Name: 通过组织的X射线激发发光化学成像对植入物相关感染进行高空间分辨率化学成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 了解X射线激发发光化学成像技术，用于高空间分辨率监测植入物相关感染的生化变化。该方法可实时追踪植入物周围局部化学环境的动态变化，为感染管理提供新策略。

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作者感谢克莱姆森大学、COMSET 以及克莱姆森市生物制造中心（Clemson SC BioCRAFT）。XELCI 装置的建立最初由美国国家科学基金会（NSF）CAREER 项目 CHE 12255535 资助，后续由美国国立卫生研究院（NIH）国家关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）R01 AR070305-01 项目资助。

本实验遵循克莱姆森大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的动物使用规程。实验按照克莱姆森大学生物安全委员会（IBC）和辐射安全委员会（RSC）的要求进行，并遵守相关指南和法规。
注意：完成 XELCI 扫描的流程图如下图 图5 所示，随后是成像步骤的详细分步说明。
1. 启动系统并获取平片X线影像
<ol>
	<li>打开PMT制冷器，通常需要约15分钟达到设定温度（例如4 °C）。在打开PMT之前，完成其余初始化步骤。</li>
	<li>启动成像系统控制软件。该控制软件将与电动x-y-z轴载物台通信并进行初始化。将载物台的x轴和y轴移动至所需的起始位置。</li>
	<li>将样品放置在可移动的x-y-z载物台上。通过升高或降低X射线源和/或载物台，调节样品高度（z轴），使放射发光装置位于聚毛细管聚焦光学元件下方5-5.5 cm处。同时，借助激光十字指示器（两个呈线状红色激光点的激光指示器，安装在X射线聚焦毛细管上，彼此成90°交叉，交叉点即为X射线聚焦位置）在x-y平面内对准样品位置。在开启X射线和PMT前，关闭激光器。</li>
	<li>锁紧成像舱前门上的按钮式安全联锁装置。开启X射线源电源。移除聚焦光学元件以获取样品的普通X射线平片。</li>
	<li>打开X射线控制软件，设置X射线功率（通过调节电压和电流）。使用X射线控制软件打开X射线快门。</li>
	<li>打开X射线相机软件。点击曝光按钮以获取样品的普通X射线平片。关闭曝光并关闭X射线。 
	注意：如有需要，可移动样品以优化其位置，或在不同位置获取一系列X射线图像，以便拼接获得更大视野的X射线图像。也可在另一系统上获取X射线图像，但如果样品发生移动，XELCI与X射线成像之间的共定位将变得更加困难。</li>
	<li>打开成像舱门。</li>
</ol>
2. 可选：在关闭X射线的情况下进行背景扫描
<ol>
	<li>将多毛细管光学器件重新连接到X射线源。</li>
	<li>关闭防护罩并固定联锁装置。打开光电倍增管（PMT）电源。 
	注意：为避免因光照过度而损坏，每当打开或即将打开防护罩门时，必须关闭光电倍增管电源。</li>
	<li>启动成像系统控制软件，并设定步长、扫描速度和扫描区域。所有参数设置完成后，点击运行按钮开始扫描。 
	注意：高分辨率扫描的步长为1000 µm，低分辨率扫描的步长为250 µm。扫描速度可在5 mm/s至1 mm/s之间选择。扫描区域取决于样品的尺寸。</li>
	<li>在关闭X射线的情况下进行背景扫描，以检测除样品外防护罩内存在的任何光源所产生的暗计数。</li>
</ol>
3. 开启X射线进行样品扫描
<ol>
	<li>使用激光十字头确保样品仍处于正确位置，以开始扫描。</li>
	<li>关闭防护罩并锁紧联锁装置。如果光电倍增管（PMT）已关闭（例如，开门前已关闭），请打开PMT电源。</li>
	<li>打开成像系统控制软件。输入步长、扫描速度和扫描区域的数值。设置完所有参数后，点击 运行 按钮以开始扫描。 
	注意：&#160;高分辨率扫描的步长为1000 µm，低分辨率扫描的步长为250 µm。扫描速度可在5 mm/s至1 mm/s之间选择。扫描区域取决于样品的尺寸。</li>
	<li>在X射线开启的情况下获取样品的扫描图像。</li>
	<li>首先使用较大的步长和较高的扫描速度进行低分辨率扫描，以获得目标区域的初步图像。在获取到样品目标区域的低分辨率扫描图像后，再使用较小的步长和较低的扫描速度进行高分辨率扫描。</li>
	<li>在打开门之前，关闭PMT电源。</li>
</ol>
4. 形成图像
<ol>
	<li>确认当前扫描正在成像目标的兴趣区域。如果不是，请点击 停止 按钮终止当前扫描。</li>
	<li>再次在控制软件中调整扫描位置，然后再次点击 运行 按钮。 
	&#8203;注意：y 轴从扫描的第一行开始持续记录。在执行扫描过程中，会记录每个波长的计数以及距上次电机位置更新以来的时间。所记录的时间将反映电机速度的任何变化，从而影响曝光时间。对于每个像素，计数/秒会被归一化。y 轴电机移动至当前 y 轴行的末端后，返回起始位置。随后，x 轴电机按用户定义的步长增加其位置，并扫描 y 轴的第二行。此过程循环进行，直至 x 轴电机达到设定的 x 方向宽度。用户可控制扫描尺寸、电机速度和电机起始位置。步长将决定最终图像中 y 轴方向像素的大小。</li>
</ol>
5. 在无菌条件下培养用于成像的细菌（若对生长细菌的传感器进行成像）
<ol>
	<li>为制备新鲜的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus 1945，ATCC 25923）培养物，从一周内划线接种的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上挑取单个菌落，接种于5 mL无菌胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中。</li>
	<li>在37 °C下轻轻振荡培养细菌16–18小时，直至进入稳定期。</li>
	<li>随后，在室温（RT）下以4000 × g 离心10分钟，收集TSB中的菌体沉淀，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀两次，最后将沉淀重悬于5 mL无菌PBS中。</li>
	<li>使用600 nm处的光密度（OD）定量细菌浓度，应在线性范围内进行测定，即符合比尔-朗伯定律的OD范围（OD = kN；其中k为与分子消光系数和光程长度相关的系数，N为细菌浓度）16。然后用无菌PBS将样品稀释至105 个细胞/mL。</li>
	<li>将胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）通过高压灭菌法灭菌，随后混合冷却至温度降至45 °C，再将细菌接种至TSA中。</li>
	<li>将稀释后的细菌培养物（100 µL）滴加到植入式传感器表面。 
	注：植入物经70%乙醇浸泡5分钟灭菌，并保存于无菌PBS中。</li>
	<li>将100 µL未接种细菌的TSA滴加至另一枚无菌植入物上作为对照。</li>
	<li>在植入前，向植入式传感器表面再添加100 µL未接种细菌的TSA，随后于37 °C孵育48小时。</li>
</ol>

