封板膜密封后，在 30 °C 条件下以 307 cpm 连续振荡孵育 8 小时，定期（例如每 5 分钟）使用酶标仪（激发波长：485 nm；发射波长：528 nm）检测基因表达产生的荧光信号。记录荧光数据。 
	注意：如需，在开始数据采集前可将 384 孔板短暂离心（&#60;2,500 × g，1 分钟，室温）。&#160;采用终点检测法比较不同缓冲液组成下的 GFP 表达水平。荧光值可转换为标准化单位用于作图（见下文）。</li>
	<li>确定在反应终点产生最高荧光值的 Mg-glu 浓度。 
	注意：若对所获得的最佳 Mg-glu 浓度不确定，可使用更广泛的浓度范围重复步骤 3.2。</li>
	<li>在确定最佳 Mg-glu 浓度后，进行 K-glu 浓度梯度校准（浓度范围：20、40、60、80、100、120、140、160、180、200、220 和 240 mM），反应体积同步骤 3.2 所示。运行实验并确定在测试的 K-glu 浓度中产生最高荧光值的条件。该结果即为此裂解液的最佳 Mg-glu 和 K-glu 缓冲液组成。 
	注意：若对所获得的最佳 K-glu 浓度不确定，可使用更广泛的浓度范围重复该步骤。</li>
	<li>在确定 Mg-glu 和 K-glu 的最佳浓度后，根据所需批量体积配制优化缓冲液的储存管。参考 Supplementary File 1&#160; 中的“缓冲液制备”标签页计算所需缓冲液管数，每管分装 38 µL，于 -80 °C 保存。</li>
</ol>
4. 线性DNA的制备
注意：裂解液校准使用质粒 P70a-deGFP。该质粒保存于大肠杆菌（E. coli）KL740 cl857+（表6）中，采用质粒小提试剂盒进行小量提取，或采用质粒大提试剂盒进行大量提取。在无细胞反应中用作表达模板的线性DNA片段，通过 表7 和 表8 所列的引物和模板经PCR扩增获得。
<ol>
	<li>使用 表7 中列出的寡核苷酸引物，以P70a-deGFP质粒为模板，利用DNA聚合酶进行PCR扩增。按照制造商的说明，在50 µL反应体系中设置PCR反应，热循环程序如下：[98 °C 预变性2 min；40个循环 × (98 °C 变性30 s → 66 °C 退火30 s → 72 °C 延伸60 s)；72 °C 延伸10 min；4 °C 保存 ∞]。</li>
	<li>向每50 µL PCR反应体系中加入1 µL DpnI限制性内切酶，消化模板DNA，并在37 °C孵育1小时。随后，使用PCR &amp;#38; DNA纯化试剂盒纯化PCR产物，并用无核酸酶水洗脱。</li>
	<li>使用1%琼脂糖凝胶（1x TAE缓冲液）对PCR产物进行电泳检测，确认产物正确后再进行后续使用。</li>
	<li>使用Nanodrop（ND-1,000）对纯化后的PCR产物（或质粒制备物）进行定量。 
	注意：若使用的DNA聚合酶/缓冲液体系可直接兼容下游的无细胞反应，则可完全省略纯化步骤（步骤2），改用基于DNA结合染料的荧光定量法测定未纯化DNA的浓度（参见Batista等10）。</li>
</ol>
5. 实验执行
注意：除了使用补充文件1&#160;对每批制备的裂解液缓冲液原液进行校准（如上所述）外，还建议使用该文件中的“反应准备”标签页来设置后续的无细胞反应。与之前相同，每个反应体系的体积设定为10.5 µL，其中仅10 µL最终被移取至384孔板中用于数据采集。此处，每种模板使用5 nM进行无细胞表达。移液操作时应保持一致——使用同一支移液器及同类型吸头。加样时需小心操作，避免孔中产生气泡或液体粘附在孔壁上。如有需要，可对孔板进行短暂离心（&#60;2,500 × g，1分钟，室温）。
<ol>
	<li>在补充文件1的“反应准备”标签页中输入样品描述及每个样品所需的重复次数，以计算需移液的体积。 
	注意：如果需要的反应体积不是10.5 µL，也可在补充文件1中输入该数值。文件将自动计算所需解冻于冰上的已优化缓冲液母液管数和细胞提取物管数。</li>
