Name: 新生儿 大肠杆菌 分离菌血症肠道转吞作用的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 了解利用T84细胞Transwell模型评估大肠杆菌跨肠道上皮细胞转吞作用的方法。该技术为研究新生儿大肠杆菌侵袭性疾病的致病机制提供了重要的体外实验手段。

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本工作获得了密苏里大学堪萨斯城分校医学院向 A.I. 发放的莎拉·莫里森学生资助的支持。

注意：为避免污染，所有 T84 细胞、细菌、培养皿和试剂的操作均须在生物安全二级（BSL-2）安全柜中进行。所有涉及无菌 T84 细胞、感染性 T84 细胞以及 E. coli 的实验操作应使用独立区域和培养箱。本研究所采用的临床 E. coli 分离株均依据本机构机构审查委员会（Institutional Review Board）的指导原则获取1,16。
1. 准备含T84细胞的跨细胞转运小室（实验前约1-2周）
<ol>
	<li>在组织培养基（TCM + 抗生素）中培养美国模式培养物集存库（ATCC）T84 细胞，该培养基由 DMEM/F12 培养基（1:1，终浓度各为 50%）、5% 胎牛血清和 1%（100 U/mL）青霉素/链霉素双抗混合物组成。将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。 
	注意：该培养基配方的一种变体（不含青霉素/链霉素的 TCM w/o 抗生素）将用于后续步骤（第 2 节及以后）。请确保每个步骤使用正确的培养基配方。</li>
	<li>在生物安全柜（BSC）内操作，将 T84 细胞接种至用于 24 孔板的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜细胞培养小室插入物中，其膜孔径为 3 µm。为每种所需的实验条件设置小室插入物的重复组，并包括未感染的对照组，以监测可能的污染。
	<ol>
		<li>在专用于承载小室插入物的 24 孔板中，向所需数量的收集孔中各加入 1 mL TCM + 抗生素。</li>
		<li>在每个孔中放入一个小室插入物。</li>
		<li>将 1 × 105 个 T84 细胞悬浮于 500 µL TCM + 抗生素中，接种至各插入物中。使用血细胞计数板结合台盼蓝染色或自动细胞计数仪对细胞数量进行定量17。</li>
		<li>将接种后的含插入物的 24 孔板置于与细胞培养条件相同的环境中进行孵育。</li>
		<li>通过光学显微镜观察，确认接种约 48 小时后单层细胞开始趋于融合。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种后每隔 2 天，使用上皮细胞伏特/欧姆计（EVOM）测量并记录跨上皮电阻（TEER），以评估单层细胞的成熟度。当插入物的 TEER 达到至少 1,000 Ω·cm2 时，即可认为其已准备好用于实验18。 
	注意：插入物通常在接种后 7–10 天达到此 TEER 值。当达到该电阻值时，光学显微镜下可见 T84 细胞呈现 100% 融合状态。
	<ol>
		<li>不使用 EVOM 探针时，应将其电极浸没于 0.15 M KCl 溶液中保存。</li>
		<li>在测量 TEER 前，将探针浸入装有 5 mL 70% 乙醇的 50 mL 锥形管中，消毒 10–15 分钟。取出探针，甩去多余乙醇，并在生物安全柜内静置晾干 10 分钟。保留该乙醇管备用。</li>