<ol><li>Arciola, C. R., Alvi, F. I., An, Y. H., Campoccia, D., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+infection+and+infection+resistant+materials%3A+A+mini+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Artificial+Organs%22%5BJournal%5D)">Implant infection and infection resistant materials: A mini review.</a> International Journal of Artificial Organs. 28 (11), 1119-1125 (2005).</li>
<li>Renick, P., Tang, L. Device-related infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRenick%2C+P+%22Racing+for+the+Surface%22">Racing for the Surface</a>. Li, B., Moriarty, T. F., Webster, T., Xing, M. , Springer International Publishing. Cham. 171-188 (2020).</li>
<li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+heterogeneity+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (3), 199-210 (2008).</li>
<li>Metsemakers, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture-related+infection%3A+A+consensus+on+definition+from+an+international+expert+group%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Fracture-related infection: A consensus on definition from an international expert group.</a> Injury. 49 (3), 505-510 (2018).</li>
<li>Arciola, C. R., Campoccia, D., Montanaro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implant+infections%3A+Adhesion%2C+biofilm+formation+and+immune+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Implant infections: Adhesion, biofilm formation and immune evasion.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (7), 397-409 (2018).</li>
<li>Polvoy, I., Flavell, R. R., Rosenberg, O. S., Ohliger, M. A., Wilson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+Imaging+of+Bacterial+Infection%3A+The+State+of+the+Art+and+Future+Directions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nuclear Imaging of Bacterial Infection: The State of the Art and Future Directions.</a> Journal of Nuclear Medicine. 61 (12), 1708-1716 (2020).</li>
<li>vander Bruggen, W., Bleeker-Rovers, C. P., Boerman, O. C., Gotthardt, M., Oyen, W. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+and+SPECT+in+Osteomyelitis+and+Prosthetic+Bone+and+Joint+Infections%3A+A+Systematic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">PET and SPECT in Osteomyelitis and Prosthetic Bone and Joint Infections: A Systematic Review.</a> Seminars in Nuclear Medicine. 40 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Trampuz, A., Zimmerli, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+Treatment+of+infections+associated+with+fracture-fixation+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Injury%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and Treatment of infections associated with fracture-fixation devices.</a> Injury. 37 (2), 59-66 (2006).</li>
<li>Ady, J., Fong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+for+infection%3A+From+visualization+of+inflammation+to+visualization+of+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Infections%22%5BJournal%5D)">Imaging for infection: From visualization of inflammation to visualization of microbes.</a> Surgical Infections. 15 (6), 700-707 (2014).</li>
<li>Truong-Bolduc, Q. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+NorB+Efflux+pump+in+the+adaptation+of+Staphylococcus+Aureus+to+growth+at+acid+pH+and+in+resistance+to+Moxifloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Implication of the NorB Efflux pump in the adaptation of Staphylococcus Aureus to growth at acid pH and in resistance to Moxifloxacin.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (7), 3214-3219 (2011).</li>
