Name: 通过邻近连接和定量PCR检测酿酒酵母同源重组中间体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学习利用邻近连接与定量PCR技术检测酿酒酵母同源重组中的D-loop形成与延伸过程。该方法可无偏倚地定量分析重组中间体，为研究DNA修复机制提供重要工具。

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Heyer 实验室的工作获得了资助 GM58015 和 GM137751（授予 W.-D.H.）的支持。Piazza 实验室的研究得到了欧洲研究理事会（ERC-StG 3D-loop，资助协议编号 851006）的支持。D.R. 获得了 T32CA108459 和 A.P. Giannini 基金会的支持。我们感谢 Shih-Hsun Hung（Heyer 实验室）分享其 DLC/DLE 检测结果，并进一步验证了本方案中详述的检测方法的改进之处。

1. 生长前处理、DSB诱导及样品采集
注意：对于 Ade- 菌株，建议在所有培养基中添加 0.01% 腺嘌呤。
<ol>
	<li>在酵母蛋白胨葡萄糖腺嘌呤（YPDA）培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% 葡萄糖，2% 琼脂，0.001% 腺嘌呤）上划线接种适当的单倍体菌株（见表1），于30 °C培养2天。</li>
	<li>挑取单菌落接种至15 mL玻璃培养管中的5 mL YPDA液体培养基中，于30 °C振荡或旋转培养至菌液饱和，以保证充分通气。</li>
	<li>DLC检测：在通风橱中，将补骨脂素溶解于50 mL锥形管中（锥形管用铝箔包裹），加入无水乙醇配制0.5 mg/mL三氧沙仑（trioxsalen）的5倍浓缩储存液，室温下持续振荡或颠倒过夜。用透明封口膜密封螺口盖以防止蒸发。每个50 mL锥形管中配制的5倍补骨脂素储存液不得超过7 mL，以确保补骨脂素充分溶解。</li>
	<li>次日，取5 mL过夜YPDA培养物接种至适当大小的三角瓶中的50–100 mL YEP-乳酸盐培养基（1% 酵母提取物，2% 蛋白胨，2% w/w 乳酸钠，0.001% 腺嘌呤）中，初始OD600约为0.03（出芽酵母最适生长条件为培养液体积不超过三角瓶容量的1/5）。</li>
	<li>于30 °C、220 rpm振荡培养约16小时。约16小时后测定菌液OD600，应为0.5–0.8之间。避免使用生长不足或过度生长的菌液。</li>
	<li>针对每个时间点，取适量菌液转移至锥形管中并立即置于冰上。通常，DLC检测需收集1&#160;× 108个细胞（对于单倍体野生型菌株，约为OD600为1.0时的7.5 mL培养液），DLE检测需收集5 × 107&#160;个细胞（约为OD600为1.0时的2.5 mL培养液）。</li>
	<li>为确保OD600读数准确，当菌液OD600≥0.2时，应进行1:5稀释，使吸光度读数保持在0.2或以下。对于野生型菌株，DLC分析的最佳时间点为2至6小时，DLE分析的最佳时间点为4至8小时（见图3和图4）。</li>
	<li>DLC检测
	<ol>
		<li>在每个时间点前，在通风橱中用铝箔包裹的50 mL锥形管配制足量的1倍补骨脂素工作液（0.1 mg/mL trioxsalen，50 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM EDTA pH 8.0，20% 乙醇），置于室温备用。</li>
		<li>于4 °C、2,500 × g离心5分钟。在通风橱中将菌体沉淀重悬于2.5 mL 1倍补骨脂素工作液中，转移至60 mm × 15 mm的培养皿中。作为无交联对照，可将沉淀重悬于2.5 mL TE1溶液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM EDTA pH 8.0）中。</li>
		<li>进行交联处理。若使用配备长波（365 nm）紫外灯的交联仪，将培养皿去盖后置于预冷至−20 °C的塑料或有机玻璃板上，距离紫外光源1–2 cm；若使用紫外灯箱，则将培养皿直接置于紫外光源上方。在轻度振荡条件下照射10分钟。 
		注：建议将紫外光源置于设定为约50 rpm的轨道摇床上。</li>
		<li>在通风橱中将样品转移至新的15 mL离心管中。用2.5 mL TE1溶液冲洗培养皿，并将冲洗液加入离心管。于4 °C、2,500 × g离心5分钟，弃上清，将沉淀保存于−20 °C。样品可在下一步操作前保存最多1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DLE检测
	<ol>