		<li>通过将干燥且已消毒的探针插入一个无菌孔中进行 EVOM 及探针测试，该孔内含 1 mL TCM + 抗生素，并放置一个内含 500 µL TCM + 抗生素的无菌插入物。确保 EVOM 读数&#60;200 Ω。记录此空白值，用于后续步骤 1.3.6 中所述的电阻计算。</li>
		<li>将探针从 TCM + 抗生素管中取出。实验过程中，将该管保留用于探针的临时存放。</li>
		<li>轻轻将探针插入第一个小室插入物中，长电极置于收集孔内，短电极置于插入物内部。让长电极接触收集孔底部，但不要施加压力，以免破坏上皮单层结构。</li>
		<li>重复此过程，测量并记录每个插入物的电阻值（单位：Ω）。完成后，将探针再次浸入乙醇中消毒 10–15 分钟，随后将其放回 KCl 溶液中保存。从每个含 T84 细胞的插入物测得的电阻值中减去步骤 1.3.3 获得的空白电阻值。再将所得电阻值（Ω）乘以每个插入物底部的面积（cm2），得到最终的 TEER 测量值（Ω·cm2）。</li>
		<li>当 TEER 达到至少 1,000 Ω·cm2 时，上皮单层已成熟，可用于感染实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>随着 TEER 的逐渐成熟，每隔 1–2 天为细胞更换新鲜培养基。
	<ol>
		<li>在新的 24 孔板中，为每个待处理的接种插入物准备一个孔，每孔加入 1 mL TCM + 抗生素。</li>
		<li>使用无菌镊子，小心地将插入物转移至新补充了培养基的孔中。</li>
		<li>更换插入物内的培养基。
		<ol>
			<li>倾斜培养板，使用自制真空吸液器配合移液枪头沿插入物侧壁轻轻吸除旧培养基。吸液器可调节低强度负压，防止细胞层受损。切勿让移液枪头接触插入物底部，以免破坏正在形成的上皮单层。</li>
			<li>向插入物中加入 500 µL TCM + 抗生素。通过光学显微镜观察单层结构，确认其保持完整。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每隔 1–2 天，按照上述步骤 1.3.2–1.3.6 的方法测量每个插入物的 TEER。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 实验前一天使用不含抗生素的TCM培养基准备T84细胞
<ol>
	<li>在实验前一天测量并记录经上皮电阻（TEER）。</li>
	<li>以与前期细胞准备和培养相同的方式更换组织培养基（TCM），但为准备感染，改用不含抗生素的TCM（板孔中加入1 mL，插入物中加入500 µL）。</li>
</ol>
3. 大肠杆菌（E. coli）培养物（实验前1天开始培养）
警告：处理致病性临床 E. coli 菌株时，应采取生物安全二级（BSL-2）防护措施。
<ol>
	<li>取一个标记好的15 mL锥形管，其中含有5 mL无菌溶菌肉汤（LB），用无菌接种环从一种细菌菌株（E. coli）中挑取单个菌落接种至肉汤中。重复此操作，为每种待测菌株分别制备一支过夜培养管。</li>
	<li>将过夜培养物放入摇床培养箱中培养（250 rpm，37 °C），培养时松开管盖。</li>
</ol>
4. 准备 E. coli 接种物、上皮细胞及材料（实验当天上午）
注意：从此步骤开始，使用不含抗生素、预热至 37 °C 的 TCM。
<ol>
	<li>将每种过夜LB培养物各250 µL加入含有25 mL无抗生素TCM的50 mL锥形管中（每种菌株使用一管）。保持管盖松动。将这些新培养管置于摇床中，在相同条件下（250 rpm，37 °C）振荡培养恰好2小时。在等待期间进行后续子步骤。</li>
