Name: 聚合物拥挤脂质膜上的单分子扩散和组装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 了解单分子全内反射荧光显微镜技术在拥挤合成脂质双层上的应用，用于分析膜生物分子的结合、扩散和组装过程。该方法为研究拥挤环境对膜生物分子反应的影响提供了分子水平的见解。

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作者感谢 Benjamin Schuler 教授分享了 ClyA 蛋白的表达质粒。本工作由人类前沿科学计划（RGP0047-2020）资助。

1. 单分子实验用载玻片和盖玻片的清洗
<ol>
	<li>在组装成像室之前，清洁并准备好盖玻片和载玻片。使用带有金刚石涂层钻头（直径0.5-1 mm）的钻孔机在玻璃载玻片上钻出多对孔。如果使用丙烯酸板，则使用激光切割机制作精确的孔（0.5 mm），如图1所示。 
	注意：每对孔将作为单个微流控腔室的流体交换入口和出口。丙烯酸载玻片上孔的代表性CAD文件见补充代码文件1。在玻璃载玻片上钻出的孔通常比钻头尺寸大1.5至2倍。</li>
	<li>用洗涤剂清洗载玻片和盖玻片，然后用去离子水彻底冲洗。将载玻片和盖玻片分别放入盛有水的染色片（Coplin）瓶中，并在浴式超声仪中进行30分钟的超声处理。所有超声步骤均使用70 W的功率设置。</li>
	<li>倒掉水，将装有玻璃载玻片和盖玻片的Coplin瓶用丙酮加满（根据瓶子体积使用50-100 mL）。若使用丙烯酸板，则使用相同体积的预混50%（v/v）丙酮溶液，否则载玻片会变得雾化。摇动Coplin瓶以确保所有载玻片和盖玻片完全浸入溶液中，并在浴式超声仪中超声30分钟。</li>
	<li>倒掉丙酮并将其弃置于废液容器中，向Coplin瓶中加入甲醇（丙烯酸载玻片使用50% v/v），并超声30分钟。丙酮和甲醇均用于去除载玻片上的有机颗粒。</li>
	<li>用大量一级水冲洗载玻片和盖玻片，并将其放入玻璃制Coplin瓶中。向瓶中加入1 M KOH溶液，并超声1小时。对于丙烯酸载玻片，使用0.5 M KOH。</li>
	<li>将KOH溶液倒入无机废液容器中弃置，用大量水冲洗瓶子，并将Coplin瓶放入通风橱中进行piranha处理。丙烯酸载玻片不得进行piranha处理，应直接进入步骤1.9。 
	警告：piranha处理必须在通风橱中进行，并佩戴适当的手套、护目镜和围裙以安全操作酸液。piranha溶液是一种强氧化剂，可去除载玻片和盖玻片上残留的任何有机颗粒。</li>
	<li>配制piranha溶液时，将2/3体积的浓硫酸（98%，v/v）缓慢倒入玻璃烧杯中，再加入过氧化氢（30%，v/v）至满。用玻璃棒小心混合溶液，将其倒入Coplin瓶中，并将Coplin瓶置于通风橱中至少1小时。</li>
	<li>将Coplin瓶中的piranha溶液小心倾倒至通风橱内的酸性废液容器中，然后用大量一级水冲洗Coplin瓶。</li>
	<li>用温和的氮气流吹干载玻片和盖玻片，并将其放入洁净的Coplin瓶中。干燥后的载玻片和盖玻片现已准备好进行等离子体处理。取一对载玻片和盖玻片，放入等离子体处理仪中。</li>
	<li>在腔室内创建真空。将旋钮调至8-12 MHz的射频以在腔室内产生等离子体。腔室内出现紫色辉光表明等离子体已形成。</li>
	<li>进行8-10分钟的等离子体处理。关闭等离子体后，缓慢释放真空，然后进入步骤2以组装微流控成像室。</li>
</ol>
2. 微流控芯片的组装
注意：成像室的制备方法如下所述，将双面胶带夹在上一步骤中预先清洁的盖玻片和载玻片之间。
<ol>
