Name: 模型线虫秀丽隐杆线虫天然微生物群的分离和表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 学习从环境样本中分离秀丽隐杆线虫天然微生物群的方法，利用PCR技术鉴定线虫相关微生物。该方案有助于在受控实验室环境中研究微生物群与宿主的相互作用及其对宿主生物学的影响。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢德国科学基金会（协同研究中心1182“共生体的起源与功能”项目A1.1和A1.2）提供的经费支持。感谢舒伦堡实验室成员给予的建议与支持。

1. 缓冲液和培养基的制备
<ol>
	<li>通过将 5.85 g NaCl、1.123 g K2HPO4、5.926 g KH2PO4 和 1 L 去离子 H2O 加入烧瓶中，于 121 °C 高压灭菌 20 分钟，制备 S 缓冲液。</li>
	<li>通过向 S 缓冲液中加入 1.2% (w/v) 羟甲基纤维素（引起培养基黏性的物质）、5 mg/mL 胆固醇、1 mM MgSO4、1 mM CaCl2 和 0.1% (v/v) 丙酮，制备黏性培养基。高压灭菌后持续搅拌，直至黏性培养基完全均匀。 
	注意：此过程可能需要数小时。此外，S 缓冲液也可在未预先灭菌的情况下直接配制并加入黏性培养基中。</li>
	<li>通过将 3 g KH2PO4、6 g NA2HPO4·2 H2O、5 g NaCl 和 1 L 去离子 H2O 加入 1 L 烧瓶中，制备 M9 缓冲液。将溶液高压灭菌，冷却后加入 1 mL 1 M MgSO4（将 123.24 g MgSO4·7H2O 溶于 500 mL 去离子 H2O 中，过滤除菌）。</li>
	<li>通过将 5 mL Triton X-100 与 45 mL M9 缓冲液混合，配制 10% (v/v) Triton X-100 储存液。使用 0.2 µm 滤膜过滤除菌。</li>
	<li>在高压灭菌后的 1 L M9 缓冲液中加入 2.5 mL 10% (v/v) Triton X-100 储存液，配制含 Triton X-100 的 M9 缓冲液（M9-T），终浓度为 0.025% (v/v)。</li>
	<li>在 50 mL 离心管中将 15 mL 无菌 100% 甘油与 35 mL 无菌 S 缓冲液混合，配制 30% (v/v) 甘油 S 缓冲液。</li>
</ol>
2. 环境样品的制备（图1）
<ol>
	<li>采集堆肥或腐烂水果等环境样品，并将每份样品分别放入独立的塑料袋、试管或其他洁净容器中。 
	注意：为了吸引线虫，可在采样前数周将苹果放置于堆肥上。</li>
	<li>将环境样品的碎片均匀铺展在一个空的、无菌的 9 cm 培养皿中。 
	注意：腐败程度较高的样品更可能含有 C. elegans。可选地，可使用含有无蛋白胨琼脂培养基（PFM）的培养皿以增强对比度。</li>
	<li>小心地用约 20 mL 无菌黏性培养基覆盖样品。 
	注意：线虫会在 1–2 小时内上浮至表面。黏性培养基可减缓线虫的运动，便于取样。可选用无菌 M9 缓冲液作为替代，但线虫运动速度会更快。</li>
</ol>
<img alt="样品制备流程：收集、接种、加入培养基、清洗线虫、转移至缓冲液。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64249/64249fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 1"> 
图1：从基质中分离线虫。 将基质样品置于空的培养皿中，并加入黏性培养基以冲出线虫。将线虫转移至M9-T缓冲液中，并反复清洗以去除体表附着的细菌。单个线虫可用于DNA提取、共生菌分离，或接种到琼脂平板上以培养线虫种群。本图由BioRender.com制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64249/64249fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 线虫属（Caenorhabditis）线虫的分离（图1）
<ol>
	<li>搜索 秀丽隐杆线虫 使用解剖显微镜观察线虫，遵循《WormBook》中关于线虫分离的章节所提出的指导原则 C. elegans 以及Barrière和Félix研究的相关线虫27. 
	注意： 秀丽隐杆线虫 雌雄同体/雌性个体在透射光下具有浅棕色的肠道。此外，其肠细胞具有较大的细胞核，表现为可见的白色小点。相比之下，其他线虫物种的肠道常呈深棕色，色素分布常表现出前后不对称性，且通常无可见的细胞核。成体的阴门 秀丽隐杆线虫 在动物体中部可观察到雌雄同体/雌性个体的阴门位置。其他线虫分类群并不总是表现出这种阴门定位特征。 秀丽隐杆线虫 线虫具有两个咽部膨大，这两个结构在足够放大倍数及透射照明下均可见，且与其他许多线虫类群形成对比。 秀丽隐杆线虫 线虫具有尖细的尾部，而其他一些线虫则具有圆形的尾部。</li>
	<li>收集 秀丽隐杆线虫 在解剖显微镜下，用20-微升移液器将线虫转移至尽可能少的液体中100 µL 移液器。将收集的线虫直接转移至无菌3 cm培养皿中的1-3 mL无菌M9-T溶液中，用于清洗线虫以去除未附着的微生物（步骤3.3）；或者， alternatively，将单条线虫转移至含有线虫生长培养基（NGM）的平板上，以建立线虫种群（步骤3.4）。</li>