		<li>于4 °C、2,500 × g离心5分钟。用2.5 mL预冷的TE1溶液洗涤菌体沉淀，再次离心后将沉淀保存于−20 °C。样品可在下一步操作前保存最多1周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于0小时时间点的样品，在加入20%半乳糖之前收集。对于后续时间点，通过向培养物中加入20%半乳糖至终浓度2%以诱导双链断裂（DSB）形成。按上述方法收集剩余样品，离心后根据DSB诱导后的时间点进行冷冻保存（例如，4小时样品为加入20%半乳糖后4小时收集）。</li>
</ol>
2. 细胞球状体破壁、裂解及限制性位点恢复
<ol>
	<li>将样品置于冰上解冻。将干浴器预热至 30 °C。</li>
	<li>用 1 mL 破壁缓冲液（0.4 M 山梨醇，0.4 M KCl，40 mM 磷酸钠缓冲液 pH 7.2，0.5 mM MgCl2）重悬样品，并转移至 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>加入 3.5 µL 酶解液（2% 葡萄糖，50 mM Tris-HCl pH 7.5，5 mg/mL Zymolyase 100T；终浓度为 17.5 µg/mL）。通过轻弹管壁或颠倒混匀。在 30 °C 下孵育 15 分钟，然后置于冰上。在 15 分钟孵育期间，准备液氮或干冰。</li>
	<li>在 4 °C 下以 2,500 x g 离心 3 分钟，并将样品置于冰上。用 1 mL 破壁缓冲液洗涤样品 3 次。每次在 4 °C 下以 2,500 x g 离心 3 分钟。</li>
	<li>用 1 mL 冷的 1x 限制性内切酶缓冲液（50 mM 醋酸钾，20 mM 醋酸-Tris，10 mM 醋酸镁，100 µg/mL BSA，室温下 pH ~8.0）重悬样品，并在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 3 分钟。将样品置于冰上。重复洗涤一次。</li>
	<li>用 1 mL 冷的 1x 限制性内切酶缓冲液重悬样品。将样品均分为两份（每份 0.5 mL），分别加入两个 1.5 mL 微量离心管中。在 4 °C 下以 16,000 x g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将每个样品的其中一管用含杂交寡核苷酸的 180 µL 1.4x 限制性内切酶缓冲液重悬，另一管用不含杂交寡核苷酸的 180 µL 1.4x 限制性内切酶缓冲液重悬（见表 2）。每种杂交寡核苷酸均用 1x TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0）溶解，使用终浓度为 7 nM。在不含杂交寡核苷酸的 1.4x 限制性内切酶缓冲液中，以 1x TE 替代杂交寡核苷酸。 
	注意：杂交寡核苷酸必须在 −20 °C 下以工作稀释浓度分装保存。杂交寡核苷酸的浓度可能需要优化；详见讨论部分。</li>
	<li>将样品在液氮或干冰/乙醇中快速冷冻，并于 −80 °C 保存。此阶段样品可保存数月。</li>
</ol>
3. 限制性内切酶消化与分子内连接
<ol>
	<li>将样品置于冰上解冻。将一个干浴器预热至 65 °C，另一个预热至 37 °C。</li>
	<li>在冰上，用移液器将 36 µL 样品转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。立即将剩余样品放回 −80 °C 保存。</li>
	<li>加入 4 µL 的 1% SDS（终浓度为 0.1%），通过轻轻敲击管壁混匀。在 65 °C 下孵育 15 分钟，每隔 5 分钟轻敲一次管壁。孵育结束后立即将样品置于冰上。 
	注意：此 SDS 处理步骤有助于使与 DNA 结合的蛋白质变性，溶解核膜，并提高染色质在限制性内切酶消化和分子内连接步骤前的可及性。</li>
	<li>加入 4.5 µL 的 10% Triton X-100（终浓度为 1%），通过移液混匀。向每个样品中加入 20–50 U 的限制性内切酶（EcoRI-HF 或 HindIII-HF），在 37 °C 下孵育 1 小时，每隔 20–30 分钟轻轻振荡一次。在此期间，将干浴器预热至 55 °C，并将水浴锅预设为 16 °C。</li>
	<li>向每个样品中加入 8.6 µL 的 10% SDS（终浓度为 1.5%），通过移液和轻敲管壁混匀。在 55 °C 下孵育 10 分钟。然后向每个样品中加入 80 µL 的 10% Triton X-100（终浓度为 6%），并通过移液混匀。</li>
	<li>向每个样品中加入 660 µL 不含 ATP 的 1× 连接缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8.0，10 mM MgCl2，10 mM DTT，2.5 µg/mL BSA）+ 1 mM ATP pH 8.0 + T4 DNA 连接酶（每样品 8 U），通过轻柔倒置混匀。在 16 °C 下孵育 1.5 小时，每隔 30 分钟倒置一次。孵育结束后立即将样品置于冰上。</li>
</ol>
4. DNA 纯化