	<li>等离子体处理后，按照 图1 所示组装载玻片和盖玻片。将载玻片放置在干净的纸巾上。将双面胶带切成约 2–3 mm 宽的条状，并将其贴在载玻片上一对孔的两侧。使用移液器吸头压平胶带，否则会导致一个通道向另一个通道泄漏。 
	注意：也可使用激光切割机或自动绘图切割机将胶带整体裁剪成适用于整个载玻片的尺寸（图1）。</li>
	<li>将经过等离子体处理的盖玻片放置在贴有胶带的载玻片上，以封闭反应腔室。使用移液器吸头轻轻按压盖玻片，使其与胶带区域紧密贴合，确保通道密封不漏水。</li>
	<li>若使用玻璃载玻片，需用环氧树脂密封边缘。最终，由载玻片和盖玻片制成的每个成像腔室尺寸为 10 mm × 2 mm × 0.1 mm（长 × 宽 × 深）。将制备好的微流控成像腔室置于干燥环境中保存 1–2 周（建议保存温度为 10–25 °C）。 
	​注意：对于与丙烯酸载玻片配合使用的激光切割胶带，无需使用环氧树脂，因为胶带边缘本身已形成紧密且防漏的密封。</li>
</ol>
3. 通过囊泡融合在玻璃基底上制备支撑脂双层
注意：通过掺入聚乙二醇修饰脂质（PEG-脂质）制备的脂质体与成像室壁融合，可在其表面形成拥挤的支撑脂双层膜。
<ol>
	<li>取一个洁净的玻璃小瓶，最好预先用piranha溶液清洗过。加入1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基（聚乙二醇）-2000]（DOPE-PEG2000）的氯仿溶液，其中PEG2000脂质的摩尔分数按所需比例添加，确保在步骤3.4中加入缓冲液后脂质的终浓度为3 mM。以类似方法制备其他组成的脂质膜。</li>
	<li>用温和的氮气流轻轻吹扫小瓶，并轻微旋转，使氯仿完全挥发，干燥后的脂质均匀地附着在小瓶内壁。将小瓶置于真空干燥器中1小时，以彻底去除残留的氯仿。加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS），在37 °C下孵育过夜。</li>
	<li>按以下步骤制备小单层囊泡（SUVs）。
	<ol>
		<li>过夜孵育后，轻轻涡旋1–2分钟，直至溶液变为浑浊且呈乳白色。</li>
		<li>取100 µL上述溶液置于小型500 µL离心管中，在浴式超声仪（功率设定为70 W）中超声约1小时。溶液将变得澄清；若未澄清，则继续超声30分钟。此步骤可生成直径为50–100 nm的SUVs。 
		注意：若为首次制备，建议使用动态光散射22,23（DLS）或等效方法对SUVs进行表征。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向超声处理后的囊泡中加入氯化钙（CaCl2, 3 M母液），使其在脂质溶液中的终浓度为30 mM。</li>
	<li>剪裁微量移液器吸头，使其能紧密插入成像室的孔中。混合脂质溶液后，通过步骤2中制备的成像室的一个孔注入。用洁净的纸巾擦拭从出口溢出的多余溶液，防止污染相邻通道。</li>
	<li>将该装置置于湿润 chamber 中孵育90分钟。可通过在50 mL离心管一端放置湿润的纸巾来构建湿润环境。将载玻片侧向放入管中并盖紧管盖。囊泡将发生融合，在玻璃表面形成均匀的双层膜。</li>
	<li>用大量PBS缓冲液（约为成像室体积的5倍）彻底冲洗成像室。冲洗过程中应避免气泡进入，以免在膜上产生缺陷。</li>
</ol>
4. 显微镜设置与单颗粒成像测量
注意：单分子实验在基于物镜的全内反射荧光24,25,26（TIRF）显微镜系统上进行（图2）。TIRF成像可为单分子成像提供更高的信噪比，尽管在某些条件下也可使用落射荧光显微镜（特别是当通过洗涤可将荧光生物分子从体相溶液中去除时）。可使用棱镜型TIRF系统，但物镜型TIRF更优，因其更便于微流控系统的搭建27。对于物镜型TIRF，建议使用高数值孔径物镜（100倍放大，通常作为TIRF专用物镜商业化供应）。