<li>Hengge-Aronis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+regulatory+mechanisms+involved+in+control+of+the+%CF%83S+%28RpoS%29+subunit+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the σS (RpoS) subunit of RNA polymerase.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 66 (3), 373-395 (2002).</li>
<li>Gao, R., Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phosphors+for+x-ray+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Molecular phosphors for x-ray detection.</a> Science Bulletin. 67 (10), 1015-1017 (2022).</li>
<li>Gao, R., Fang, X., Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+stimuli-responsive+luminescent+films%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+C%22%5BJournal%5D)">Recent developments in stimuli-responsive luminescent films.</a> Journal of Materials Chemistry C. 7 (12), 3399-3412 (2019).</li>
<li>Uzair, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformal+coating+of+orthopedic+plates+with+x-ray+scintillators+and+ph+indicators+for+x-ray+excited+luminescence+chemical+imaging+through+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Conformal coating of orthopedic plates with x-ray scintillators and ph indicators for x-ray excited luminescence chemical imaging through tissue.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (47), 52343-52353 (2020).</li>
<li>Uzair, U., Benza, D., Behrend, C. J., Anker, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasively+imaging+pH+at+the+surface+of+implanted+orthopedic+devices+with+x-ray+excited+luminescence+chemical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Noninvasively imaging pH at the surface of implanted orthopedic devices with x-ray excited luminescence chemical imaging.</a> ACS Sensors. 4 (9), 2367-2374 (2019).</li>
<li>Begot, C., Desnier, I., Daudin, J. D., Labadie, J. C., Lebert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+calculating+growth+parameters+by+optical+density+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Recommendations for calculating growth parameters by optical density measurements.</a> Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 225-232 (1996).</li>
<li>Giering, K., Minet, O., Lamprecht, I., Müller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+thermal+properties+of+biological+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+SPIE+-+The+International+Society+for+Optical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Review of thermal properties of biological tissues.</a> Proceedings of SPIE - The International Society for Optical Engineering. , 45-65 (1995).</li>
<li>Hunter, R. C., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+pH-sensitive+fluoroprobe+%28C-SNARF-4%29+for+pH+microenvironment+analysis+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Application of a pH-sensitive fluoroprobe (C-SNARF-4) for pH microenvironment analysis in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71 (5), 2501-2510 (2005).</li>
<li>Pogue, B. W., Leblond, F., Krishnaswamy, V., Paulsen, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiologic+and+Near-Infrared%2FOptical+Spectroscopic+Imaging%3A+Where+Is+the+Synergy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">Radiologic and Near-Infrared/Optical Spectroscopic Imaging: Where Is the Synergy.</a> American Journal of Roentgenology. 195 (2), 321-332 (2010).</li>
