利用等温滴定量热法测定DNA适配体与四环素结合的热力学和动力学参数

本方案使研究人员能够测定适配体与溶液中游离靶标之间的结合亲和力，同时深入了解其结合机制。由于等温滴定量热法（ITC）通过测量结合过程中产生的热量变化来实现检测，因此无论是适配体还是配体均无需标记或功能化修饰，这一点与表面等离子共振（SPR）等技术不同。新用户应特别注意确保所有结合组分之间缓冲液的一致性。

此外，需注意该技术对样品量要求较高，对于蛋白质等较大的配体可能难以满足。开始时，先活化透析柱的膜，加入 PBS 缓冲液，在室温下平衡 10 分钟，然后在 5,000 × g 条件下离心 15 分钟。弃去缓冲液，将 500 微升的适配体样品加入柱中。

在5,000 × g条件下离心，并重复四次，以将原始缓冲液置换为PBS。使用移液器收集透析后的DNA适配体，并转移至新的1.5毫升离心管中。收集最后的穿流缓冲液用于溶解四环素。

确保注射器中用于实验的缓冲液与参比池中的缓冲液一致。使用紫外-可见分光光度计重新测定适配体浓度。使用最后一次更换的缓冲液将浓度调整至40 µM 四环素和2 µM 适配体。

将DNA适配体在90摄氏度加热10分钟，然后在4摄氏度冷却10分钟，再恢复至室温20分钟以完成折叠。使用脱气站或真空泵对折叠后的适配体和透析过的四环素进行25分钟脱气处理，以去除溶解的气体。在清理并确认仪器洁净后，使用包含EDTA和氯化钙的标准试剂盒，按照制造商的说明和默认程序测试仪器的准确性。

设置运行参数。使用运行程序计算器检查所需的体积。采用该运行参数，使用等温滴定量热仪（ITC），将230微升浓度为40微摩尔的四环素加入ITC注射器中，将485微升浓度为2微摩尔的适配体置于ITC样品池中进行ITC测量。

使用移液器将透析后的四环素注射器板和折叠好的适配体加入样品池中，注意避免产生气泡。通过点击软件上的“开始”按钮启动等温滴定量热仪（ITC）。通过双击打开数据分析软件，开始分析数据。

打开已保存的原始数据路径，以了解结合趋势。点击“建模”选项卡，使用不同的结合模型拟合数据曲线，找到最佳匹配模型。随后，软件将自动计算等温滴定量热（ITC）热谱图及多种热力学参数，包括焓变、熵变、自由能、平衡结合常数和化学计量比。

收集由数据和拟合模型确定的热力学参数。生成一份报告，包括等温滴定量热（ITC）热谱图及各种热力学参数。Kim 等人筛选出的适配体与四环素结合，其解离常数一为 13 微摩尔，解离常数二为 53 纳摩尔。

ITC 的拟合模型和化学计量比表明，该适配体通过 2:1 的结合比例，以连续结合模型与四环素结合。ITC 测定得到的第二结合位点的热力学参数显示，焓变克服了相对显著的熵损失，从而驱动了强结合。这种以焓驱动且伴随熵减少的结合与核酸构象变化相关，已有文献报道其为 RNA 与小分子之间的结合行为。

适配体和配体必须处于相同的缓冲体系中。如果适配体在开发过程中需要复性，则应进行复性处理，且样品必须脱气。注意这些因素可确保所测信号仅来源于适配体与配体之间的相互作用。

由于适配体靶标的尺寸较小，可采用微量热泳法作为后续验证方法，以确认溶液中游离状态下的结合亲和力。