<ol>
	<li>在进行任何关于运动性与组装的实验之前，需先校准TIRF显微镜，以确保由隐逝场激发带来的最佳信噪比。校准过程中，激光功率应保持在较低水平，介于 100 µW 和 1 mW。 
	警告：在调整激光束时应佩戴激光防护眼镜。
	<ol>
		<li>为校准显微镜，制备荧光微球样品：将微球以低浓度（约100 pM）加入微流控通道，使单个微球产生的荧光点在图像中不发生重叠。</li>
		<li>首先，在落射荧光模式下观察微珠。在保持落射荧光照明的同时，移动M5镜片平移台（将激光反射至二向色镜的镜片），使从物镜出射的光束发生偏折，直至最终形成全内反射配置。</li>
		<li>验证是否已实现全内反射（TIR）照明。当TIR产生的渐逝场照射微珠样品时，应仅观察到表面的微珠，而无法观察到远离表面自由漂浮的微珠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验开始时，将物镜后焦面的激光功率设置为5-10 mW，以防止荧光染料发生光漂白。</li>
	<li>将载玻片保留在显微镜载物台上，首先聚焦于无荧光标记物的裸膜区域。通常，脂质膜中微量的杂质已足以完成此步骤。可选：在步骤3.1中加入少量荧光微球或量子点（亚皮摩尔浓度范围），使视野中仅存在两到五个荧光颗粒，以辅助确定正确的焦平面。</li>
	<li>使用微量移液器将样品（膜蛋白等）注入第3.7步制备的PEG-SLB包被的成像室中。</li>
	<li>用于测量单分子结合动力学时，使用注射泵将标记的生物分子通过入口孔注入微流控腔室图3). 使用50-500 µL/min.
	<ol>
		<li>在将溶液加入成像室之前开始采集视频。采集 &gt;以25-50帧/秒的帧率在持续流动条件下采集5,000帧，直至膜表面新出现的斑点不再增加视频 1）。对于结合动力学的分析，按照步骤6.1进行操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于单颗粒追踪实验，使用微量移液器将标记的生物分子以较低浓度（相对于结合常数）加入通道中。优化浓度至颗粒密度为 &lt;0.1 个颗粒/µm2 因此单个粒子极少相互交叉路径（视频 2）。这可确保从数据集中恢复的轨迹具有高保真性。如需要（若生物分子与膜结合效果较差，约10分钟），在湿润环境中孵育，并用缓冲液清洗腔室。 
	注意：如果荧光分子在膜上的结合效果较差，且大部分荧光分子仍留在溶液中，则需要进行洗涤步骤。否则，这可能会干扰成像，导致信噪比降低。</li>
	<li>对于单粒子轨迹分析，以每秒10至100帧的速度采集200至500帧图像。在采集期间，保持物镜聚焦于双层膜平面，并尽量减少载物台漂移。</li>
</ol>
5. 蛋白质组装体中亚基计数的图像采集
注意：估算化学计量比的图像采集需要对荧光染料进行持续漂白，并检测荧光信号消失前的漂白步数，直至不再有荧光染料发射荧光。
<ol>
	<li>用于测量亚基时，向微流控成像室中加入相应浓度的标记生物分子（示例：参见结果部分；ClyA 的加入浓度为 25 nM），并进行孵育（必要时可洗涤）。将载玻片置于加湿孵育 chamber 中，在所需温度下孵育指定时间（示例： 37 °C 和60分钟（用于ClyA的组装）。</li>
	<li>按照下述方法进行单分子光漂白的图像采集。
	<ol>
		<li>成像前用缓冲液清洗成像腔（如必要）。将载玻片置于显微镜上，调节焦距以观察标记的分子。</li>
		<li>将激光功率设置为使荧光染料逐渐发生漂白的水平（约1-5分钟）。理想情况下，针对每个组装的生物分子，保持光漂白步骤的速率 &gt;相隔10-20个成像帧。持续采集图像，直至所有分子完全光漂白 （视频 3）). 