	<li>按照步骤1.3.2–1.3.6所述方法测定每个插入式培养小室的TEER值，并记录为时间（t）= 0 h时的TEER值。</li>
	<li>将插入式培养小室转移至新板中的孔内，并按照步骤1.4.3所述技术更换培养基。但此次在接收孔中加入500 µL无抗生素TCM，在插入式小室中加入400 µL无抗生素TCM。将插入式小室置于组织培养孵箱中，直至感染时使用。</li>
	<li>准备足够数量的方形LB琼脂平板，并使其升温至室温（RT），用于后续的涂布和细菌定量。</li>
</ol>
5. 细胞接种（实验开始）
<ol>
	<li>准确培养2小时后，从摇床中取出早晨的细菌培养物，以1,900 × g、4 °C离心10分钟。 
	注意：后续所有步骤中，均需将细菌悬液置于冰上，以尽量减少细菌生长。</li>
	<li>用不含抗生素的TCM重悬细菌沉淀。使用分光光度计将光密度（OD）调整至0.7–0.9，并进一步用不含抗生素的TCM稀释至浓度为1 × 106 菌落形成单位（CFU）/mL（约1:100稀释）。用此细菌悬液以每插入物100 µL体积接种1 × 105 CFU进行感染。</li>
	<li>标记Transwell板，并向每个插入物中加入100 µL经OD调整的接种液（每插入物共1 × 105 CFU）。此时实验正式开始。记录时间并记为t = 0 h。</li>
	<li>对接种用的细菌悬液进行平板接种，采用梯度稀释法定量CFU/mL，将10 µL等分试样点种于方形LB琼脂平板上19。</li>
</ol>
6. 定量转胞吞作用
<ol>
	<li>接种后每隔30分钟，用500 µL不含抗生素的TCM填充新孔。使用不同无菌镊子分别将不同细菌菌株的插入物转移至对应的新孔中。</li>
	<li>将每个插入物中已使用的收集孔中的培养基分别收集到预先标记的离心管中，置于冰上。在各时间点之间，将Transwell板放回培养箱中继续孵育。</li>
	<li>对于每个插入物，合并 t = 0.5 h、t = 1 h、t = 1.5 h 和 t = 2 h 时收集的培养基，并短暂涡旋混匀。采用划线稀释法将收集的培养基接种至 LB 琼脂平板，以定量实验前 2 小时内转胞吞的细菌量。 
	注意：每30分钟收集一次细菌并置于冰上，可最大限度减少收集孔中细菌的生长，从而确保检测主要针对转胞吞的细菌进行。</li>
	<li>将标记好的轨迹稀释LB琼脂平板置于37 °C细菌培养箱中培养，无需额外补充CO2并将T84 transwell板放回组织培养孵育箱中。</li>
	<li>在 t = 4 h 时，将 t = 2.5 h、t = 3 h、t = 3.5 h 和 t = 4 h 收集的培养基合并，重复步骤 6.3。</li>
	<li>在 t = 6 h 时，重复步骤 6.3，合并 t = 4.5 h、t = 5 h、t = 5.5 h 和 t = 6 h 收集的培养基。此外，在 t = 6 h 时，将对照孔中的培养基接种至培养板中。</li>
</ol>
7. 实验结束
<ol>
	<li>在实验结束时（t = 6 h）测量并记录TEER值。操作步骤参照1.3.2–1.3.6中的描述。</li>
	<li>将探针浸入70%乙醇中10–15分钟进行去污染。弃去或保存/处理Transwell小室以用于其他实验（视需要而定）。将LB琼脂平板过夜培养，并对所有其他使用过的材料进行消毒和/或安全处理。</li>
	<li>过夜培养后，人工计数梯度稀释LB平板上的细菌菌落，以确定接种量及大肠杆菌（E. coli）的跨细胞转运量。确保对照平板上无任何细菌生长。</li>
</ol>