<li>Ryan, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+X-ray-excited+emissions+from+quantum+dots+and+biological+tissue+in+whole+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Imaging of X-ray-excited emissions from quantum dots and biological tissue in whole mouse.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19223(2019).</li>
<li>Yang, Y., Wang, K. -Z., Yan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultralong+persistent+room+temperature+phosphorescence+of+metal+coordination+polymers+exhibiting+reversible+pH-responsive+emission%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ultralong persistent room temperature phosphorescence of metal coordination polymers exhibiting reversible pH-responsive emission.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (24), 15489-15496 (2016).</li>
<li>Chen, H., Rogalski, M. M., Anker, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+functional+X-ray+imaging+techniques+and+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in functional X-ray imaging techniques and contrast agents.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 14 (39), 13469(2012).</li>
<li>Allan, V. J. M., Macaskie, L. E., Callow, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pH+gradient+within+a+biofilm+is+dependent+upon+the+limiting+nutrient%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+letters%22%5BJournal%5D)">Development of a pH gradient within a biofilm is dependent upon the limiting nutrient.</a> Biotechnology letters. 21 (5), 407-413 (1999).</li>
<li>Wang, Z., Deng, H., Chen, L., Xiao, Y., Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurements+of+dissolved+oxygen%2C+pH+and+redox+potential+of+biocathode+microenvironments+using+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes.</a> Bioresource Technology. 132, 387-390 (2013).</li>
<li>Xiao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+probing+the+effect+of+potentials+on+the+microenvironment+of+heterotrophic+denitrification+biofilm+with+microelectrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">In situ probing the effect of potentials on the microenvironment of heterotrophic denitrification biofilm with microelectrodes.</a> Chemosphere. 93 (7), 1295-1130 (2013).</li>
<li>Nakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+strategy+to+design+latent+ratiometric+fluorescent+pH+probes+Based+on+self-assembled+SNARF+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Adv%22%5BJournal%5D)">A novel strategy to design latent ratiometric fluorescent pH probes Based on self-assembled SNARF derivatives.</a> RSC Adv. 2014 (4), 348-357 (2014).</li>
<li>Villano, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+multislice+sequence+for+3D+MRI-CEST+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">A fast multislice sequence for 3D MRI-CEST pH.</a> Magnetic Resonance in Medicine. 85 (3), 1335-1349 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

为了能够早期检测和研究与骨科植入物相关的感染，以避免骨髓炎及二次手术带来的并发症，我们引入了XELCI作为一种新型的功能性成像技术。该技术在通过组织进行pH监测方面，可与目前可用的技术相媲美。
在放置样品进行成像时，我们使用一个连接到聚毛细管聚焦光学系统的激光十字头，该系统带有两个以90°角相交的线状激光指示器，用于精确定位肘部正下方的位置。在开始扫描之前，应关闭这些激光，以避免除闪烁体产生的光之外的任何杂散光到达探测器。在距离方面，用户应在启动实验前测量聚焦光学系统尖端到样品顶部的距离，约为5–5.5 cm。此距离可通过手动升高X射线源或上下移动样品台来调节。对于活体动物或通过组织进行测量的情况，操作流程相同，但需将动物置于麻醉状态，并连接异氟烷气体管路以维持其持续睡眠。我们会定期监测其体温和脉搏，并添加额外的垫料和胶带以正确固定动物的解剖位置，尤其是角度；此时，我们将5–5.5 cm的焦距位置估算为植入物的深度，而非仅以皮肤表面顶部的距离为准。通常会先采集一张普通X射线图像或粗略扫描图像，以确认正确位置，之后再与在同一位置获取的化学XELCI图像进行叠加。对于未被组织覆盖的传感...