	<li>洗涤线虫以去除其体表的微生物。 
	注意：本实验方案可富集肠道细菌，但无法完全去除附着在蠕虫角质层上的细菌。
	<ol>
		<li>将线虫在 M9-T 中孵育 10–15 分钟。</li>
		<li>将线虫用尽可能少的液体转移至新的无菌3 cm培养皿中的1-3 mL新鲜M9-T缓冲液中。</li>
		<li>重复孵育，并将线虫再转移到新鲜的M9-T中两次。 
		注意：以下步骤可使用单条线虫或线虫群体进行。此时，线虫可用于后续的表征分析 秀丽隐杆线虫 以及相关微生物，并分离细菌（步骤4和5）。或者，可将它们 individually 转移至NGM平板以建立线虫种群（步骤3.4）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为获得线虫群体，用移液器将单个线虫转移至NGM平板。 
	注意：仅限雌雄同体的线虫，例如 秀丽隐杆线虫 或 C. briggsae 能够从单条蠕虫产生后代。然而，其他物种的单条蠕虫如果此前已交配，仍可能产生后代。
	<ol>
		<li>自然分离的线虫肠道内通常含有细菌，这些细菌会随线虫排泄到NGM平板上，在平板上生长并作为食物来源供后续利用 秀丽隐杆线虫不要添加单独的食物生物，例如标准的实验室食物生物， E. coli 菌株 OP50 
		注意：在培养皿上饲养线虫会影响其相关细菌群落的组成，但该组成仍与自然状态下的群落组成具有可比性 C. elegans 分离株6,7.</li>
		<li>让线虫在适宜温度下（例如 15-20 °C 适用于温带地区）。将这些线虫冷冻（步骤 3.5）或用于表征分析 秀丽隐杆线虫 以及相关微生物的分离（步骤4和5）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>线虫的长期保存冷冻法
	<ol>
		<li>将线虫留在培养皿中，直至食物细菌消失，且培养皿上主要剩下幼虫阶段的个体。用1.5 mL S缓冲液将线虫从培养皿中冲洗下来。</li>
		<li>混合 500 µL 用含蠕虫的S缓冲液充分混匀 500 µL 体积分数为30%的甘油S缓冲液中，置于无菌2 mL离心管内。立即在-80℃下冷冻保存。80 °C 用于长期保存，否则甘油可能对线虫造成伤害。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 准备用于分子鉴定的线虫 秀丽隐杆线虫 和微生物
<ol>
	<li>为无偏鉴定与线虫相关的微生物，准备一个96孔板，每孔加入三颗无菌的1 mm珠子， 19.5 µL PCR缓冲液，以及 0.5 µL 每孔加入蛋白酶K（20 mg/mL）。用移液器将一只经洗涤的线虫转移至各孔中，尽量减少液体的带入。</li>
	<li>也可以使用线虫群体。具体操作为：用M9缓冲液将线虫从培养板上冲洗下来，并转移约~300 µL 将含线虫的M9缓冲液加入含有10-15颗珠子的2 mL离心管中。</li>
	<li>使用珠磨均质器破碎线虫（例如，在30 Hz条件下珠磨3分钟）。短暂离心培养板或离心管，使液体沉至管底（例如，在8000 x g条件下离心10秒）。 g 室温 [RT]</li>
	<li>鉴定 秀丽隐杆线虫
	<ol>
		<li>通过将样品在PCR仪中于95°C加热1小时，分离单个线虫的DNA 50 °C 15 分钟 95 °C使用任意选择的DNA提取方法分离线虫群体的DNA（不同商业试剂盒提取方法的示例方案）7,9). 将 DNA 在 -20 °C 用于长期保存。</li>
		<li>用于鉴定 秀丽隐杆线虫， 使用DNA和引物对nlp30-F（表1，5'-ACACATACAACTGATCACTCA-3'）和 nlp30-R（表1，5'-TACTTTCCCCATCCGTATC-3'）进行PCR，具体操作遵循所选Taq酶供应商的说明书。</li>
		<li>使用以下PCR条件：初始变性步骤在 95 °C 2分钟，随后进行35个循环的 95 °C 45 秒， 55 °C 30 秒 72 °C 1分钟，以及最后在 72 °C 5 分钟。 秀丽隐杆线虫 产生一条154 bp的PCR产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表征与线虫相关的细菌 通过 使用分离的DNA对V3-V4区进行16S扩增子测序
	<ol>
		<li>使用选定的16S引物制备16S文库，并遵循文库制备试剂盒的说明书操作。一种选择是使用引物341F（表1，5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3') 和 806R（表1，5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'），扩增16S rRNA基因的V3-V4区，所得序列可利用标准数据库进行较高分辨率的分类7. 
		注意：此步骤中输入 DNA 的量至关重要。从单条线虫获得的 DNA 量将远少于从线虫群体中获得的 DNA 量。对于单条线虫，可能需要增加输入 DNA 的量或增加 PCR 循环次数。7.</li>
		<li>文库可使用合适的测序试剂盒在测序平台上进行测序。 