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<li>Burns, J. L., Griffith, A., Barry, J. J., Jonas, M., Chi, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcytosis+of+gastrointestinal+epithelial+cells+by+Escherichia+coli+K1%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Transcytosis of gastrointestinal epithelial cells by Escherichia coli K1.</a> Pediatric Research. 49 (1), 30-37 (2001).</li>
<li>Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+add-on+EVOM%28%28R%29%29+device+for+real-time+transepithelial%2Fendothelial+electrical+resistance+measurements+in+multiple+transwell+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples.</a> Micromachines. 12 (3), 282(2021).</li>
<li>McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+by+transposon+insertion+sequencing+of+Escherichia+coli+K1+genes+essential+for+in+vitro+growth%2C+gastrointestinal+colonizing+capacity%2C+and+survival+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698(2018).</li>
<li>Sayoc-Becerra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-inhibitor+tofacitinib+rescues+human+intestinal+epithelial+cells+and+colonoids+from+cytokine-induced+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).</li>
</ol>

该方法源自胃肠病学和传染病学领域使用的技术20。体外肠道上皮屏障模型已被用于阐明管腔内容物与先天免疫这一重要组分相互作用的机制6,8。侵袭性新生儿E. coli的宿主-病原体相互作用也已通过基因分析、抗菌药物耐药性研究以及免疫学技术被分别表征1,5,16,21。然而，目前对新生儿E. coli分离株通过肠道进入血液的分子机制仍知之甚少3。
本文所展示的转胞吞作用技术有助于更详细地表征那些经肠道获得后引发败血症的新生期 E. coli 侵袭性菌株。新...

Escherichia coli 是新生儿早发性败血症最常见的病因1,2,3。新生儿 E. coli 菌血症的死亡率可高达 40%，且可能并发脑膜炎，导致严重的神经发育障碍2。新生儿摄入母体来源的 E. coli 菌株可引发新生儿菌血症；该过程已在动物模型中成功复制2,4。摄入后，致病菌从新生儿肠道腔内穿过肠屏障进入血液，引起败血症。不同新生儿侵袭性 E. coli 菌株在侵入肠上皮细胞的能力方面存在差异1,5。然而，这些菌株在侵入后穿越肠上皮的转胞吞能力尚未被完全阐明。
这种肠道转胞吞模型是一种有用的体外方法，用于模拟细菌穿过肠上皮的过程。本文所介绍方法的总体目标是比较新生儿E. coli分离株穿过肠上皮的转胞吞能力。此处描述的模型使用T84细胞，这是一种永生化的人肠腺癌细胞系6,7。将T84细胞培养在具有两个独立腔室的半透膜上，直至形成融合单层。采用该技术的原理在于，这些肠细胞会像体内情况一样发生极化，并形成成熟的紧密连接6,8。与膜接触的一侧成为基底侧，细胞的另一侧则成为顶端侧，类似于肠腔，摄入的病原体在此处黏附并侵入。Transwell膜允许细菌通过，但极化的肠上皮细胞会形成紧密连接，从而阻碍细菌的旁细胞迁移9。因此，该方法的优势在于提供了一个可控的体外环境，并利用人源细胞系来研究细菌转胞吞过程，包括跨细胞途径。尽管存在其他研究细菌穿过肠上皮的转胞吞方法，但本文介绍的Transwell方法具有更高的简便性和可及性。其他替代技术，例如在Ussing chamber系统中使用离体组织样本，也是可行的。然而，这些方法所用的组织标本可能难以获取，特别是当研究旨在探讨人体生理学时10。肠道类器官是另一种可用于研究宿主-细菌相互作用的体外替代模型11。虽然类器官单层也可用于Transwell系统中研究细菌转胞吞，但其需要分离和培养干细胞，并使用特定生长因子诱导分化12。因此，与本文所述的Transwell方法相比，类器官模型的使用更加耗时且成本更高。
使用该方法评估细菌穿过肠上皮的能力 体外 transwell 系统已成功应用于多种病原体的研究。这些研究证明了利用 T84 细胞的 transwell 系统在表征细菌穿越极化肠上皮细胞的转胞吞作用方面的实用性13,14,15然而，将这种transwell方法应用于比较引起菌血症的新生儿细菌的转胞吞能力时 E. coli 菌株的相关研究尚未被详细描述。本论文为其他研究人员提供了一种可靠且易于使用的标准Transwell实验方案，且无需过于昂贵的资源。
为了比较新生儿侵袭性E. coli菌株穿越肠上皮的能力，可在肠上皮单层细胞的顶侧接种已知数量的细菌细胞。孵育后，收集上皮基底侧的培养基，并对穿过的细菌进行定量，以确定随时间推移的细菌转胞吞量。本论文中所述方法用于研究从因菌血症住院的新生儿体内分离的临床E. coli菌株的转胞吞能力。这些新生儿临床分离株用于转胞吞研究的纳入标准此前已有发表1,2,16。当使用不同E. coli菌株执行该方法时，可比较它们的转胞吞能力。通过这一过程，肠转胞吞模型提供了有价值的数据，用于表征E. coli中促进多步骤致病过程并最终导致新生儿菌血症发生的毒力因子。