在美国，每年约有200万例骨折固定装置被植入，其中5%至10%会导致与植入物相关的感染1。由于生物膜具有异质性和耐药性，这些感染在后期阶段更难通过抗生素治疗2,3。如果能早期诊断，可通过抗生素治疗和手术清创来控制感染，从而避免因在治疗部位更换硬件而产生的额外医疗费用和二次手术。常规X线摄影及其他先进的影像学技术常用于诊断骨科植入物相关感染、骨不连及相关并发症。尽管这些技术常用于获取骨科植入物周围骨组织和软组织的结构信息，但无法提供特定微环境中的生化信息。因此，我们开发了一种新型的X射线激发发光化学成像（XELCI）技术，可对植入部位的生化信息进行高分辨率、无创的成像。骨科植入物相关感染的诊断通常通过一种或多种方法联合进行。临床观察（如疼痛、肿胀、发红、伤口渗液等）提示感染的最初迹象。随后通过影像学和实验室检查，确认骨愈合进程受阻并鉴定致病微生物4,5。核医学技术，如计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI），以及放射性核素方法，如单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和正电子发射断层扫描（PET），已被用于更清晰地显示感染的植入物及其相关感染灶6,7。CT在判断骨坏死方面具有优势，MRI则在检测软组织异常方面表现优异，但两者在靠近金属植入物时均会产生干扰8。不同的X射线方法，如SPECT和PET，结合放射性同位素标记的分析物作为体内成像对比剂，已广泛用于诊断与植入物相关的骨髓炎2。目前的应用常将CT扫描的解剖数据与SPECT或PET的标记数据相结合，以生成更完整的解剖信息9。尽管上述一种或多种成像方式被用于辅助感染诊断，但它们均无法在感染早期检测到与感染相关的pH变化，从而难以及时启动抗生素治疗，以避免额外的医疗和手术支出。
本研究中所使用的成像系统在监测植入物相关感染方面的主要优势在于，其能够通过光谱参考揭示生物膜微环境的生化信息。尽管研究重点在于对感染部位的pH值进行成像与图谱绘制，但该方法亦可调整用于监测其他与植入物相关感染特异性的生物标志物。因此，XELCI技术有助于理解感染的病理生理过程。高空间分辨率成像使得在感染发展过程中对异质性进行图谱化成为可能。生物膜形成表面处的pH值对于理解生化变化至关重要。此外，由于细菌对抗生素产生的应激反应，微环境中的其他变化也可能发生10,11。得益于表面特异性与高空间分辨率成像，可实时监测抗生素对生物膜微环境的影响。该技术还可用于靶向药物递送实验中的生物膜环境研究。我们可研究在低pH条件下靶向释药，或通过提高pH值使细菌对药物更敏感，从而增强其在较高pH环境下的药效。
该成像技术具有三个特定特征：X射线分辨率、植入物表面特异性和化学敏感性（图1A）。这些特征可与当前用于成像骨科植入物相关感染的其他成像技术进行比较（图1B）。当植入物表面涂覆的磷光颗粒受到X射线照射时，会发出红光和近红外（NIR）光，这些光能够穿透数厘米厚的组织（尽管存在一定程度的衰减）12,13。表1展示了所开发成像系统与其他用于测量生物膜或组织内pH值方法的部分特性对比。
XELCI 是一种新型成像技术，通过结合X射线激发，以光学方式在植入式医疗设备附近获取高空间分辨率的化学信息，如图2所示。该技术利用了X射线可激发的磷光颗粒的选择性激发与光学检测。植入物表面涂覆有两层结构：底层为闪烁体颗粒层，上层为掺入pH敏感染料的聚合物层。当一系列聚焦的X射线束照射植入物时，闪烁体层产生可见光（620 nm 和 700 nm）。所产生的光穿过pH敏感层，其发光光谱会根据周围环境的pH值发生调制。低pH通常与感染和生物膜形成相关；随着感染进展，pH值从生理pH（pH 7.2）逐渐变为酸性（低于pH 7），传感器中的pH染料随之变色，从而改变其吸光度。在图2E中展示了溴甲酚绿pH染料在pH 7和pH 4条件下发光光谱的变化。穿过组织和骨骼的透射光被收集，通过光谱比值确定pH值。为了生成pH图像，聚焦X射线束依次照射闪烁体薄膜上的各个点，并逐点扫描整个样品。此前，该技术已用于成像骨科植入物表面的pH变化14,15，并已测试用于通过骨骼和组织监测髓腔内的pH变化。