		注意：此处使用 MiSeq 平台并配合适宜的 MiSeq 试剂盒。试剂不断优化，应选择符合最新标准的试剂。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 线虫相关细菌的分离与培养（图2）
<ol>
	<li>为分离细菌，准备一个96孔板，每孔加入三颗无菌的1 mm珠子和20 µL M9缓冲液，并用移液器将单个经过清洗的线虫转移至各孔中，尽量减少液体的带入。 
	注意：也可用M9缓冲液将线虫群体从培养板上冲洗下来，然后将约300 µL含线虫的M9缓冲液转移至含有10–15颗珠子的2 mL离心管中。无论采用何种方法，所用线虫均应来自已通过步骤4.1–4.4鉴定为C. elegans的培养物。</li>
	<li>使用珠磨均质仪（例如，在30 Hz条件下珠磨3分钟）破碎线虫。短暂离心96孔板或离心管，使液体沉降至底部（例如，在室温下以8000 × g离心10秒）。 
	注意：采用该方法所分离出的细菌类群与16S rDNA扩增子测序结果相似7，表明所述珠磨处理能使大多数细菌细胞保持完整。</li>
	<li>收集上清液，按1:10比例进行连续稀释，并将最多100 µL稀释液涂布于9 cm的琼脂平板上。
	<ol>
		<li>为确保大多数细菌能够被培养，应使用多种不同营养成分的替代培养基，包括稀释的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA，1:10稀释）、麦康凯琼脂、沙氏葡萄糖琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂或酵母蛋白胨葡萄糖琼脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将平板置于采样地点的平均温度条件下（例如，温带地区为15–20 °C）培养24–48小时。</li>
	<li>采用标准三区划线法并使用无菌接种环获得纯细菌培养物（图2）。
	<ol>
		<li>使用无菌接种环或牙签从平板上挑取单个菌落，并将其划线接种至新的琼脂平板上，新平板应含有与纯化时相同的琼脂培养基。注意仅使用平板约1/3的面积。</li>
		<li>使用新的无菌接种环，或对可重复使用的接种环进行灭菌后，将其穿过第一区划线区域，进而在同一平板的另外1/3区域进行第二区划线。</li>
		<li>重复此步骤，将无菌接种环穿过第二区划线区域进行第三区划线。</li>
		<li>将平板置于与分离时相同的培养条件下进行培养。该技术应在第三区划线区域形成单个孤立菌落。 
		注意：由于自然分离株倾向于形成生物膜和/或聚集体，可能需要多次重复纯化步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将纯菌落在液体培养基（与琼脂培养基类型相同）中培养，培养温度和时间与上述步骤5.4相同。</li>
	<li>通过将300 µL细菌培养物加入200 µL 86%（v/v）甘油（溶于相应生长培养基中，例如TSB）中制备细菌保存液，上下吹打混匀。或者，通过将50 µL细菌培养物与50 µL 7%（v/v）DMSO混合制备DMSO保存液。置于-80 °C冷冻保存以实现长期储存。</li>
	<li>利用全长16S核糖体RNA基因测序对细菌进行表征
	<ol>
		<li>采用合适的方法从纯液体培养物中提取细菌DNA（例如，使用DNA提取试剂盒；根据经验，CTAB法提取效果良好22）。</li>
		<li>使用引物27F（表1，5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1495R（表1，5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA -3'）28扩增16S rRNA基因，并采用以下PCR程序：95 °C预变性2分钟，22个循环（95 °C 30秒；55 °C 30秒；72 °C 100秒），最后在72 °C延伸5分钟。</li>
		<li>为获得完整序列，还需使用两个内部测序引物，例如701F（表1，5'-GTGTAGCGGTGAAATGCG-3'）和785R（表1，5'-GGATTAGATACCCTGGTAGTCC-3'）6。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="细菌培养流程图，包含系列稀释、孵育、菌落筛选和冻存前处理" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64249/64249fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2物种鉴定与单个细菌的分离 使用珠磨匀浆器破碎单个线虫，提取DNA用于物种鉴定 通过 PCR 或测序。或者，将破碎的线虫样品进行连续稀释后涂布于生长培养基平板上。将平板孵育至细菌菌落出现，挑取单菌落划线接种至新的平板以获得纯培养物。挑取纯培养物的单菌落用于培养液体细菌培养物，以制备用于长期保存于 -80 °C 的细菌保存液。80 °C图由 BioRender.com 制作。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64249/64249fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