		注意：为确定所需的光漂白轨迹总时长，可绘制单个斑点的平均强度随成像帧数变化的曲线，并通过拟合指数衰减函数确定时间常数。采集总时长可设置为该时间常数的5-10倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将样品引入腔室后立即开始录像采集，通过对 PEG-SLB 不同区域在膜结合后以固定时间间隔采集新的光漂白录像，进行时间依赖性组装测量。</li>
</ol>
6. 图像与数据分析
<ol>
	<li>按照以下步骤进行单颗粒结合与追踪。
	<ol>
		<li>从上述获取的视频中提取单颗粒轨迹，如图4所示。使用MATLAB软件包u-track28或ImageJ中的插件Trackmate29来检测并追踪单个颗粒，后者也提供了一种稳健的单颗粒追踪算法。按照补充文件1中所示步骤设置u-track分析。 
		注意：单颗粒追踪的关键参数是颗粒尺寸的标准差（以像素为单位）和间隙闭合长度。建议将这两个参数分别设为1和0，作为最严格的追踪标准。</li>
		<li>为计算结合速率常数，首先估算随时间结合到膜表面的颗粒数量。使用MATLAB文件binding_SPT（补充编码文件2），结合u-track输出文件夹，识别并绘制第6.1步获得的膜上出现的颗粒数量。将观察到的动力学数据拟合至适当的动力学模型（例如单指数拟合以确定时间常数，其倒数可视为表观速率常数）30，从而提取速率常数（见结果部分，图5）。</li>
		<li>扩散颗粒的均方位移（MSD）（如PEG-SLBs中的DNA示踪物，图6）可反映扩散性质。使用MATLAB软件包MSD_ISD（补充编码文件2）结合u-track输出文件夹，获得MSD随滞后时间变化的曲线图（图6B）。</li>
		<li>为识别异质性扩散组分，计算瞬时平方位移（ISD）分布，如图6C所示。推荐使用ISD2，定义为(Xt+τ - Xt)2 + (Yt+τ − Yt)2，其中滞后时间τ = 2，以降低噪声。为减少噪声，过滤掉少于三帧的短轨迹。</li>
		<li>在MATLAB中使用ISD_analyzer（补充编码文件2）结合u-track输出结果，绘制被追踪颗粒的ISD分布图（图6C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行单分子光漂白分析。
	<ol>
		<li>为估算膜复合物的化学计量比，对荧光复合物的时间依赖性强度进行光漂白分析（视频3）。为此，应用基于视频帧自相关性的漂移校正算法（drift_correct_images，补充编码文件2）提取平移漂移。该方法假设在图像采集期间组装结构基本静止。运行MATLAB软件包Extract_traces_1C（补充编码文件2）从视频中检测颗粒强度的时间轨迹。</li>
		<li>使用MATLAB代码Stepcount_immobile（补充编码文件2）对强度时间轨迹进行台阶检测。若颗粒并非完全静止，可使用u-track软件包提取运动颗粒的位置。该组xy坐标可用于映射原始视频，以提取颗粒在膜上侧向扩散过程中的强度值。对于此情况，使用MATLAB软件包utrack_Int（补充编码文件2）结合u-track分析的输出结果。</li>
		<li>对生物分子荧光标记不完全的情况进行校正，以准确估算蛋白质复合物的化学计量比。使用紫外-可见光分光光度计测量染料和蛋白质的吸光度以估算浓度，从而确定标记效率。将标记效率计算为染料与蛋白质的摩尔比。 
		注意：某些染料在接近280 nm波长处也有吸收，因此在浓度计算时应考虑染料的这一吸收贡献。</li>
		<li>采用以下方式使用MATLAB代码Step_correction（补充编码文件2）对荧光标记的不完全标记效率进行二项式校正，所用数据来自第6.2.2步的台阶计数。例如，对于形成十二聚体环状结构的成孔毒素（如Cytolysin A），使用以下公式进行二项式校正： 
		nk <img alt="静态平衡公式 Σ，包含概率与二项式系数的数学方程。" src="/files/ftp_upload/64243/64243eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程1"> 
		其中 <img alt="静态平衡 ΣF=0 图示；物理概念；平衡分析；矢量力分解。" src="/files/ftp_upload/64243/64243eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程2"> = 标记效率，n = 光漂白台阶数，s = 实际计数值。使用MATLAB程序Stepcount_immobile恢复校正后的寡聚体种类。将寡聚体频率（si）转换为质量分数（图7C；补充编码文件2）。 
		注意：补充编码文件3中包含一组经u-track分析的文件。可使用这些数据集运行补充编码文件2中的MATLAB代码。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文展示了在支持性脂双层（SLB）上进行的单分子实验，该系统可模拟膜结合生物分子所处的拥挤环境。这种拥挤环境会产生排除体积效应，从而增强生物分子间的相互作用1,2,39,40。在聚乙二醇-脂质（PEG-lipid）体系中，聚合物主要占据脂双层外部的空间，因此对于具有较大胞外结构域的分子而言，该效应尤为显著。因此，与亲脂性染料相比，嵌入膜内的大分子亲水性物质（如受体、糖蛋白和糖脂）的扩散会显著受限。通过使用经生育酚锚定在膜上的荧光示踪DNA（图5），我们可以识别此类拥挤效应。
此外，底侧叶中存在聚乙二醇（PEG）也会将支撑脂双层（SLB）抬离基底，从而减弱生物分子与支撑基底之间的相互作用14,<sup ...