图3 以下展示了成像系统的示意图。该成像系统的基本组件包括带有多毛细管光学器件的X射线激发源、连接至两个光电倍增管的一体式丙烯酸光导、可移动的x、y和z三维电动平台（行程范围为30 cm × 15 cm × 6 cm），以及用于数据采集的计算机。X射线源、x、y、z三维平台和收集光学元件（弯头、光导、光电倍增管（PMT））均置于防X射线屏蔽腔内，而X射线控制器、PMT电源、连接至数据采集（DAQ）板的函数发生器以及计算机则放置在屏蔽腔外。在屏蔽腔与门的前部之间安装有一个常开型按钮开关，作为联锁装置。若门未完全关闭（联锁开关处于断开状态），X射线源将无法启动；若在运行过程中门被打开，X射线源将自动关闭。电机既可执行连续扫描，也可移动至任意指定位置。y轴的扫描速度通常为1–5 mm/s，x轴的步长通常可选择150–2000 µm。参数的选择取决于所需的空间分辨率。在连续扫描过程中，通过保持恒定速度来确保各点曝光时间一致。
当聚焦的X射线束照射到X射线发光颗粒上时，所产生的光将穿过pH敏感膜，并根据周围环境的pH值对光进行调制。透射光在穿过组织时会发生相互作用（部分散射和吸收），且随着组织厚度的增加，光因散射和吸收导致的衰减也会增强。收集光学系统包含一根一体式分叉丙烯酸光导管，其起始端装有一个带反射功能的铝制弯头（具有&#160;90°弯曲结构，内表面经过抛光处理以实现反射）。该设计旨在确保光一旦进入光导管即可实现准直。这些改进显著提高了光的收集效率。更多细节请参见图4，其中展示了该弯头和光导管的机械设计图。90°弯头由铝材加工而成，其内表面被抛光至镜面光洁度，而光导管则由丙烯酸材料加工制成。我们还在弯头的起始端安装了一块宽范围长通蓝色滤光片（阻断350–450 nm波段的光），以确保仅有红光能够通过。一体式丙烯酸光导管末端分为两路，分别导入两个不同的光电倍增管（PMT）。PMT被封装在一个小型密闭金属盒中，并与热电冷却器接触，以将PMT冷却至约5 °C。在其中一个PMT的前端安装了一块窄范围长通滤光片（阻断570–640 nm波段的光，允许640–740 nm波段的光通过），用于仅检测700 nm波长的光。因此，620 nm和700 nm波长的光可被分别测量计算。PMT工作于光子计数模式，对每个探测到的光子产生晶体管-晶体管逻辑（TTL）脉冲。数据采集系统（DAQ）通过USB通信对脉冲进行计数（饱和点为每秒2000万个脉冲）。数据处理后生成两幅独立的强度图，最终图像通过计算信号波长强度（620 nm）与参考波长强度（700 nm）的比值得到。该比值可校正总光收集效率的差异，这些差异强烈依赖于收集光学元件的位置、X射线照射强度以及组织厚度。此外，一个空间上分离且不含任何pH指示染料的参考区域可用于校正因组织对不同波长光穿透能力差异所引起的光谱失真。整个成像系统的控制采用图形化编程语言实现，基本操作流程图如下所示。除计算机、X射线控制器和DAQ单元外，整个成像装置被封装在一个安全的X射线屏蔽 enclosure 中，以最大限度减少辐射暴露。

<table><tbody><tr><td>90度弯头</td><td>由加利福尼亚州尔湾市帕克51号Hilltop技术实验室生产</td><td></td><td></td></tr><tr><td>溴甲酚绿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45ZW10</td><td></td></tr><tr><td>溴百里酚蓝</td><td>Sigma</td><td>76-59-5</td><td></td></tr><tr><td>ElectraCOOL高级热电制冷板</td><td>美国佛蒙特州怀特河Pollock industries公司</td><td>TCP 50</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>美国新罕布什尔州哈德逊市萨加莫尔公园路9号Beantown Chemical公司&lt;br/&gt; 邮编03051</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>掺铕氧化钆硫化物（Gd2O2S:Eu）颗粒-~8.0 &amp;micro;m</td><td>英国Stevenage市Phosphor