<ol><li>Schulenburg, H., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+biotic+environment+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).</li>
<li>Petersen, C., Dirksen, P., Prahl, S., Strathmann, E. A., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prevalence+of+Caenorhabditis+elegans+across+1.5+years+in+selected+North+German+locations%3A+the+importance+of+substrate+type%2C+abiotic+parameters%2C+and+Caenorhabditis+competitors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">The prevalence of Caenorhabditis elegans across 1.5 years in selected North German locations: the importance of substrate type, abiotic parameters, and Caenorhabditis competitors.</a> BMC Ecology. 14 (1), 4(2014).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Travelling+at+a+slug%27s+pace%3A+possible+invertebrate+vectors+of+Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ecology%22%5BJournal%5D)">Travelling at a slug's pace: possible invertebrate vectors of Caenorhabditis nematodes.</a> BMC Ecology. 15 (1), 19(2015).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10 (8), 1998-2009 (2016).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+native+microbiome+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+gateway+to+a+new+host-microbiome+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The native microbiome of the nematode Caenorhabditis elegans: gateway to a new host-microbiome model.</a> BMC Biology. 14 (1), 38(2016).</li>
<li>Johnke, J., Dirksen, P., Schulenburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+assembly+of+the+native+C.+elegans+microbiome+is+influenced+by+time%2C+substrate+and+individual+bacterial+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Community assembly of the native C. elegans microbiome is influenced by time, substrate and individual bacterial taxa.</a> Environmental Microbiology. 22 (4), 1265-1279 (2020).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 485(2017).</li>
<li>Dirksen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CeMbio+-+The+Caenorhabditis+elegans+microbiome+resource%5BTitle%5D)+AND+%22G3+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+repertoire+contained+within+the+native+microbiota+of+the+model+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The functional repertoire contained within the native microbiota of the model nematode Caenorhabditis elegans.</a> The ISME Journal. 14 (1), 26-38 (2019).</li>
<li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+effects+of+C.+elegans+protective+natural+microbiota+on+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Exploring effects of C. elegans protective natural microbiota on host physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 775728(2022).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+genetic+variation+drives+microbiome+selection+in+the+Caenorhabditis+elegans+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut.</a> Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2%2FBMP+immune+signaling+affects+abundance+and+function+of+C.+elegans+gut+commensals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">TGFβ/BMP immune signaling affects abundance and function of C. elegans gut commensals.</a> Nature Communications. 10 (1), 604(2019).</li>
<li>Kissoyan, K. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+C.+elegans+microbiota+protects+against+infection+via+production+of+a+cyclic+lipopeptide+of+the+viscosin+group%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Natural C. elegans microbiota protects against infection via production of a cyclic lipopeptide of the viscosin group.</a> Current Biology. 29 (6), 1030-1037 (2019).</li>
<li>Watson, E., MacNeil, L. T., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+metabolic+and+gene+regulatory+networks+modulates+the+C.+elegans+dietary+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of metabolic and gene regulatory networks modulates the C. elegans dietary response.</a> Cell. 153 (1), 253-266 (2013).</li>
<li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+systems+biology+uncovers+metabolites+affecting+C.+elegans+gene+expression+and+life+history+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interspecies systems biology uncovers metabolites affecting C. elegans gene expression and life history traits.</a> Cell. 156 (4), 759-770 (2014).</li>
<li>MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet-induced+developmental+acceleration+independent+of+TOR+and+insulin+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Diet-induced developmental acceleration independent of TOR and insulin in C. elegans.</a> Cell. 153 (1), 240-252 (2013).</li>