细胞膜是高度拥挤且复杂的系统1。分子拥挤可显著影响膜结合实体（如蛋白质和脂质）的扩散行为2,3,4。类似地，脂质膜上的双分子反应（如受体二聚化或膜复合物的寡聚化）也受到拥挤效应的影响5,6,7。拥挤分子的性质、构型和浓度可通过多种方式调控膜结合能力、扩散性以及蛋白质-蛋白质相互作用8,9。由于在细胞膜上控制膜拥挤程度并解析其对嵌入生物分子的影响具有挑战性，研究人员已尝试建立替代的体外（in vitro）系统10。
一种构建人工拥挤膜的常用方法是将聚合物（如聚乙二醇，PEG）接枝的脂质掺入双层膜中11,12在可视化支撑脂双层（SLBs）上蛋白质与脂质动态的过程中，这些聚合物还能通过将脂双层有效抬离下方带负电荷的基底（如玻璃），从而保护膜嵌入组分免受基底影响。通过调节聚合物的尺寸和浓度，可控制分子拥挤程度及其与下方固体支撑之间的距离。13,14这显然优于无聚合物垫层支撑的固体基底上的脂双层。15,16，其中跨膜生物分子可能会失去其活性17,18,19更重要的是，它使我们能够重现细胞膜的拥挤环境 体外，这对于许多膜过程至关重要。
膜表面接枝的聚合物也会根据其接枝密度的不同而发生构型变化12。在低密度时，它们在膜表面以上保持熵驱动的卷曲构型，称为“蘑菇”状构型。随着密度增加，聚合物链开始相互作用，逐渐伸展并解卷曲，最终在膜表面形成致密的刷状结构21。由于从蘑菇状向刷状构型的转变具有高度异质性，并且在聚合物性质未充分表征的条件下表现不明确，因此在聚合物接枝膜上使用经过充分表征的拥挤条件至关重要。与最近的一项研究20相比，我们鉴定并报道了能够维持跨膜生物分子扩散传输能力和生物活性的拥挤膜组成。
在本方案中，我们讨论如何制备聚乙二醇化脂质膜，并针对聚合物构型的两种不同状态（即蘑菇状和刷状）提供模拟分子拥挤效应的聚乙二醇（PEG）密度建议。该方案还描述了嵌入此类拥挤膜中分子的单分子结合、粒子追踪以及光漂白数据的采集与分析方法。首先，我们介绍成像腔室的彻底清洗步骤、组装过程以及PEG化固相脂双层膜（PEG-SLBs）的制备。其次，我们详细说明单分子结合、粒子追踪和光漂白实验的操作流程。第三，我们讨论如何从膜上单分子成像视频中：i）提取相对结合亲和力，ii）表征分子扩散行为，以及 iii）计数蛋白质复合物中的亚基数目。
尽管我们使用单分子成像技术对这一系统进行了表征，但该实验方案对于所有希望研究拥挤效应对脂质膜上生物分子反应影响的膜生物物理学者均具有实用价值。总体而言，我们提供了一套可靠的流程，用于制备拥挤且有支撑的脂质双层膜，并介绍了在该体系上开展的多种单分子实验及其相应的分析方法。

<table><tbody><tr><td>2.5 ml 注射器</td><td>HMD Healthcare</td><td>Dispo Van, 2.5 ml 结核菌素注射器</td><td>塑料注射器</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Finar Chemicals</td><td>10020LL025</td><td></td></tr><tr><td>亚克力板</td><td></td><td></td><td>2 mm 厚</td></tr><tr><td>亚克力板</td><td>BigiMall</td><td></td><td>2 mm，透明</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson</td><td>CPX-1800</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>528730</td><td>&amp;nbsp;HPLC 级</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Avanti</td><td>700100</td><td></td></tr><tr><td>柯普林瓶</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>S6016</td><td>8 片装载玻片瓶，带玻璃盖</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-1574</td><td>24 mm × 50 mm</td></tr><tr><td>Cy3-DNA 