<ol>
	<li>将一个干浴器预热至 65 °C，另一个预热至 37 °C。向每个样品中加入 1 µL 的 10 mg/mL 蛋白酶 K（用 1x TE pH 8.0 配制，终浓度为 12.5 µg/mL）。在 65 °C 下孵育 30 分钟，孵育结束后立即将样品置于冰上，直至冷却。</li>
	<li>将样品转移至 2 mL 离心管中。在通风橱内操作，向每个样品中加入等体积（约 800 µL）的苯酚/氯仿/异戊醇（P/C/IA；pH 8.0）。涡旋振荡样品约 30 秒，然后在微量离心机中以 16,000 x g 离心 5–10 分钟。</li>
	<li>小心吸取每个样品上层相的 600 µL 至新的 1.5 mL 离心管中。妥善处理下层相及 2 mL 离心管。</li>
	<li>通过向每个样品中加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2，约 60 µL），随后加入 1 体积的异丙醇（约 660 µL），沉淀 DNA。将样品颠倒混匀 5–10 次，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>将样品置于冰上 2 分钟，然后在微量离心机中以 16,500 x g 在 4 °C 下离心 15 分钟。将样品放回冰上，倒去上清液，并将离心管在纸巾上倒置沥干。</li>
	<li>用 200 µL 70% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。在 4 °C 下以 16,500 x g 离心 3 分钟，将样品放回冰上，倒去上清液，并用移液器除去残留乙醇。将管盖打开，在 37 °C 下干燥 15–20 分钟。</li>
	<li>用 50 µL 1x TE 缓冲液通过涡旋振荡重悬 DNA 沉淀。室温孵育 30 分钟，涡旋振荡，然后在干浴器中 37 °C 孵育 30 分钟。再次涡旋振荡样品，随后置于冰上。样品在此阶段可在 −20 °C 保存数月，但建议立即进行后续的脱交联（仅限 DLC）和 qPCR 步骤。</li>
</ol>
5. 补骨脂素交联逆转（仅用于 DLC 检测）
<ol>
	<li>将9 µL纯化DNA加入冰上的PCR管中，再加入1 µL 1 M KOH（终浓度为0.1 M）。将样品置于PCR仪中，90 °C孵育30分钟。</li>
	<li>加入19.73 µL乙酸钠溶液（0.1 M乙酸钠、9.6 mM Tris-HCl pH 8.0、1.0 mM EDTA pH 8.0）。样品在此阶段可于−20 °C保存数月，但建议立即进行qPCR步骤。</li>
</ol>
6. 定量 PCR、对照与分析
<ol>
	<li>使用 2 µL 纯化的 DNA（无论是否交联），根据制造商说明书配制 20 µL 的 qPCR 反应体系。每个反应设置两个复孔。对于 DLC 和 DLE 检测，每份样品均包含五个对照反应和一个 DLC/DLE 定量反应，共计六个反应，均需进行复孔检测。补充表 S1 和 补充表 S2 提供了这些反应设置与分析的模板，qPCR 引物序列列于 表 3 中。</li>
	<li>qPCR 循环条件需根据所使用的 qPCR 试剂盒进行优化。
	<ol>
		<li>根据所用 qPCR 试剂盒，采用以下 DLC qPCR 条件：初始变性（95 °C 持续 3 分钟）；50 个扩增循环（95 °C 持续 15 秒，61 °C 持续 25 秒，72 °C 持续 15 秒，单次信号采集）；熔解曲线分析（95 °C 持续 5 秒，65 °C 持续 1 分钟，97 °C 连续信号采集）；冷却（37 °C 持续 30 秒）。</li>
		<li>采用以下 qPCR 条件进行 DLE 检测：初始变性（95 °C 持续 5 分钟）；50 个扩增循环（95 °C 持续 15 秒，60 °C 持续 30 秒，72 °C 持续 15 秒，单次信号采集）；熔解曲线分析（95 °C 持续 5 秒，65 °C 持续 1 分钟，97 °C 连续信号采集）；冷却（37 °C 持续 30 秒）。请注意，不同 qPCR 仪器或试剂盒可能需要进行条件优化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DLC 检测
	<ol>
		<li>对照反应：qPCR 引物列表见 表 3。引物结合位点图示见 图 S1。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查阅 A 质粒编辑器（ApE）文件；补充序列文件 1-5。
		<ol>
			<li>ARG4 位点的基因组 DNA：使用 olWDH1760/olWDH1761 扩增位于 ARG4 的双链 DNA。将此反应作为上样对照&#160;，并将除 DLC 信号反应外的所有其他反应均归一化至该对照。</li>
			<li>DAP2 位点的分子内连接效率：使用 EcoRI 消化产生的 1,904 bp 片段，与 DLC 连接反应平行进行分子内连接。扩增该连接位点可报告分子内连接效率，并作为 DLC 信号归一化的对照。</li>