<li>O'Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. -H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neurotransmitter+produced+by+gut+bacteria+modulates+host+sensory+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour.</a> Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).</li>
<li>Snoek, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-parent+recombinant+inbred+line+population+of+C.+elegans+allows+identification+of+novel+QTLs+for+complex+life+history+traits%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-parent recombinant inbred line population of C. elegans allows identification of novel QTLs for complex life history traits.</a> BMC Biology. 17 (1), 24(2019).</li>
<li>Avery, L., Shtonda, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+transport+in+the+C.+elegans+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Food transport in the C. elegans pharynx.</a> Journal of Experimental Biology. 206 (14), 2441-2457 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+delicate+balance+between+bacterial+iron+and+reactive+oxygen+species+supports+optimal+C.+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A delicate balance between bacterial iron and reactive oxygen species supports optimal C. elegans development.</a> Cell Host & Microbe. 26 (3), 400-411 (2019).</li>
<li>Petersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+years+of+life+in+compost%3A+temporal+and+spatial+variation+of+North+German+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Ten years of life in compost: temporal and spatial variation of North German Caenorhabditis elegans populations.</a> Ecology and Evolution. 5 (16), 3250-3263 (2015).</li>
<li>Félix, M. -A., Duveau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+dynamics+and+habitat+sharing+of+natural+populations+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Population dynamics and habitat sharing of natural populations of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> BMC Biology. 10 (1), 59(2012).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+dynamics+and+linkage+disequilibrium+in+natural+Caenorhabditis+elegans+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Temporal dynamics and linkage disequilibrium in natural Caenorhabditis elegans populations.</a> Genetics. 176 (2), 999-1011 (2007).</li>
<li>Dolgin, E. S., Félix, M. -A., Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hakuna+Nematoda%3A+genetic+and+phenotypic+diversity+in+African+isolates+of+Caenorhabditis+elegans+and+C.+briggsae%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Hakuna Nematoda: genetic and phenotypic diversity in African isolates of Caenorhabditis elegans and C. briggsae.</a> Heredity. 100 (3), 304-315 (2008).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+animal+models+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (12), 764-775 (2019).</li>
<li>Barrière, A., Félix, M. -A. Isolation of C. elegans and related nematodes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarri%C3%A8re%2C+A+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C elegans research community 1-19 (2014).</li>
<li>Weisburg, W. G., Barns, S. M., Pelletier, D. A., Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((16S+ribosomal+DNA+amplification+for+phylogenetic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study.</a> Journal of Bacteriology. 173 (2), 697-703 (1991).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Crombie, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+adaptation+and+spatiotemporal+patterns+of+genetic+diversity+revealed+by+repeated+sampling+of+Caenorhabditis+elegans+across+the+Hawaiian+Islands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Local adaptation and spatiotemporal patterns of genetic diversity revealed by repeated sampling of Caenorhabditis elegans across the Hawaiian Islands.</a> Molecular Ecology. 31 (8), 2327-2347 (2022).</li>
<li>Haber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+history+of+Caenorhabditis+elegans+inferred+from+microsatellites%3A+Evidence+for+spatial+and+temporal+genetic+differentiation+and+the+occurrence+of+outbreeding%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary history of Caenorhabditis elegans inferred from microsatellites: Evidence for spatial and temporal genetic differentiation and the occurrence of outbreeding.</a> Molecular Biology and Evolution. 22 (1), 160-173 (2004).</li>
<li>Watson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+rewiring+of+propionate+flux+compensates+vitamin+B12+deficiency+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Metabolic network rewiring of propionate flux compensates vitamin B12 deficiency in C. elegans.</a> eLife. 5, 17670(2016).</li>
</ol>