链</td><td>IDT</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT&lt;br/&gt; GGTGTGGTTGG-Cy3</td></tr><tr><td>花菁染料（Cy3）</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D3911</td><td>DiI 染色剂（1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐（'DiI'；DiIC18(3)））</td></tr><tr><td>DNA 连接链 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT&lt;br/&gt; GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC&lt;br/&gt; T</td></tr><tr><td>DNA 连接链 2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CGGACGCAATAGCAGCTCACAG&lt;br/&gt; TCGGTCACAT</td></tr><tr><td>DNA 生育酚链</td><td>Biomers</td><td></td><td>Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA</td></tr><tr><td>DOPE-PEG2000</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐）</td></tr><tr><td>双面胶带</td><td>3M</td><td>LF93010LE</td><td></td></tr><tr><td>钻头（金刚石涂层）</td><td></td><td></td><td>0.5 - 1 mm</td></tr><tr><td>钻孔机</td><td>Dremel</td><td>220</td><td>工作台</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>荧光微球</td><td>Invitrogen</td><td>F10720</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Blue Star</td><td></td><td>显微载玻片，PIC-1</td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>Sigma</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Lobachemie</td><td>00182</td><td>30% 溶液，分析纯级</td></tr><tr><td>Labolene</td><td>Thermo-Fischer Scientific</td><td></td><td>&amp;nbsp;洗涤剂</td></tr><tr><td>532 nm 激光器</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>激光切割机</td><td>Universal Laser Systems</td><td>ILS12.75</td><td></td></tr><tr><td>丽丝胺罗丹明 DOPE</td><td>Avanti</td><td>810150</td><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(丽丝胺罗丹明 B 磺酰基)（铵盐）</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Finar Chemicals</td><td>30932LL025</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td>1X</td></tr><tr><td>等离子清洗机</td><td>Harrick Plasma Inc</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti</td><td>850457</td><td>1-棕榈酰-2-油酰-甘油-3-磷脂酰胆碱</td></tr><tr><td>可编程注射泵</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE1010</td><td>高压注射泵</td></tr><tr><td>PTFE 