			<li>DSB 诱导：使用 olWDH1766/olWDH1767 扩增跨越诱导 DSB 的区域。</li>
			<li>补骨脂素交联与切除：使用 olWDH2019/olWDH2020 扩增位于 EcoRI 识别位点下游的独特 PhiX 区域。在不逆转交联的情况下，通过单链 DNA（无交联）与 ARG4（交联双链 DNA）信号的比值确定交联效率；在逆转交联后，随着切除进行，相对于 ARG4 的信号将从 1 逐步下降至 0.5。</li>
			<li>EcoRI 识别位点的恢复与切割：使用 olWDH1768/olWDH1764 扩增跨越 DSB 上游切除链上恢复的 EcoRI 识别位点的区域。使用 olWDH1769/olWDH1763 扩增跨越 DAP2 位点 EcoRI 限制性内切酶识别位点的区域。在该位点进行 EcoRI 切割，作为分子内连接的对照。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>DLC 信号：使用 olWDH1764/olWDH1765 扩增由切除（侵入）链与供体链发生分子内连接所形成的嵌合 DNA 分子。</li>
		<li>数据分析：计算每个复孔反应 Cp 值的平均值和标准差。以 ARG4 基因组 DNA qPCR 的 Cp 值为参考，对所有其他对照 qPCR 进行归一化。将 DLC 信号归一化至 DAP2 位点的分子内连接对照。典型的 2 小时 DLC 信号值见 图 3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DLE 检测
	<ol>
		<li>对照反应：qPCR 引物列表见 表 3。引物结合位点图示见 图 S1。有关相关基因组特征和扩增子的补充序列文件，请查阅 A 质粒编辑器（ApE）文件（补充序列文件 1-5）。
		<ol>
			<li>ARG4 位点的基因组 DNA：参见第 6.3.1.1 节。</li>
			<li>YLR050C 位点的分子内连接效率：使用 HindIII 消化产生 765 bp 片段，与 DLE 连接反应平行进行分子内连接。扩增该连接位点可报告分子内连接效率，并作为 DLE 信号归一化的对照。</li>
			<li>DSB 诱导：参见第 6.3.1.3 节。</li>
			<li>HindIII 识别位点的恢复与切割：使用 olWDH2010/olWDH2012 和 olWDH2009/2011 分别扩增断裂链上已被切除和延伸区域所跨越的 HindIII 限制性内切酶识别位点。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>DLE 信号：使用 olWDH2009/olWDH2010 扩增由 DSB 上游侵入链的切除末端与 DSB 下游新延伸末端发生分子内连接所形成的嵌合 DNA 分子。</li>
		<li>数据分析：计算每个复孔反应 Cp 值的平均值和标准差。以 ARG4 基因组 DNA qPCR 的 Cp 值为参考，对所有其他对照 qPCR 进行归一化。将 DLE 信号归一化至 YLR050C 位点的分子内连接对照。典型的 6 小时 DLE 信号值见 图 4 及先前发表的文献9。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).</li>
<li>Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+recombination+and+genomic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of recombination and genomic maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中介绍的检测方法可用于检测新生和延伸的D环（DLC检测）、D环延伸（DLE检测）以及BIR产物的形成（无杂交寡核苷酸的DLE检测），这些方法基于邻近连接与定量PCR（qPCR）。此前，通过ChIP-qPCR检测远离DSB位点的Rad51结合已被用作Rad51介导的同源性搜索及D环形成的间接指标。然而，该ChIP-qPCR信号并不依赖于断裂位点与潜在供体之间的序列同源性，也不依赖于Rad51相关因子Rad54，因此更可能反映的是Rad51-ssDNA丝状体与dsDNA之间的瞬时结合，而非D环中间体10,11。相比之下，DLC信号依赖于DSB的形成、Rad51、Rad52、Rad54以及被检测的DSB位点与供体位点之间的序列同源性8。此外，在缺失Mph1和Srs2解旋酶以及Sgs1-Top3-Rmi1解旋酶-拓扑异构酶复合物的情况下，DLC信号增强，这与先前报道一致，即这三个因子可在体外拆解由Rad51/Rad54形成的新生D环in vitro<sup ...