<table><tbody><tr><td>10,000 U/mL 青霉素/链霉素混合液</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 无菌锥形管</td><td>MidSci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 微型离心管</td><td>Avant</td><td>AVSS2000</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 无菌聚丙烯锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>吸液器</td><td>康宁</td><td>4930</td><td></td></tr><tr><td>生物安全柜</td><td>Labconco</td><td>30441010028343</td><td>该方法中使用了其中三个：一个用于无菌组织操作，一个用于感染组织操作，另一个用于细菌操作。</td></tr><tr><td>离心</td><td>Sorvall</td><td>图注 RT</td><td></td></tr><tr><td>一次性接种环</td><td>Fisherbrand</td><td>22363605</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>上皮细胞伏特/欧姆计</td><td>世界精密仪器公司</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12营养混合物</td><td>Gibco</td><td>11765-047</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma Aldrich，明亮线</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>新不伦瑞克</td><td>Innova 4080</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>51030284</td><td>该方法中使用了其中三种：一种用于无菌组织培养，一种用于感染组织培养，另一种用于细菌培养。</td></tr><tr><td>溶原性肉汤</td><td>Difco</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>溶菌肉汤琼脂</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49101</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2R 显微镜</td><td>尼康</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Unico</td><td>1100RS</td><td></td></tr><tr><td>T84 肠道细胞</td><td>美国组织培养收藏中心</td><td>CCL248</td><td></td></tr><tr><td>组织培养小室，带聚对苯二甲酸乙二醇酯膜，3 &amp;micro;微米级孔隙，&amp;nbsp; 24孔板格式</td><td>Falcon</td><td>353096</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染色</td><td>Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

新生儿肠道转胞吞作用的评估 大肠杆菌 菌血症分离株

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

新生儿摄入母体 E. coli 在分娩前后定植于其肠道的菌株。 E. coli 具有穿越肠道能力的菌株可侵入新生儿血液，导致危及生命的菌血症。本文所述方法利用在半透性插入培养装置上培养的极化肠上皮细胞，评估新生儿菌株的跨细胞转运（transcytosis）能力。 E. coli 菌血症分离株 体外该方法利用已建立的T84肠上皮细胞系，该细胞系能够生长至汇合状态，并形成紧密连接和桥粒。当细胞达到汇合后，成熟的T84单层细胞会形成跨上皮电阻（TEER），可通过伏特计进行定量检测。TEER值与细胞旁通透性呈负相关，即TEER值越低，表明包括细菌在内的胞外成分通过肠上皮单层的细胞旁途径通透性越高。另一方面，细菌的跨细胞转运（转胞吞作用）则不一定影响TEER的测量值。在本模型中，可在感染后6小时内连续定量检测细菌穿越肠上皮单层的情况，并重复测定TEER以监测细胞旁通透性的动态变化。此外，该方法便于结合免疫荧光染色等技术，用于研究细菌在极化上皮中进行转胞吞时，紧密连接及其他细胞间黏附蛋白的结构变化。该模型的应用有助于阐明新生儿病原体穿越肠上皮屏障的分子机制。 E. coli 穿过肠上皮细胞以产生菌血症。

<img alt="TEER 发育曲线图；时间与电阻数据，10 天内细胞生长评估，含误差线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64241/64241fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图 1：T84 细胞随时间变化的 TEER 值。 随着 T84 细胞层在插入物上逐渐成熟，单层细胞的电阻值增加。当 TEER 值达到至少 1,000 Ω·cm2 时，细胞层已充分发育，可有效减少旁细胞细菌转运，从而允许主要测量跨细胞细菌转运。误差线表示标准差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64241/64241fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<p class="jov...