盖帽</td><td>Sigma</td><td>27141</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 管</td><td>Cole-Parmer</td><td>WW-06417-21</td><td>Masterflex，内径 0.022&quot; × 外径 0.042&quot;</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>SD Fine Chemicals</td><td></td><td>98%，分析纯级</td></tr><tr><td>TIRF 物镜</td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

细胞膜是生物分子反应和信号传导高度拥挤的环境。然而，大多数研究蛋白质与脂质相互作用的体外（in vitro）实验采用的是裸露的双层膜体系。这类系统缺乏膜嵌入蛋白和糖类造成的拥挤效应，也未包含细胞膜表面所存在的相应空间位阻效应。此外，脂质双层通常构建在带负电荷的玻璃表面，这会阻碍跨膜生物分子的自由扩散。本文介绍一种经过充分表征的聚合物-脂质膜，可作为模拟拥挤脂质膜的模型体系。本实验方案采用聚乙二醇（PEG）修饰的脂质分子，作为在支撑性脂质双层&#160;（SLB）中引入拥挤因子的通用方法。首先，介绍用于单分子实验的显微镜载玻片和盖玻片的清洗步骤。随后，阐述对PEG修饰的SLB进行表征的方法，并讨论利用单分子示踪和光漂白技术开展生物分子结合、扩散及组装过程的单分子实验。最后，本方案演示如何通过单分子光漂白分析，在拥挤脂质膜上监测细菌成孔毒素Cytolysin A（ClyA）的纳米孔组装过程。同时提供包含示例数据集的MATLAB代码，用于执行粒子追踪、提取扩散行为以及亚基计数等常见分析任务。

监测ClyA蛋白在聚乙二醇化膜上的结合 
在步骤4.5之后，通过绘制随时间结合到膜表面的颗粒数量来估算结合动力学（视频1）。当ClyA蛋白结合至含有5 mol% PEG2000脂质的膜时，颗粒密度增加并达到饱和（图5）。对结合颗粒（青色圆圈）进行指数衰减拟合可得到膜结合的时间常数（τb）（值得注意的是，本例中未对初始时间点[红色圆圈]进行拟合）。
拥挤膜上DNA示踪剂的移动性 
我们通常使用DNA示踪剂（通过生育酚锚定在膜上）、亲脂性示踪染料（例如DiI）或膜蛋白（例如ClyA）来表征PEG介导的拥挤环境下的膜。通过成像颗粒结合后的膜，可以监测标记示踪分子（25–100 pM）的侧向扩散。当膜中不存在任何PEG聚合物时，大多数示踪剂（尤其是那些延伸出双分子层外部的）在支撑脂双层（SLB）上表现出受限扩散（图6A）。当膜中含有少量P...

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。

细胞膜是生物分子反应和信号传导的高度拥挤环境。然而，大多数体外实验在研究蛋白质相互作用时……

由于嵌入的蛋白质和糖类的存在，细胞膜具有高度的拥挤性。我们展示了在合成的拥挤支撑脂双层上进行单分子成像的方法。该平台可用于在分子水平上研究拥挤效应对膜内生物分子反应的影响。本方案阐述了膜生物分子结合、扩散和组装的分析方法。实验成功的关键在于严格清洁基底、避免双层膜受损，以及在单分子成像中保持高信噪比。与我共同演示该实验的是实验室的研究生Aditya Upasani和Vishwesh Haricharan Rai。首先将经过等离子处理的丙烯酸载片放置在干净的纸巾上。撕去双面激光切割胶带的保护膜，并将其粘贴到载片上。使用移液器吸头压平胶带，以防止液体从一个通道泄漏到另一个通道。通过将经等离子处理的盖玻片放置在贴有胶带的载玻片上，封闭腔室。使用移液器吸头轻轻按压盖玻片在胶带区域，使通道密封不漏水。若使用玻璃载玻片，需用环氧树脂密封边缘。将制备好的微流控成像腔在干燥条件下储存一至两周。取经 Piranha 溶液预清洗的玻璃小瓶，加入 POPC 和 DOPE-PEG(2000) 的氯仿溶液，其中 PEG 2000 脂质的摩尔分数按所需比例配制，以便在加入缓冲液后获得终浓度为 3 毫摩尔的脂质溶液。同样地，也可制备其他脂质膜组成。接下来，用氮气轻轻吹扫小瓶，同时轻微旋转，以除去氯仿，使目标脂质均匀地涂覆在小瓶内表面。