同源重组（HR）是一种高保真性的DNA双链断裂（DSBs）、链间交联和单链DNA空隙修复机制，同时也是DNA损伤耐受的一种途径。与易错的DNA损伤修复/耐受途径（如非同源末端连接（NHEJ）和跨损伤合成）不同，HR利用完整且同源的双链DNA作为模板来指导修复过程。此外，HR通路中的许多关键中间产物具有可逆性，从而实现对各个通路步骤的精细调控。在细胞周期的S期、G2期和M期，HR与NHEJ竞争修复双端DSBs1。此外，HR对于DNA复制过程至关重要，可用于修复与复制相关的DNA损伤，包括单链DNA空隙和单侧DSBs，并作为DNA损伤位点绕过的机制之一2。
同源重组（HR）途径中的一个关键中间体是置换环，即D-loop（图1）。在DNA末端切除后，该反应的核心重组酶Rad51会结合到断裂分子新生成的单链DNA（ssDNA）上，形成螺旋状丝状结构2。随后，Rad51执行同源性搜索，以识别合适的同源模板，通常为体细胞中的姐妹染色单体。当Rad51-ssDNA丝状体侵入一段同源双链DNA时，即形成D-loop，此时断裂链通过与供体链的互补链进行沃森-克里克碱基配对，导致供体双链中相对的另一条链被置换出来。随后，DNA聚合酶延伸断裂链的3'末端，填补DNA损伤过程中丢失的碱基，并通过合成依赖性链退火（SDSA）、双Holliday连接（dHJ）或断裂诱导复制（BIR）等HR亚途径，促进延伸后的D-loop中间体最终生成双链DNA（dsDNA）产物。
通过物理手段监测同源重组（HR）通路中间产物的实验方法，可实现对每一步骤遗传学需求的分析（即通路分析）。DNA双链断裂（DSB）的形成、末端切除、双Holliday连接体（dHJs）、BIR复制泡以及HR产物均可通过Southern印迹法清晰观察到。3,4,5,6,7然而，Southern印迹法无法检测新生和延伸的D-环，因此需要一种替代方法来可靠地测量这些连接分子4,8,9分析新生D-loop形成的常用策略之一是Rad51的染色质免疫沉淀（ChIP）联合定量PCR（qPCR）10,11然而，通过ChIP-qPCR检测到的Rad51与dsDNA的结合不依赖于序列同源性，也与Rad51的辅助因子Rad54无关10,11相比之下，采用本文所述的D-loop分析方法（称为D-loop捕获（DLC）检测）获得明显信号依赖于DSB的形成、序列同源性、Rad51以及Rad51辅助蛋白Rad52和Rad54。8。这一发现表明 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） Rad51 介导的 D 环形成依赖于 Rad54 体内 是&#160;与大量研究结果一致 体外 重组实验表明，芽殖酵母 Rad51 进行同源搜索和 D-loop 形成需要 Rad54 的参与8,12,13,14,15.
目前通过半定量PCR检测D-loop延伸的方法同样存在诸多问题。一种典型的基于PCR的检测D-loop延伸的实验方法是扩增一段独特序列，该序列来源于断裂位点与异位供体之间的重组以及随后伴随重组发生的DNA合成。 通过 断裂链同源区上游的一个引物和供体链同源区下游的另一个引物。利用该方法，重组相关DNA合成的检测依赖于非必需的Pol δ持续合成因子Pol3216这一发现与以下观察结果相矛盾： POL32 缺失对基因转换仅有轻微影响 体内17此外，这些基于PCR的检测方法无法在时间上区分D-loop延伸与BIR产物的形成，表明所检测到的信号来源于双链DNA产物，而非单链DNA中间体17,18,19D-loop延伸（DLE）实验最近被开发用于解决这些差异。DLE实验可定量初始3'侵入端下游约400个碱基对（bp）处的重组相关DNA合成9通过该方法，D-环延伸不依赖于Pol32，且在DSB诱导后4小时内即可检测到，而BIR产物则在6小时后首次出现。事实上，Haber与Malkova实验室最近发表的一项研究指出，采用此种基因组DNA制备方法可特异性地实现单链DNA的保存。9,20.
在此详细描述了DLC和DLE检测方法。这些检测方法依赖邻近连接技术来检测新生和延伸的D环结构 S. cerevisiae (图2)8,9BIR产物可使用相同的检测系统进行定量。对于这两种检测，均可在HO内切酶切割位点处检测DSB的形成，该位点位于 URA3 位于5号染色体（Chr. V）上的位点在半乳糖诱导型启动子控制下，由HO内切酶的表达所诱导。Rad51介导的DNA链侵入导致在异位供体位点处形成新生的D-loop，该供体位于 LYS2 位于2号染色体上的位点。由于DSB的右侧与供体序列缺乏同源性，因此修复 通过 SDSA 和 dHJ 的形成不可行。虽然 DSB 的初始修复可通过 BIR 进行，但着丝粒的存在会抑制 viable 产物的形成21这种刻意的设计可阻止DSB的有效修复，从而避免已修复DSB的细胞恢复生长，否则这些细胞可能在时间过程分析期间过度占据培养体系。
在DLC检测中，psoralen对D-loop内异源双链DNA的两条链进行交联，从而稳定重组中间体。在断裂（被切除）链上的限制性酶切位点恢复并经酶切消化后，交联作用使得断裂DNA与供体DNA同源区上游的特有序列能够连接。通过qPCR定量每个样本中嵌合DNA分子的含量。在DLE检测中，无需交联步骤，通过限制性酶切位点的恢复和酶切，随后进行分子内连接，将断裂分子的5'端与新延伸的3'端连接。同样使用qPCR定量各样本中该嵌合产物的相对含量。若不进行限制性酶切位点的恢复，DLE检测则可反映D-loop延伸后形成的BIR（双链DNA）产物的相对水平。
展示了使用野生型菌株进行每种检测的代表性结果，读者可参考 Piazza 等人8 和 Piazza 等人9 了解这些检测方法在重组突变体分析中的应用8,9。本研究的目的是使其他实验室能够采用 DLC 和 DLE 检测方法，如有需要可提供相关支持。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. 预培养、DSB诱导及样品收集&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 和 50 mL 锥形管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 玻璃培养管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL、500 mL 或 1 L 三角瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm × 15 mm 平底光学透明培养皿</td><td></td><td></td><td>推荐：Corning，货号 430166；或 Genesee Scientific，货号 32-150G</td></tr><tr><td>配备 15 mL 和 50 mL 锥形管适配器的台式离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台式轨道摇床或管旋转仪/转盘</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋转仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备 365 nm 紫外灯管并置于轨道摇床上的紫外交联仪或紫外灯箱</td><td></td><td></td><td>推荐：Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker（Spectronics Corporation）或 Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK，货号 611110831</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% w/w 乳酸钠（DL-型）糖浆</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1375</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher</td><td>BP1423500</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>蛋白胨（Bacto peptone）</td><td>BD Difco</td><td>211840</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto yeast extract）</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>BD Difco</td><td>0155-17-4</td><td>用于培养基制备</td></tr><tr><td>补骨脂素（Trioxsalen）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137</td><td>用于补骨脂素交联</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. 原生质球制备、裂解及限制性酶切位点恢复&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>干浴器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>液氮或干冰/乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冷微量离心机或普通微量离心机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X 限制性内切酶（CutSmart）缓冲液（500 mM 醋酸钾，200 mM Tris-醋酸盐，100 mM 醋酸镁，1 mg/mL BSA，pH 7.8–8.0）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>US Biological</td><td>Z1004</td><td>用于原生质球制备</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. 限制性内切酶消化与分子内连接&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101</td><td>DLC 检测中的限制性内切酶消化</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104</td><td>DLE 检测中的限制性内切酶消化</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>分子内连接</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. DNA 纯化&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 和 2 mL 微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇（P/C/IA），比例 25:24:1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>DNA 纯化</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. 补骨脂素交联逆转&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪/热循环仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. qPCR&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>作者使用的 qPCR 仪</td></tr><tr><td>Lightcycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>作者使用的 qPCR 仪</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 96 孔白色板</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>qPCR 用 96 孔板</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>作者使用的 qPCR 试剂盒</td></tr><tr><td>SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>作者使用的 qPCR 试剂盒</td></tr></tbody></table>