我们声明不存在利益冲突。

线虫 Caenorhabditis elegans 是生物学研究中最常被研究的模式生物之一。它由 Sydney Brenner 在 20 世纪 60 年代引入，最初用于研究神经系统发育及其功能29。自那时起，C. elegans 已成为研究所有生物学领域基本过程的强大模型，包括行为生物学、神经生物学、衰老、进化生物学、细胞生物学、发育生物学和免疫学。其成功源于一系列独特的优势特性，包括约 3 天的短世代时间、易于培养、通体透明（便于高效表型分析）、可耐受冷冻、高效的灭菌和发育同步化方法，以及通过诱变、CRISPR-Cas 或 RNAi 进行遗传操作的有效手段。如今，全球约有 1,500 个实验室正在研究 C. elegans。当 Sydney Brenner 最初在实验室中建立 C. elegans 作为模式系统时，他以革兰氏阴性菌 Escherichia coli OP50 作为食物来源来培养这种以细菌为食的线虫。自此以后，全世界的实验室一直采用单一细菌培养方式，以 E. coli...

在自然界中，C. elegans 通常存在于腐烂的植物物质中，尤其是苹果等腐烂果实或堆肥堆上1。它也与某些无脊椎动物宿主相关，例如蛞蝓和鼠妇2,3。这些生境富含微生物，不仅可作为线虫的食物，还可能与其形成稳定的共生关系。关于天然相关微生物多样性的信息直到2016年才首次发表4,5,6。自那时以来，这些研究以及少数后续研究揭示，C. elegans 与多种细菌和真菌相关，最常见的包括假单胞菌属（Pseudomonas）、肠杆菌属（Enterobacter）、慢生根瘤菌属（Ochrobactrum）、欧文氏菌属（Erwinia）、丛毛单胞菌属（Comamonas）、葡糖杆菌属（Gluconobacter）以及其他多种细菌6,7,8。部分相关细菌能够稳定定植于线虫肠道，但并非全部均可如此6,9,10,11,12。这些细菌可能对理解 C. elegans 的生物学具有关键意义，因为它们可提供营养、抵御病原体及其他潜在胁迫因素，并影响繁殖速率、发育过程和行为反应等核心生活史性状。
例如，假单胞菌属（Pseudomonas）、慢生根瘤菌属（Ochrobactrum），以及肠杆菌属（Enterobacter）或葡糖杆菌属（Gluconobacter）的天然共生菌株，可通过不同的机制保护线虫免受病原体感染并避免其被杀死5,6,11,13,14。伯克氏菌科（Comamonadaceae）中某一特定的Comamonas属菌株可影响线虫的饮食反应、发育、寿命及繁殖力15,16,17。普罗威登斯菌（Providencia）可产生神经调节物质酪胺，从而调节宿主神经系统活性及其相应的行为反应18。一组不同的天然共生细菌被证实可影响种群增长率、繁殖力及行为反应5,6,9,11,19。
迄今为止，秀丽隐杆线虫（C. elegans）在不同生境和地理区域中其天然微生物组的确切多样性和稳定性尚未完全阐明，线虫与其环境微生物之间的更多关联仍有待揭示。以往多项研究使用了从某些土壤环境、天然 C. elegans 栖息地或中型生态系统实验（即在实验室中模拟自然生境的环境）中分离的细菌菌株，并结合 C. elegans 实验室品系进行研究4,5,20。尽管这些研究揭示了微生物对特定线虫性状（例如线虫代谢21）的影响，但这些相互作用在自然条件下对 C. elegans 生物学的意义尚不明确。因此，本文描述了直接从自然界中分离 C. elegans 个体，并从单条或群体线虫中分离及后续表征其天然相关微生物的方法。所述方法是对先前用于分离和表征天然 C. elegans 及其原生微生物组的流程2,6,7 的更新与优化版本。鉴于 C. elegans 广泛存在于全球范围内的腐烂植物材料中（尤其常见于腐烂果实、温带地区以及秋季）1,2,22,23,24,25，本实验方案可被任何实验室采用，适用于希望将 C. elegans 性状与其天然相关微生物相联系、从而构建更具自然相关性研究背景的研究场景。后者对于全面理解线虫生物学至关重要，因为已有大量其他宿主系统的研究表明，相关微生物组可影响宿主多种生活史特征26，而这一方面在当前几乎涵盖所有生命科学领域的 C. elegans 研究中仍普遍被忽视。

<table><tbody><tr><td>COMSOL</td><td>COMSOL</td><td></td><td>多物理场仿真软件</td></tr></tbody></table>

模式线虫天然微生物群的分离与表征 秀丽隐杆线虫

Isolation and Characterization of the Natural Microbiota of the Model Nematode Caenorhabditis elegans

线虫 Caenorhabditis elegans 在自然界中与多种多样的微生物相互作用。通常情况下，C. elegans 常见于腐烂的植物物质中，尤其是腐烂的果实（如苹果）或堆肥堆中。它也与某些无脊椎动物宿主相关，例如蛞蝓和潮虫。这些生境富含微生物，既可作为 C. elegans 的食物，也可在其肠道内持续定植。迄今为止，不同生境和地理区域中 C. elegans 天然微生物群的精确多样性及其组成稳定性尚未完全明确。本文介绍了一种从自然环境中分离 C. elegans 并对其微生物群进行表征的适宜方法。线虫可轻松从堆肥材料、腐烂苹果、蛞蝓中分离获得，或通过在堆肥堆上放置苹果来诱集。在北半球，发现 C. elegans 的最佳时间为每年9月至11月。将采集的基质材料浸入缓冲液中，即可将线虫从基质中冲洗出来，随后收集线虫并将其转移至线虫生长培养基或PCR缓冲液中以进行后续分析。我们进一步说明了如何利用这些样品分离和纯化与线虫相关的微生物，并对线虫进行处理以开展微生物群落组成的16S核糖体RNA分析。总体而言，所述方法可促进针对不同生境和地理区域中 C. elegans 微生物群特征的新研究，从而有助于全面理解该线虫微生物群的多样性和稳定性，为未来的功能研究奠定基础。