大肠杆菌&#160;导致新生儿在出生前后摄入该细菌后发生败血症。所涉及的过程包括&#160;E. coli的&#160;从肠道进入血液的能力尚不明确。&#160;体外&#160;模型评估了……的能力&#160;E. coli&#160;菌株穿过肠上皮细胞。

新生儿在出生时会摄入母体的大肠杆菌菌株，这些菌株在分娩前后定植于其肠道。具有易位能力的大肠杆菌菌株……

该方法可用于比较不同标准化菌株在具有成熟连接结构的极化肠上皮细胞中的转胞吞能力。这是一种相对简便的技术，无需大量资源或时间投入，可用来研究新生儿侵袭性大肠杆菌疾病发病机制中的一个重要步骤。本实验操作将由本实验室研究助理 Josh Wheatley 进行演示。在生物安全柜内操作，将 T84 细胞接种至聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜细胞培养 Transwell 小室中。在专为承载 Transwell 小室设计的 24 孔板中，向所需数量的收集孔内加入 1 毫升组织培养基（TCM）或含抗生素的组织培养基。将 500 微升含抗生素的组织培养基中悬浮的 1 × 10⁵ 个 T84 细胞接种至这些小室中。接种后约48小时，使用光学显微镜检查单层细胞是否开始融合。接种后每隔两天，使用上皮细胞伏特计（EVOM）测量并记录跨上皮电阻（TEER）。在测量TEER之前，将电极探头浸入5 mL 70%乙醇中10至15分钟以进行去污染。取出探针，甩去多余的乙醇，并将其置于生物安全柜中晾干10分钟。通过将干燥且已去污染的探针放入含有1毫升添加抗生素的TCM培养基的无菌孔中进行EVOM和探针测试，该孔内放置一个含有500微升添加抗生素的TCM培养基的无菌插入物。确保EVOM读数小于200 Ω。记录此空白值，用于后续的电阻计算。将探针从含有抗生素的 TCM 管中取出。轻轻将探针插入第一个插件中，使长电极进入收集孔。让电极接触收集孔的底部，但不要向下按压，以免破坏插入物内的上皮单层和短电极。实验结束后，将探针置于乙醇中进行去污染处理。从每个含有T84细胞的插入物所测得的电阻值中减去空白电阻值。然后将每个插入物得到的电阻值乘以该插入物底部的表面积，以获得最终的跨上皮电阻（TEER）测量值。当TEER达到每平方厘米1000欧姆时，上皮单层细胞即已成熟，可进行感染实验。随着TEER的成熟，每隔一至两天为细胞更换一次新鲜培养基。在新的24孔板中，向每个接种了细胞的插入式培养小室对应的孔中加入含有抗生素的1毫升TCM培养基。使用无菌镊子，小心地将小室转移至新补充的孔中。更换小室中的培养基。通过倾斜培养板，沿小室侧壁用移液枪头轻轻吸除小室中的旧培养基。向小室中加入 500 微升含抗生素的 TCM，并观察单层细胞，以确认其完整性。实验前一天，测量并记录 TEER 值。将孔板中的培养基更换为 1 毫升不含抗生素的 TCM，小室中加入 500 微升不含抗生素的 TCM。取一个已标记的15毫升锥形管，其中含有5毫升无菌的LB培养基（Lysogeny Broth），用无菌接种环从一株大肠杆菌（Escherichia coli）中挑取单个菌落接种至培养基中。将培养物置于摇床过夜培养，并将管盖略微松开。次日，从过夜培养的LB培养物中取250微升，加入含有25毫升无抗生素TCM培养基的50毫升锥形管中。将试管孵育两小

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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新生儿肠道转胞吞作用的评估大肠杆菌菌血症分离株

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