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 pcr 酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

DNA损伤，包括细胞周期S期和G2期发生的DNA双链断裂和链间交联，可通过同源重组（HR）进行修复。此外，HR也是复制叉停滞或崩塌后实现其救援的重要机制。这一复杂通路中众多可逆与不可逆步骤的调控有助于维持其保真性。通过对HR过程中形成的重组中间体进行物理分析，可揭示各种核蛋白因子及其相互作用分子对这些调控环节的作用特征。尽管已有成熟方法用于检测重组通路中的特定事件和中间产物，但长期以来，对该通路中两个关键步骤——D-loop形成及其延伸——的检测一直存在挑战，直至近期才取得突破。本文介绍了高效检测HR通路中若干关键事件的方法，即DNA双链断裂的产生、D-loop的形成、D-loop的延伸以及重组产物的生成 通过 断裂诱导复制（BIR）在 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 描述了这些检测方法，它们能够以高灵敏度检测相应的重组中间体和产物，且不依赖于细胞的存活性。D-loop、D-loop延伸以及BIR产物的检测基于邻近连接技术。这些方法共同实现了在群体水平上对同源重组动力学的研究，从而可精确解析同源重组蛋白及其调控因子在通路关键步骤中的功能。

DLC检测 
DLC 检测由位点特异性 DSB 侵入单个供体所形成的新生和延伸的 D-loop图2）。补骨脂素交联可将断裂的链与供体在物理上连接起来 通过 D-loop 中的异源双链 DNA。在断裂处被切除的链上，通过一条长的互补寡核苷酸恢复限制性酶切位点，从而允许限制性内切酶切割，随后断裂链与邻近的供体序列连接，形成可被 qPCR 定量的嵌合产物。值得注意的是，DLC 信号依赖于补骨脂素交联、互补寡核苷酸、核心重组酶 Rad51 以及 Rad51 辅助因子 Rad52 和 Rad54。8. 删除DNA解旋酶/拓扑异构酶Sgs1-Top3-Rmi1、Mph1和Srs2会导致DLC信号增强。
图3展示了标准野生型菌株在DSB诱导后2小时的代表性结果，分别进行了三份平行实验，其中包含和不包含杂交寡核苷酸的处理。同时展示了缺少关键步骤——补骨脂素交联——的样本，该样...