	<li>为最优主混合液（分别针对线性DNA和质粒DNA）的制备标记一个1.5 mL微量离心管，加入正确体积的缓冲液和裂解液，并轻轻混匀。 
	注意：由于缓冲液中最佳K-glu浓度存在差异，应分别创建“反应准备”标签页的副本&#160;以&#160;分别用于线性DNA和质粒DNA。</li>
	<li>先移取DNA样品，随后加入无核酸酶水，最后加入步骤5.2中的最优主混合液（MM）。在将反应液加入酶标仪前，用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。 
	注意：可使用PCR八联管为额外的重复反应混合总体积。例如，若需进行三次技术重复，可配制四份反应的混合液，并在管中保留一定死体积，以便在向酶标板加样时减少移液误差。</li>
	<li>在酶标仪中设置反应条件（激发波长485 nm；发射波长528 nm）。动力学检测以固定时间间隔（例如5分钟）记录荧光数据，共孵育8小时，温度为30 °C，并以307 cpm持续轨道振荡。 
	注意：终点测量结果以8小时时间点的数据表示。采集的荧光值单位为任意单位（a.u.），但可转换为标准化单位用于作图（见下文）。</li>
</ol>
6. FITC 与 GFP 的相对定量
注意：GFP 表达由酶标仪以任意荧光单位（a.u.）导出。然而，为了在不同实验条件（批次、设备、操作人员和实验室）之间比较荧光值，建议使用标准化的测量单位。本文提供了详细的步骤，通过 NIST-FITC 和重组 eGFP 的标准曲线，将荧光值（a.u.）转换为 FITC 等效值和 eGFP（µM）值。NIST-FITC 储存液应保存在 4 °C，重组 eGFP 应保存在 -20 °C。确保储存液和系列稀释液避光保存。收到试剂后，建议将重组 eGFP 分装成小体积，以避免多次冻融循环。
<ol>
	<li>配制 100 mM 硼酸钠溶液，pH 9.5，室温或 4 °C 保存。</li>
	<li>使用硼酸钠溶液将可溯源至美国国家标准与技术研究院（NIST）的 FITC 标准品原液（50 µM）稀释成 12 个浓度梯度（每个 70 µL），每步 2 倍稀释（50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781、0.390、0.195、0.097、0.048 和 0 µM），用于绘制标准曲线。每个稀释系列设置三个重复。</li>
	<li>参照步骤 6.2，使用硼酸钠溶液对重组 eGFP 进行系列稀释（每个 70 µL）（1.2、0.3、0.075、0.0188、0.0047、0.0012、0.0003、0.00007 和 0 µM）。摩尔浓度计算时需考虑蛋白全长（28 kDa）及纯化 eGFP 的浓度（1 g/L）。每个稀释系列设置三个重复。</li>
	<li>将各稀释液 20 µL 加入 384 孔平底微孔板中（每种稀释液三个孔，共九孔 = 三个稀释系列 × 三个技术重复），用粘性板封膜密封后，在酶标仪中孵育并进行检测。 
	注意：此处使用的检测参数为激发波长 485/20，发射波长 528/20，增益为 50。但也可采用其他波长/增益组合，以校准其他荧光分子和/或增益设置。为计算转换因子，必须使用相同的波长和增益设置来获取无细胞实验中的 GFP 荧光数据和标准曲线数据。</li>
	<li>使用线性信号范围（此处示例为 [FITC] ≤ 0.781 µM）拟合每种条件下的斜率 [y = ax 和 R2]。 
	注意：线性范围可能因所用仪器和标准溶液的不同而有所差异。</li>
	<li>保存 FITC 和 eGFP 的校准数据，用于实验室内部相对测量的计算，参考表 9中的示例。将测得的荧光任意单位（a.u.）数值除以标准曲线的斜率 &#34;a&#34; 值（y = ax），以估算相当于 FITC 或 eGFP 的 GFP 产量。</li>
</ol>

