单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

由于嵌入的蛋白质和糖类的存在，细胞膜具有高度的拥挤性。我们展示了在合成的拥挤支撑脂双层上进行单分子成像的方法。该平台可用于在分子水平上研究拥挤效应对膜内生物分子反应的影响。

本方案阐述了膜生物分子结合、扩散和组装的分析方法。实验成功的关键在于严格清洁基底、避免双层膜受损，以及在单分子成像中保持高信噪比。与我共同演示该实验的是实验室的研究生Aditya Upasani和Vishwesh Haricharan Rai。

首先将经过等离子处理的丙烯酸载片放置在干净的纸巾上。撕去双面激光切割胶带的保护膜，并将其粘贴到载片上。使用移液器吸头压平胶带，以防止液体从一个通道泄漏到另一个通道。

通过将经等离子处理的盖玻片放置在贴有胶带的载玻片上，封闭腔室。使用移液器吸头轻轻按压盖玻片在胶带区域，使通道密封不漏水。若使用玻璃载玻片，需用环氧树脂密封边缘。

将制备好的微流控成像腔在干燥条件下储存一至两周。取经 Piranha 溶液预清洗的玻璃小瓶，加入 POPC 和 DOPE-PEG(2000) 的氯仿溶液，其中 PEG 2000 脂质的摩尔分数按所需比例配制，以便在加入缓冲液后获得终浓度为 3 毫摩尔的脂质溶液。同样地，也可制备其他脂质膜组成。

接下来，用氮气轻轻吹扫小瓶，同时轻微旋转，以除去氯仿，使目标脂质均匀地涂覆在小瓶内表面。将小瓶置于真空干燥器中一小时，以去除残留的氯仿。然后向小瓶中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），于37摄氏度孵育过夜。

经过过夜孵育后，轻轻涡旋小瓶一到两分钟，直至溶液变为浑浊且呈乳白色。然后将100 µL该溶液转移至一个小型的500 µL离心管中。为制备直径为50至100纳米的小型单层囊泡，需将溶液在水浴超声仪中超声处理约一小时。

超声处理结束后，溶液将变得澄清；如果溶液仍然浑浊，则需继续超声30分钟。然后向超声处理后的囊泡中加入氯化钙，使其在脂质溶液中的终浓度为30毫摩尔。剪裁微量移液器吸头以便注入样品溶液，使其能够紧密地插入孔中。

将脂质溶液混合后，通过成像室的其中一个孔注入。用干净的纸巾擦拭从出口处溢出的多余溶液，以防止相邻通道受到污染。通过在50毫升离心管末端放置湿润的纸巾，制备一个保湿室。

将载玻片放入试管中并盖紧管盖。将试管平放，置于湿润化室内孵育90分钟，建议在37摄氏度的培养箱中进行。用大量PBS缓冲液彻底清洗孵育室，清洗过程中避免气泡进入孵育室，以免在膜上产生缺陷。

在进行任何关于运动性和组装的实验之前，需通过制备荧光微球样品并将它们以低浓度加入微流控通道中，来校准TIRF显微镜，确保单个微球产生的荧光点在图像中不发生重叠。首先，在落射荧光模式下观察微球。当照明处于落射荧光模式时，移动位于平移台上的M5反射镜，使从物镜出射的光束发生偏折，直至达到全内反射的配置状态。

为了验证是否已实现全内反射（TIR）照明，请检查当TIR倏逝场照射微珠样品时，是否仅有表面的微珠可见，而远离表面的游离微珠不可见。实验开始时，将激光在物镜后焦面的功率设置为5至10毫瓦，以防止荧光染料发生光漂白。将载玻片置于显微镜载物台上，首先聚焦于裸膜；脂膜中少量的杂质痕迹已足以用于观察膜结构。

使用微量移液器将样品注入涂有 PEG 支持性脂质双层（SLB）的成像室中。为测量单分子结合动力学，使用注射泵以每分钟 50 至 500 微升的流速将标记的生物分子通过入口孔注入微流控室。为以每秒 25 至 50 帧的速度记录 5,000 帧，需设置相应的视频采集参数。

启动录像采集，通过注射泵持续流动，采集超过 5,000 帧图像，直至膜表面不再有新的信号点出现，并按照论文中所述方法分析结合动力学。对于单颗粒追踪实验，使用微量移液器将标记的生物分子以低浓度加入微流道中。为确保从数据集中恢复的轨迹具有高保真度，需优化浓度，使颗粒密度低于每平方微米 0.1 个颗粒，从而避免单个颗粒轨迹频繁交叉。

如有需要，将腔室置于湿润环境中孵育，并在成像前用缓冲液洗涤。对于单粒子轨迹分析，以每秒10至100帧的速度采集200至500帧图像，并在图像采集期间保持物镜聚焦于双分子层平面，同时尽量减少载物台漂移。对于亚基测量，将适当浓度的标记生物分子加入微流控成像腔室中，并将载玻片置于湿润腔室内，在所需温度下孵育指定时间。

成像前，用缓冲液清洗成像腔。将载玻片置于显微镜上，调节焦距以观察标记的分子。将激光功率设置为使荧光染料逐渐发生漂白的水平。

理想情况下，针对每个组装的复合物，应控制激光功率，使光漂白步进间隔保持在10到20帧之间（如论文所述），并持续采集图像直至所有分子完全光漂白。在样品加入反应腔室后立即开始录像采集，通过在PEG修饰的固体支持双层膜（PEG SLB）的不同区域，以固定时间间隔采集新的光漂白电影，从而进行时间依赖性的组装测量。Cytolysin A与含有5 mol% DOPE-PEG(2000)的脂质膜结合后，表现出粒子密度增加，并达到饱和状态。

对结合的颗粒拟合指数衰减函数，可得到细胞溶素A膜结合的时间常数。当膜中不含任何PEG聚合物时，大多数示踪分子在固相脂双层（SLB）上表现出受限扩散。当膜双层中含有少量PEG 2000时，膜从底层表面抬升，使示踪分子能够不受表面限制地自由扩散。

然而，在双层膜中聚乙二醇（PEG）浓度较高时，观察到严重的受限扩散现象。在两种不同PEG 2000脂质膜中，亲脂性DNA示踪剂的ISD2分布显示，PEG浓度升高时其扩散能力下降。在拥挤的脂双层膜上孵育后，Cytolysin A表现出多个明显的光漂白台阶，提示形成了多种组装中间体。

在校正标记效率后，寡聚体的最终分布显示十二聚体的溶细胞素A（Cytolysin A）为主要结构。膜蛋白结合组装及其他反应应在适当的膜拥挤环境中进行。应注意清洗成像腔室，避免破坏双层膜结构，并正确设置全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）。