线虫 C. elegans 常见于腐烂的果实（如苹果）以及堆肥样品中。在德国北部，C. elegans 及其近缘物种（尤其是 C. remanei，也包括 C. briggsae）主要在9月至11月间被发现2。这些线虫最常存在于腐烂的植物材料中，特别是腐烂的果实（如苹果或梨），以及堆肥中，尤其偏好高度分解的物质。可将果实和堆肥样品带回实验室（图3A、B），分装至培养皿中（图3C、D），随后浸入液体或粘稠介质中，迫使线虫离开基质并游至介质表面（图3E、F）。之后可收集线虫，转移至琼脂平板或微量离心管中，并通过诊断性PCR确定其物种身份2,6...

Caenorhabditis elegans 是生物学中的主要模式物种之一，然而几乎所有研究都是在缺乏其天然共生微生物的情况下进行的。本文所述方法将有助于增进我们对这些共生微生物多样性的理解，为未来开展功能性的 C. elegans 研究奠定基础。

线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）在自然界中与多种多样的微生物相互作用。通常情况下，C. elegans 常见于腐烂的植物材料中……

该方案有助于深入了解秀丽隐杆线虫（C.elegans）的天然微生物群。同时，所分离的微生物可用于受控的实验室实验，以表征微生物群-宿主相互作用及秀丽隐杆线虫的生物学特性。本方案重点在于分离自然界中与秀丽隐杆线虫相关的微生物，这些微生物因此对于在更自然的背景下理解这一重要模式生物的生物学具有关键意义。熟悉秀丽隐杆线虫与其他线虫在形态上的区别将有助于实验操作。在解剖显微镜下进行移液操作起初可能具有挑战性，但通过练习会逐渐熟练。开始时，应将堆肥或腐烂水果等环境样品分别收集到塑料袋、试管或其他洁净容器中。将采集的环境样品均匀铺展在无菌的9厘米空培养皿中，并加入约20毫升无菌黏性培养基，使培养基完全覆盖样品。在解剖显微镜下，参照分离秀丽隐杆线虫及相关线虫的指南，寻找隐杆线虫属（Caenorhabditis）线虫。使用20至100微升移液器，从培养皿中吸取含有隐杆线虫的最小量液体，转移至含有1至3毫升无菌M9T培养基的3厘米培养皿中。为建立线虫种群，可将单个线虫转移至含有线虫生长培养基（NGM）的培养皿中。为清洗线虫并去除其体外附着的微生物，需将其在M9T溶液中孵育10至15分钟。用移液器吸取尽可能少量的含有线虫的液体，转移至新的无菌3厘米培养皿中，其中含有1至3毫升新鲜M9T溶液。为了无偏倚地鉴定与线虫相关的微生物，准备一个96孔板，每孔中加入约三个直径为一毫米的无菌小珠，并向每孔加入19.5微升PCR缓冲液与0.5微升蛋白酶K的混合液。将单个经过洗涤的线虫转移至各孔中，尽量减少携带的液体量。使用珠磨匀浆器在30赫兹条件下震荡破碎线虫3分钟，随后将板或管在室温下以8,000 G离心10秒，使液体沉降至孔底。为了鉴定秀丽隐杆线虫（C.elegans），将样品在PCR仪中于50摄氏度加热1小时，再于95摄氏度加热15分钟，以分离单个线虫的DNA；或者使用商业试剂盒提取线虫群体的DNA。将提取的DNA在-20摄氏度下冷冻保存，以实现长期储存。使用该DNA以及引物对NLP 30 forward和NLP 30 reverse进行扩增，获得一段154个碱基对的PCR产物。为分离细菌，准备一个96孔板，每孔中加入约三个无菌的1毫米珠子和20微升M9缓冲液，并用移液器将单个洗涤后的线虫尽可能少地带入液体转移至各孔。使用珠子均质仪按照之前演示的方法裂解线虫，随后短暂离心板子使液体沉降至底部。完成后，收集悬浮液，并以1比10的比例进行连续梯度稀释。将稀释后的菌悬液最多100微升涂布于直径9厘米的琼脂平板上。随后在15至20摄氏度下培养24至48小时。为获得纯细菌培养物，使用无菌接种环或无菌牙签从培养后的平板上挑取单个菌落，并划线接种至新的琼脂平板上，新平板应含有与纯化过程中相同的琼脂培养基。确保仅使用平板的1/3区域。然后对可重复使用的接种环进行灭菌，或使用新的无菌接种环，从第一区划线处拖过，以在样品平板的另1/3区域进行第二区划线。重复操作，将接种环从第二区划线处拖过，进行第三区划线，以获得单菌落生长。在与分离时相同的培养条件下孵育平板，如有需要，重复纯化步骤。使用相同的温度和培养条件，在液体培养基中培养纯菌落。接着，从纯液体培养物中提取细菌DNA，用27F正向引物和1495R反向引物扩增16S核糖体RNA，并按照文中所述进行PCR，以对细菌进行表征。将采集的果实和堆肥样品置于培养皿中，并浸入液体或黏性培养基后，线虫会离开基质材料并游动至培养基表面。微生物以纯的单菌落形式被分离，该纯化步骤至关重要，因为某些与秀丽隐杆线虫（C.elegans）相关的细菌可形成生物膜或易于聚集，从而导致获得多种微生物的混合培养物。使用针对秀丽隐杆线虫的特异性引物（即 NLP 30 正向引物和 NLP 30 反向引物）进行 PCR 扩增，获得了长度为 154 个碱基对的产物。从单条线虫中分离得到的DNA进行PCR扩增后条带较弱，而从至少包含50条线虫的群体中提取的DNA则产量更高，条带更清晰。通过同时对实验室品系N2的DNA与分离获得的线虫DNA进行C.elegans特异性PCR扩增，以N2作为阳性对照，验证了PCR实验的成功。微生物无处不在，因此必须在无菌条件下操作，以确保所分离的微生物确实与自然界中的线虫相关联。分离得到的微生物可用于在受控的实验室实验中研究宿主与微生物群之间的相互作用，或研究微生物对宿主生物学的影响，例如对衰老、发育或免疫的影响。目前，秀丽隐杆线虫（C.elegans）研究领域正利用该技术分离的微生物，以增进对微生物群多样性在宿主适应性中的作用，或微生物在免疫中作用的理解。