将小瓶置于真空干燥器中一小时，以去除残留的氯仿。然后向小瓶中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），于37摄氏度孵育过夜。经过过夜孵育后，轻轻涡旋小瓶一到两分钟，直至溶液变为浑浊且呈乳白色。然后将100 µL该溶液转移至一个小型的500 µL离心管中。为制备直径为50至100纳米的小型单层囊泡，需将溶液在水浴超声仪中超声处理约一小时。超声处理结束后，溶液将变得澄清；如果溶液仍然浑浊，则需继续超声30分钟。然后向超声处理后的囊泡中加入氯化钙，使其在脂质溶液中的终浓度为30毫摩尔。剪裁微量移液器吸头以便注入样品溶液，使其能够紧密地插入孔中。将脂质溶液混合后，通过成像室的其中一个孔注入。用干净的纸巾擦拭从出口处溢出的多余溶液，以防止相邻通道受到污染。通过在50毫升离心管末端放置湿润的纸巾，制备一个保湿室。将载玻片放入试管中并盖紧管盖。将试管平放，置于湿润化室内孵育90分钟，建议在37摄氏度的培养箱中进行。用大量PBS缓冲液彻底清洗孵育室，清洗过程中避免气泡进入孵育室，以免在膜上产生缺陷。在进行任何关于运动性和组装的实验之前，需通过制备荧光微球样品并将它们以低浓度加入微流控通道中，来校准TIRF显微镜，确保单个微球产生的荧光点在图像中不发生重叠。首先，在落射荧光模式下观察微球。当照明处于落射荧光模式时，移动位于平移台上的M5反射镜，使从物镜出射的光束发生偏折，直至达到全内反射的配置状态。为了验证是否已实现全内反射（TIR）照明，请检查当TIR倏逝场照射微珠样品时，是否仅有表面的微珠可见，而远离表面的游离微珠不可见。实验开始时，将激光在物镜后焦面的功率设置为5至10毫瓦，以防止荧光染料发生光漂白。将载玻片置于显微镜载物台上，首先聚焦于裸膜；脂膜中少量的杂质痕迹已足以用于观察膜结构。使用微量移液器将样品注入涂有 PEG 支持性脂质双层（SLB）的成像室中。为测量单分子结合动力学，使用注射泵以每分钟 50 至 500 微升的流速将标记的生物分子通过入口孔注入微流控室。为以每秒 25 至 50 帧的速度记录 5,000 帧，需设置相应的视频采集参数。启动录像采集，通过注射泵持续流动，采集超过 5,000 帧图像，直至膜表面不再有新的信号点出现，并按照论文中所述方法分析结合动力学。对于单颗粒追踪实验，使用微量移液器将标记的生物分子以低浓度加入微流道中。为确保从数据集中恢复的轨迹具有高保真度，需优化浓度，使颗粒密度低于每平方微米 0.1 个颗粒，从而避免单个颗粒轨迹频繁交叉。如有需要，将腔室置于湿润环境中孵育，并在成像前用缓冲液洗涤。对于单粒子轨迹分析，以每秒10至100帧的速度采集200至500帧图像，并在图像采集期间保持物镜聚焦于双分子层平面，同时尽量减少载物台漂移。对于亚基测量，将适当浓度的标记生物分子加入微流控成像腔室中，并将载玻片置于湿润腔室内，在所需温度下孵育指定时间。成像前，用缓冲液清洗成像腔。将载玻片置于显微镜上，调节焦距以观察标记的分子。将激光功率设置为使荧光染料逐渐发生漂白的水平。理想情况下，针对每个组装的复合物，应控制激光功率，使光漂白步进间隔保持在10到20帧之间（如论文所述），并持续采集图像直至所有分子完全光漂白。在样品加入反应腔室后立即开始录像采集，通过在PEG修饰的固体支持双层膜（PEG SLB）的不同区域，以固定时间间隔采集新的光漂白电影，从而进行时间依赖性的组装测量。Cytolysin A与含有5 mol% DOPE-PEG(2000)的脂质膜结合后，表现出粒子密度增加，并达到饱和状态。对结合的颗粒拟合指数衰减函数，可得到细胞溶素A膜结合的时间常数。当膜中不含任何PEG聚合物时，大多数示踪分子在固相脂双层（SLB）上表现出受限扩散。当膜双层中含有少量PEG 2000时，膜从底层表面抬升，使示踪分子能够不受表面限制地自由扩散。然而，在双层膜中聚乙二醇（PEG）浓度较高时，观察到严重的受限扩散现象。在两种不同PEG 2000脂质膜中，亲脂性DNA示踪剂的ISD2分布显示，PEG浓度升高时其扩散能力下降。在拥挤的脂双层膜上孵育后，Cytolysin A表现出多个明显的光漂白台阶，提示形成了多种组装中间体。在校正标记效率后，寡聚体的最终分布显示十二聚体的溶细胞素A（Cytolysin A）为主要结构。膜蛋白结合组装及其他反应应在适当的膜拥挤环境中进行。应注意清洗成像腔室，避免破坏双层膜结构，并正确设置全内反射荧光显微镜（TIRF显微镜）。

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