D-环捕获（DLC）和D-环延伸（DLE）实验利用邻近连接原理结合定量PCR，用于定量检测酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中可诱导双链断裂位点处的D-环形成、D-环延伸以及产物生成。

同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

细胞周期的S期和G2期发生的DNA损伤，包括DNA双链断裂和链间交联，可通过同源重组等方式进行修复。

D-loop捕获与延伸实验是首次能够在有丝分裂生长的酵母细胞中，对同源重组过程中的D-loop形成及延伸步骤进行无偏倚且直接定量的分析。这种不依赖细胞活力的技术使得研究人员能够研究参与D-loop代谢的蛋白质，而这些功能若仅通过观察BIR产物则难以与它们在后续步骤中的作用区分开来。未来，我们计划将这些实验体系拓展至人类细胞，以更深入地理解关键蛋白（包括BRCA2、BLM和WRN）在同源重组中的作用。首先将样品离心五分钟。将沉淀重悬于 2.5 毫升 1x 补骨脂素溶液中，并转移至 60 × 15 毫米的培养皿中。对于无交联对照组，将沉淀重悬于 2.5 毫升 TE1 溶液中。接下来，将紫外光源置于轨道摇床顶部，转速设置为 50 RPM。使用配备 365 纳米长波灯管的紫外交联仪进行样品交联。将培养皿放置在预冷的塑料或有机玻璃板上，距离紫外光源下方 1 至 2 厘米处，在轻轻振荡的条件下照射 10 分钟。然后将样品转移至一个新的15毫升离心管中。用2.5毫升TE1溶液冲洗培养皿，并将冲洗液加入该离心管中。将样品以5分钟离心。弃去上清液，将沉淀物在-20摄氏度保存。将样品置于冰上解冻。同时，将干浴器预热至30摄氏度。将样品重悬于1毫升原生质球缓冲液中，转移至1.5毫升微量离心管中。然后加入3.5 µL酵解酶溶液，轻轻弹动混匀。在30 °C下孵育15分钟。然后将试管置于冰上。离心3分钟，并将样品置于冰上。用1毫升原生质体缓冲液洗涤样品三次，每次离心3分钟。用一毫升冷的限制性内切酶缓冲液重悬样品。离心三分钟，将样品置于冰上。重复洗涤一次。用1毫升冰冷的1×限制性内切酶缓冲液重悬样品。将样品均分为两份。在4°C、16,000 G条件下离心3分钟。将每个样本的一管重悬于180 µL含杂交寡核苷酸的1.4x限制性内切酶缓冲液中，另一管重悬于180 µL不含杂交寡核苷酸的1.4x限制性内切酶缓冲液中。在液氮中快速冷冻样本，然后在冰上解冻。将一个干燥浴槽预热至65°C，另一个预热至37°C。取36微升样品加入新的微量离心管中，再加入4微升1% SDS，通过轻轻敲击管壁混匀。在65°C下孵育15分钟，每隔5分钟轻轻敲击一次管壁。孵育结束后立即将样品置于冰上。加入4.5 µL 10% Triton X-100，用移液器吹打混匀。向每个样品中加入20至50单位的高保真EcoR1或HindIII限制性内切酶。在37摄氏度孵育1小时，每20至30分钟轻轻振荡一次。在此期间，将干浴器预热至55摄氏度，水浴预热至16摄氏度。向每个样品中加入8.6 µL的10% SDS，通过移液和轻弹混匀。在 55 摄氏度孵育 10 分钟。向每个样品中加入 80 微升 10% Triton X-100，用移液器吹打混匀。向每个样品中加入 660 微升不含 ATP 的 1× 连接缓冲液、pH 8.0 的 1 毫摩尔 ATP 以及 8 单位的 T4 DNA 连接酶，轻轻颠倒混匀。在16摄氏度孵育1.5小时，每30分钟颠倒一次。孵育结束后立即将样品置于冰上。按照方案所述进行DNA纯化后，取2微升纯化后的DNA，根据制造商说明书配制20微升的qPCR反应体系。每个样本设置五个对照反应和一个定量反应，并进行双重复运行。在双链断裂（DSB）诱导后两小时进行DLC检测分析，结果显示补骨脂素交联至关重要，且其效率取决于样品采集与qPCR之间的时间间隔。ARG4的Cp值在交联样本之间相似，而在未交联样本中较低，因为无交联的DNA扩增效率更高。所有样品的分子间连接qPCR对照均在正常范围内。对照组qPCR信号较低，表明DSB诱导显著，该对照扩增区域跨越HO内切酶识别位点。EcoR1 qPCR对照也观察到类似结果。通过与分子间连接对照归一化，计算了含有杂交寡核苷酸的DLC信号。在DSB诱导后六小时进行的DLE实验分析显示，ARG4 CP值在有无杂交寡核苷酸的样本之间相似。分子间连接qPCR对照显示，有无杂交寡核苷酸的样本均具有可接受的信号，但失败样本的信号较低。在所有三个样本中，均观察到强烈的双链断裂（DSB）诱导。由于HindIII切割依赖于杂交寡核苷酸对限制性酶切位点的恢复，因此在切除链上跨越HindIII切割位点的扩增程度在有寡核苷酸和无寡核苷酸的样本之间存在显著差异。在延伸链上，由于HindIII的切割也依赖于延伸，因此在该位点扩增的差异较小。样品和缓冲液必须始终保持低温。样品在用1.4倍体积的冷限制性内切酶缓冲液重悬后（无论是否含有杂交寡核苷酸），必须立即速冻。可使用Southern印迹或遗传终点检测来研究D-loop形成和延伸对产物生成的下游效应。可利用高CP的染色质免疫沉淀实验来探究同源搜索的影响，该方法可提供目标蛋白招募的相关信息。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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全基因组范围内利用 ChEC-seq 技术在 Saccharomyces cerevisiae 中绘制蛋白质-DNA 相互作用图谱