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本文表明，使用基因组中缺失 recB 或 recBCD 操纵子的 E. coli BL21 Rosetta2 制备的细胞裂解液，能够支持线性DNA模板的高效蛋白表达。本方案详细阐述了针对线性DNA模板的裂解液校准步骤（图2），该步骤对于在线性DNA上实现σ70启动子的高水平表达至关重要，当DNA浓度等摩尔时，其表达水平可接近质粒水平。本方案强调了根据最终应用中所使用的DNA类型（线性或质粒）对缓冲体系进行校准的重要性。
该方案可避免质粒克隆，从而在时间和成本上实现显著节约。线性DNA片段可由商业供应商合成和/或在实验室通过PCR扩增获得。若使用质粒DNA，相同过程将至少多耗时一周，需考虑克隆、序列验证及DNA制备等步骤10。建议制备大量细胞提取物和线性DNA模板，以尽量减少实验间批次差异14,15。...

无细胞蛋白质合成（CFPS）系统正日益被用作生物传感器工程、分布式制造以及遗传回路原型设计的一种快速、简单且高效的方法1。由于其巨大的潜力，CFPS系统在合成生物学领域得到了广泛应用。然而，迄今为止，CFPS系统依赖于环状质粒，这可能限制该技术充分发挥其潜力。质粒DNA的制备需要在&#160;克隆和&#160;大量DNA分离过程中完成多个耗时的步骤。相比之下，通过PCR从质粒或合成的DNA模板扩增，可在数小时内简便地制备CFPS模板2,3。因此，线性DNA的应用为CFPS提供了一种有前景的解决方案。然而，线性DNA会被细胞提取物中天然存在的外切核酸酶迅速降解4。已有若干方法可解决这一问题，例如使用λ噬菌体GamS蛋白5或含有Chi位点的DNA6作为保护剂，或通过化学修饰线性DNA末端直接进行保护2,7,8,9。所有这些方法都需要向细胞提取物中额外添加组分，成本较高且耗时。长期以来已知外切核酸酶V复合物（RecBCD）可在细胞裂解液中降解线性DNA4。最近，我们证明了在缺失外切核酸酶基因（recBCD）的细胞裂解液中，线性DNA可得到更有效的保护10。
在此方案中，制备无细胞裂解液的步骤包括从 E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 通过超声波裂解进行菌株处理的详细方法已作描述。超声波裂解是一种常见且经济的技术，已被多个实验室采用。11,12该菌株制备的提取物无需添加任何额外组分或对DNA模板进行修饰，即可支持线性DNA模板的表达。该方法依赖于缓冲液优化这一关键步骤，旨在针对该菌株天然来源的细胞提取物，特异性地实现线性DNA表达 E. coli 启动子。研究表明，针对线性DNA表达的这一特定缓冲体系优化，是实现天然σ70启动子高效蛋白表达的关键，即使不添加GamS蛋白或Chi DNA，甚至无需纯化PCR产物，也能获得高水平的蛋白质产量。10Mg-glu 对线性DNA表达的最适浓度与质粒DNA相似。然而，K-glu 的最适浓度在线性DNA与质粒DNA之间表现出显著差异，这可能归因于转录相关的机制。10通过该方法表达的蛋白质功能已在多个应用中得到验证，例如趾头开关（toehold switches）的快速筛选以及酶突变体活性的评估10.
本方案通过使用突变型 ΔrecBCD 细胞提取物以及针对线性DNA模板的特定校准方法，为在大肠杆菌（E. coli）无细胞系统中使用线性DNA模板提供了一种简单、高效且经济的解决方案。

<table><tbody><tr><td>2-YT 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL Safe-Lock 管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>1.5 mL 微量离心管</td></tr><tr><td>384孔方底微孔板</td><td>赛默飞世尔科技 Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA（D-(-)-3-磷酸甘油酸二钠）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>粘性板密封膜</td><td>赛默飞世尔科技 Nunc</td><td>232701</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP（腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>默克密理博</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &amp;Delta;recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 &amp;Delta;recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP（腺苷3'，5'-单磷酸）</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>辅酶A（辅酶A水合物）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>康宁 15 mL 聚丙烯离心管，带CentriStar盖，架装，无菌</td><td>康宁</td><td>430790</td><td>15 mL 离心管</td></tr><tr><td>康宁50 mL聚丙烯离心管，锥形底，带CentriStar盖，无菌</td><td>康宁</td><td>430828</td><td>50 mL 离心管</td></tr><tr><td>CTP（胞苷5'-三磷酸二钠盐水合物）</td><td>Alfa Aesar</td><td>&amp;nbsp;J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT（DL-二硫苏糖醇）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>亚叶酸（固态亚叶酸钙盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP（鸟苷-5'-三磷酸，&amp;nbsp; 二钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;H3375</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾（K2HPO4）</td><td>卡尔·罗斯（Carl Roth）</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（H2KO4P）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-谷氨酸盐</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-谷氨酸盐&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP 注射器滤器，0.22 μm &amp;micro;聚醚砜，m</td><td>默克密理博</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22 微米膜滤器 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Monarch PCR &amp;amp; DNA 纯化试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR &amp;amp; DNA 纯化试剂盒</td></tr><tr><td>Monarch 质粒小提试剂盒</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>质粒小提试剂盒</td></tr><tr><td>NAD（B-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物）&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>可溯源至美国国家标准与技术研究院的荧光素标准</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi 试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>质粒大量提取试剂盒</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Biotek&amp;nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>纯化的重组EGFP蛋白</td><td>Chromotek</td><td>egfp-250</td><td>重组 eGFP</td></tr><tr><td>Q5 高保真 2X 预混液</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>DNA聚合酶</td></tr><tr><td>Q5 高保真 2X 预混液</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492L</td><td>DNA聚合酶</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Q32850</td><td>使用DNA结合染料的荧光测定法</td></tr><tr><td>RTS 氨基酸样本试剂盒</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>亚精胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td></td><td></td><td>来自 Millipore RiOs 8 系统的纯化水，经高压灭菌处理。</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>生命科学产品 Cytiva</td><td>17-1321-01&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>罗氏</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>超声波处理器 Vibra cell VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>超声波破碎仪</td></tr><tr><td>UTP Na3（尿苷-5'-三磷酸三钠盐水合物）</td><td>Acros Organics&amp;nbsp;</td><td>226310010</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>R0581</td><td>无核酸酶水</td></tr></tbody></table>