isolation-characterization-natural-microbiota-model-nematode

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

模型线虫秀丽隐杆线虫天然微生物群的分离和表征

来源： Taylor, M. N., 等。 利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用 视频实验杂志 (2022)本视频展示了将无菌且年龄匹配的Caenorhabditis...

评估无菌 C. elegans 中的肠道细菌定植

来源：Petersen, C. et. al., 模式线虫Caenorhabditis elegans天然微生物群的分离与表征。J. Vis. Exp. (2022)本视频展示了与秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）相关的细菌物种的分离与培养方法。通过基于微珠的秀丽隐杆线虫（C.

秀丽隐杆线虫相关细菌的分离与培养

本文中，我们介绍线虫Caenorhabditis...

秀丽隐杆线虫——一种多功能的模式生物 体内 研究宿主-微生物相互作用的模型

野生的Caenorhabditis线虫与多种微生物相关，这些微生物通常位于肠道腔内或感染肠道。本方案详细介绍了一种利用dauer幼虫角质层的抗性来富集定植于肠道中不可培养微生物的方法。...

选择性清洗野生 Caenorhabditis 线虫以富集肠道微生物组细菌

本方案概述了一种从野外自然基质中高效提取活体线虫的方法。...

快速分离野生线虫的贝尔曼漏斗法

本方案可用于对自交型Caenorhabditis线虫进行大规模生态学调查。该方法的主要优势在于能够高效地整理和分析从自然界采集的线虫所关联的生态学与分子数据。...

一种可高度扩展的自交型 Caenorhabditis 线虫生态调查方法

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。...

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

肠道微生物，包括胞外细菌以及奥尔赛病毒和微孢子虫（真菌）等胞内病原体，常与野生Caenorhabditis线虫相关。本文介绍了一种用于检测和定量定植和/或感染C.

RNA荧光 原位 杂交（FISH）技术用于可视化微生物定植与感染 秀丽隐杆线虫 肠道

本方案描述了一种在低温麻痹和表面漂白 以去除外部细菌后，对单个细菌定植的Caenorhabditis...

利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用

堆肥微宇宙实验将自然界中存在的微生物多样性引入实验室，以促进对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

Caenorhabditis elegans 是研究驱动宿主-微生物组相互作用的分子决定因素的有力模型。我们提出了一种高通量分析流程，可在单个动物水平上同时表征肠道微生物组定植情况以及 C. elegans...

秀丽隐杆线虫肠道微生物组定量与分析的流式蠕虫检测技术应用

学习从环境样本中分离秀丽隐杆线虫天然微生物群的方法，利用PCR技术鉴定线虫相关微生物。该方案有助于在受控实验室环境中研究微生物群与宿主的相互作用及其对宿主生物学的影响。

模式线虫天然微生物群的分离与表征秀丽隐杆线虫

探索更多视频

模式线虫天然微生物群的分离与表征 秀丽隐杆线虫

探索更多视频

模式线虫天然微生物群的分离与表征秀丽隐杆线虫