核糖核苷酸是在真核生物细胞核DNA复制过程中掺入基因组中最丰富的非经典核苷酸之一。如果未能被及时清除，核糖核苷酸可能导致DNA损伤和诱变。本文介绍了两种用于评估DNA中核糖核苷酸掺入丰度及其诱变效应的实验方法。...

研究核糖核苷酸的掺入：酵母基因组中核糖核苷酸的链特异性检测及核糖核苷酸诱导突变的测量

本文介绍了一种利用 Southern 印迹法和/或 PCR 鉴定小鼠胚胎干细胞中同源重组事件的详细实验方案。该方法以采用传统基于胚胎干细胞的同源重组介导靶向技术构建非肌肉肌球蛋白 II...

利用Southern印迹与聚合酶链式反应鉴定小鼠胚胎干细胞中的同源重组事件

通过测序实现的相互半合子化（RH-seq）是一种强大的新方法，可用于定位物种间性状差异的遗传基础。该方法利用转座子诱变生成半合子池，并通过高通量测序结合竞争性生长来追踪其适合度。对所得数据的分析可精确定位控制该性状的基因。...

Saccharomyces 酵母物种间热耐受性差异的全基因组范围相互半合子分析遗传定位

本文介绍了Grafix（梯度固定）技术的应用，该技术是在交联剂存在下进行甘油梯度离心，用于鉴定剪接体复合物上短暂结合的剪接因子之间的相互作用。...

利用Grafix技术检测瞬时相互作用蛋白 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 剪接体亚复合物

本研究描述了一种在裂殖酵母（Schizosaccharomyces...

遗传筛选鉴定裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）中的多拷贝抑制子

我们描述了两种互补的实验方案，可准确测定S期持续时间 S. cerevisiae 使用EdU（一种胸苷类似物），其可被掺入 体内...

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷掺入法测定酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的S期持续时间

本方案介绍了一种基于位点特异性重组的基因座特异性染色质分离方法，用于从酿酒酵母（Saccharomyces...

单拷贝基因座染色质纯化技术在 Saccharomyces cerevisiae 中的应用

学习利用邻近连接与定量PCR技术检测酿酒酵母同源重组中的D-loop形成与延伸过程。该方法可无偏倚地定量分析重组中间体，为研究DNA修复机制提供重要工具。

同源重组中间体的检测通过邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

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同源重组中间体的检测 通过 邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）

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同源重组中间体的检测通过邻近连接与定量 PCR 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）