利用线性dna模板和核酸外切酶缺陷型细胞提取物进行无细胞蛋白质合成

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

无细胞蛋白合成（cell-free protein synthesis, CFPS）由于具有多种优势，近年来在合成生物学领域受到广泛关注。采用线性DNA模板进行CFPS可进一步释放该技术的全部潜力，通过省去克隆、转化和质粒提取等步骤，显著缩短实验周期。线性DNA可通过PCR快速、简便地扩增，获得高浓度的模板，避免潜在的 体内 表达毒性。然而，线性DNA模板会被细胞提取物中天然存在的外切核酸酶迅速降解。已有多种策略被提出以解决这一问题，例如添加核酸酶抑制剂或对线性DNA末端进行化学修饰以提供保护。这些策略均需额外的时间和资源，且尚未达到接近质粒水平的蛋白质表达量。本文提供了一种替代策略的详细方案，用于在无细胞蛋白表达系统（CFPS）中使用线性DNA模板。通过采用外切核酸酶缺陷型基因敲除细胞制备的细胞提取物，线性DNA模板可保持完整，无需任何末端修饰。本文介绍了从外切核酸酶缺陷型细胞制备细胞裂解物的步骤 大肠杆菌 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 通过超声裂解和缓冲液校准，针对线性DNA特异性地优化Mg-谷氨酸盐（Mg-glu）和K-谷氨酸盐（K-glu）条件。该方法能够实现与质粒DNA相当的蛋白质表达水平 大肠杆菌 CFPS

在分别针对线性DNA和质粒DNA优化裂解液中Mg-谷氨酸和K-谷氨酸水平后，得到的代表性结果如图所示（图1）。在ΔrecB和ΔrecBCD提取物中，Mg-谷氨酸的最适浓度相似，均为8 mM（图1B）。然而，对于同一提取物，质粒DNA的最适K-谷氨酸浓度为140 mM，而线性DNA的最适K-谷氨酸浓度则为20 mM（图1C）。在对来自野生型（WT）和ΔrecBCD细胞的提取物中GFP表达进行比较分析时发现，必须针对在缺乏核酸外切酶V的提取物中所使用的线性DNA和质粒DNA，专门优化提取物的缓冲液组成，以实现最佳表达效果。
经过校准步骤后，比较了野生型（WT）和 ΔrecBCD 提取物中来自线性DNA和质粒DNA（5 nM）的GFP表达水平（图1D）。在线性DNA中，GFP表达水...

本文介绍了一种用于制备外切酶V基因敲除菌株细胞提取物及其缓冲液校准的实验方案 大肠杆菌 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 和 ΔrecB这是一种利用线性DNA模板在无细胞蛋白合成系统中进行表达的快速、简便且直接的方法。

