模式线虫天然微生物群的分离与表征 秀丽隐杆线虫

该方案有助于深入了解秀丽隐杆线虫（C.elegans）的天然微生物群。同时，所分离的微生物可用于受控的实验室实验，以表征微生物群-宿主相互作用及秀丽隐杆线虫的生物学特性。本方案重点在于分离自然界中与秀丽隐杆线虫相关的微生物，这些微生物因此对于在更自然的背景下理解这一重要模式生物的生物学具有关键意义。

熟悉秀丽隐杆线虫与其他线虫在形态上的区别将有助于实验操作。在解剖显微镜下进行移液操作起初可能具有挑战性，但通过练习会逐渐熟练。开始时，应将堆肥或腐烂水果等环境样品分别收集到塑料袋、试管或其他洁净容器中。

将采集的环境样品均匀铺展在无菌的9厘米空培养皿中，并加入约20毫升无菌黏性培养基，使培养基完全覆盖样品。在解剖显微镜下，参照分离秀丽隐杆线虫及相关线虫的指南，寻找隐杆线虫属（Caenorhabditis）线虫。使用20至100微升移液器，从培养皿中吸取含有隐杆线虫的最小量液体，转移至含有1至3毫升无菌M9T培养基的3厘米培养皿中。

为建立线虫种群，可将单个线虫转移至含有线虫生长培养基（NGM）的培养皿中。为清洗线虫并去除其体外附着的微生物，需将其在M9T溶液中孵育10至15分钟。用移液器吸取尽可能少量的含有线虫的液体，转移至新的无菌3厘米培养皿中，其中含有1至3毫升新鲜M9T溶液。

为了无偏倚地鉴定与线虫相关的微生物，准备一个96孔板，每孔中加入约三个直径为一毫米的无菌小珠，并向每孔加入19.5微升PCR缓冲液与0.5微升蛋白酶K的混合液。将单个经过洗涤的线虫转移至各孔中，尽量减少携带的液体量。使用珠磨匀浆器在30赫兹条件下震荡破碎线虫3分钟，随后将板或管在室温下以8,000 G离心10秒，使液体沉降至孔底。

为了鉴定秀丽隐杆线虫（C.elegans），将样品在PCR仪中于50摄氏度加热1小时，再于95摄氏度加热15分钟，以分离单个线虫的DNA；或者使用商业试剂盒提取线虫群体的DNA。将提取的DNA在-20摄氏度下冷冻保存，以实现长期储存。使用该DNA以及引物对NLP 30 forward和NLP 30 reverse进行扩增，获得一段154个碱基对的PCR产物。

为分离细菌，准备一个96孔板，每孔中加入约三个无菌的1毫米珠子和20微升M9缓冲液，并用移液器将单个洗涤后的线虫尽可能少地带入液体转移至各孔。使用珠子均质仪按照之前演示的方法裂解线虫，随后短暂离心板子使液体沉降至底部。完成后，收集悬浮液，并以1比10的比例进行连续梯度稀释。

将稀释后的菌悬液最多100微升涂布于直径9厘米的琼脂平板上。随后在15至20摄氏度下培养24至48小时。为获得纯细菌培养物，使用无菌接种环或无菌牙签从培养后的平板上挑取单个菌落，并划线接种至新的琼脂平板上，新平板应含有与纯化过程中相同的琼脂培养基。

确保仅使用平板的1/3区域。然后对可重复使用的接种环进行灭菌，或使用新的无菌接种环，从第一区划线处拖过，以在样品平板的另1/3区域进行第二区划线。重复操作，将接种环从第二区划线处拖过，进行第三区划线，以获得单菌落生长。

在与分离时相同的培养条件下孵育平板，如有需要，重复纯化步骤。使用相同的温度和培养条件，在液体培养基中培养纯菌落。接着，从纯液体培养物中提取细菌DNA，用27F正向引物和1495R反向引物扩增16S核糖体RNA，并按照文中所述进行PCR，以对细菌进行表征。

将采集的果实和堆肥样品置于培养皿中，并浸入液体或黏性培养基后，线虫会离开基质材料并游动至培养基表面。微生物以纯的单菌落形式被分离，该纯化步骤至关重要，因为某些与秀丽隐杆线虫（C.elegans）相关的细菌可形成生物膜或易于聚集，从而导致获得多种微生物的混合培养物。使用针对秀丽隐杆线虫的特异性引物（即 NLP 30 正向引物和 NLP 30 反向引物）进行 PCR 扩增，获得了长度为 154 个碱基对的产物。

从单条线虫中分离得到的DNA进行PCR扩增后条带较弱，而从至少包含50条线虫的群体中提取的DNA则产量更高，条带更清晰。通过同时对实验室品系N2的DNA与分离获得的线虫DNA进行C.elegans特异性PCR扩增，以N2作为阳性对照，验证了PCR实验的成功。微生物无处不在，因此必须在无菌条件下操作，以确保所分离的微生物确实与自然界中的线虫相关联。

分离得到的微生物可用于在受控的实验室实验中研究宿主与微生物群之间的相互作用，或研究微生物对宿主生物学的影响，例如对衰老、发育或免疫的影响。目前，秀丽隐杆线虫（C.elegans）研究领域正利用该技术分离的微生物，以增进对微生物群多样性在宿主适应性中的作用，或微生物在免疫中作用的理解。