利用线性DNA模板和核酸外切酶缺陷型细胞提取物进行无细胞蛋白质合成

无细胞蛋白合成（CFPS）由于具有多种优势，近年来在合成生物学领域受到广泛关注。使用线性DNA……

该方案具有重要意义，因为它能够实现线性DNA模板在无细胞蛋白质合成系统中的快速、简便和直接使用，甚至可直接利用天然的大肠杆菌参数。其主要优势在于避免了克隆步骤、对线性DNA末端进行化学修饰以及添加保护性补充物（如γ或χ DNA），从而节省了大量时间。随着针对不同目标生物开发出自报告合成提取物，我们的方法为在这些提取物中利用线性DNA加速原型构建提供了一条有效途径。首先，从–80摄氏度的甘油菌种中挑取BL21 Rosetta-2 delta recBCD菌株，在含有10微克/毫升氯霉素的2x YTP琼脂平板上划线，于37摄氏度培养过夜。然后，挑取琼脂平板上的单菌落，接种至略多于40毫升的、添加了10微克/毫升氯霉素的2x YTP培养基中，于37摄氏度、200 RPM振荡培养过夜。接着，将过夜培养物按1:100比例稀释，接种至四升新鲜的、含有10微克/毫升氯霉素的2x YTP培养基中，进行二次培养。将四升培养基分装到四个独立的烧瓶中。在37摄氏度、200转/分钟的条件下培养约三至四小时，使菌液光密度达到1.5至2.0。将培养物置于冰上，于4摄氏度、5,000 G离心12分钟，然后通过倾倒弃去上清液。然后，用 800 毫升预冷的含 DTT 的 S30A 重悬细胞沉淀。再次于 4 °C、5,000 ×g 离心 12 分钟（如前所述），倾倒弃去上清液。将细胞沉淀用 160 毫升预冷的含 DTT 的 S30A 重悬后，转移至预冷并预先称重的 50 毫升离心管中。在4 °C条件下，以2000 ×g离心8分钟，使细胞沉淀，然后通过倾倒弃去上清液。再次在4 °C条件下，以2000 ×g离心4分钟，随后用移液器小心去除残留的上清液。接着，重新称量离心管的重量以计算细胞沉淀的重量，并将细胞沉淀保存于-80 °C环境中。从负80摄氏度取出细胞沉淀后，将其置于冰上解冻一至两小时，并按每克细胞沉淀加入0.9毫升含DTT的S30A缓冲液重悬细胞沉淀。然后缓慢吹打混匀以重悬细胞，尽量避免产生泡沫。将重悬后的细胞液每1毫升分装至1.5毫升微量离心管中，并置于冰上或4摄氏度预冷的金属块上保存。接下来，将每根离心管置于超声破碎仪中，设置超声参数为20%的振幅，进行三个循环的超声处理，然后在4°C条件下以12,000 G离心10分钟。用移液器收集上清液后，转移至50毫升离心管中。将细胞裂解液在37°C、200 RPM振荡条件下孵育80分钟。将裂解液离心后，收集上清液至预冷的1.5毫升微量离心管中，同时将所有管子置于冰上。取30微升上清液分装至预冷的PCR 8联管中，分装过程中保持管子在冰上。用干冰迅速冷冻裂解液分装样品，并于-80摄氏度保存。根据文稿中所述的缓冲液配制标签，配制主混合液。对于10.5微升的反应体系，加入1.05微升不同浓度的Mg-谷氨酸母液和9.45微升的预混液，轻轻混匀。将上述反应液各10微升移入384孔方形底微孔板中，并使用粘性板封膜密封。在30°C条件下孵育8小时，同时以每分钟307转持续轨道振荡，使用酶标仪定期记录荧光数据，以检测基因表达的荧光信号输出。在确定产生终点最高荧光值的 Mg-谷氨酸浓度后，继续进行 K-谷氨酸校准。运行实验并从所测试的 K-谷氨酸浓度中确定最高的荧光值，从而确定该裂解液中 Mg-谷氨酸和 K-谷氨酸的最佳缓冲液组成。在确定 Mg-谷氨酸和 K-谷氨酸的浓度后，根据所得批次体积配制含有优化缓冲液组成的工作储备管。计算所需缓冲管的数量后，每管分装 38 微升，并于 -80 摄氏度保存。首先，标记一个 1.5 毫升的微量离心管，用于配制最佳主混合液。加入适量体积的缓冲液和裂解液，并轻轻混匀。然后，先移取DNA样品，接着加入无核酸酶水，最后加入最佳的预混液。在将反应液加入酶标仪之前，用移液器轻轻混匀无细胞反应体系，避免产生气泡。在酶标仪中设置好反应后，于30摄氏度孵育8小时，同时以每分钟307个循环的速度持续进行圆周振荡，期间定期记录荧光动力学数据。在对裂解液进行校准后，线性DNA和质粒DNA在不同提取物中的谷氨酸镁最适浓度均相似，为8毫摩尔。然而，质粒DNA的谷氨酸钾最适浓度为140毫摩尔，而线性DNA的谷氨酸钾最适浓度为20毫摩尔。在校准步骤完成后，比较了野生型、ΔrecB和ΔrecBCD提取物中线性DNA与质粒DNA的GFP表达水平。线性DNA在delta recB和delta recBCD菌株提取物中的GFP表达量分别达到质粒DNA表达量的102%和138%。该实验方案中最关键的步骤是细胞的超声波裂解，以及针对线性DNA和质粒DNA分别进行的缓冲液校准，尤其是在使用天然参数时。该技术将有助于加快在无细胞系统中对生物设计的测试，例如生物传感器、酶和代谢通路的筛选，或合成基因线路的原型构建。

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