Technologies公司</td><td>UKL63/N-R1</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>美国德克萨斯州奥斯汀市National Instruments公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电动线性垂直平台（Z轴用）</td><td>美国纽约州Smithtown市Motion Control公司</td><td>AT10-60</td><td></td></tr><tr><td>National Instruments c-DAQ 9171</td><td>美国德克萨斯州奥斯汀市National Instruments公司</td><td>NI cDAQ&amp;trade;-9171</td><td></td></tr><tr><td>一体式丙烯酸导光板</td><td>由加利福尼亚州尔湾市帕克51号Hilltop技术实验室生产</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 4缓冲液</td><td>VWR BDH Chemicals公司</td><td>BDH5024</td><td></td></tr><tr><td>pH 8缓冲液</td><td>VWR BDH Chemicals公司</td><td>BDH5060</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>美国加利福尼亚州尔湾市MP Biomedicals公司</td><td>2810305</td><td></td></tr><tr><td>光电倍增管型号P25PC-16</td><td>英国萨里郡SensTech公司</td><td>型号P25PC-16</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus &lt;/em&gt;亚种 &lt;em&gt;aureus Rosenbach&lt;/em&gt;</td><td>美国弗吉尼亚州马纳萨斯市美国模式培养物集存库（ATCC）</td><td>ATCC 25923</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>美国加利福尼亚州霍利斯特市Teknova公司</td><td>&amp;nbsp;T0520</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>美国马萨诸塞州伯灵顿市EMD Millipore公司</td><td>1005255000</td><td></td></tr><tr><td>X射线源-iMOXS</td><td>德国柏林科学仪器研究所（Institute for Scientific Instruments GmbH）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X、Y轴电动平台-行程30 cm × 15 cm × 6 cm</td><td>美国新泽西州纽顿市Thorlabs公司</td><td>LTS300和LTS150</td><td></td></tr></tbody></table>

通过组织的x射线激发发光化学成像实现植入物相关感染的高空间分辨率化学成像

High Spatial Resolution Chemical Imaging of Implant-Associated Infections with X-ray Excited Luminescence Chemical Imaging Through Tissue

与可植入医疗器械相关的微生物感染是导致骨折固定失败的主要问题。早期诊断此类感染可成功使用抗生素根除病原体，而无需承担二次手术的额外费用。本文中，我们描述了一种名为XELCI的技术，该技术具有高X射线分辨率、对植入物的特异性以及对化学物质浓度的高灵敏度，可用于无创成像靠近植入医疗器械表面的化学浓度变化。该技术通过在医疗器械表面涂覆具有化学报告功能的感应层实现。这种化学响应性表面由两层组成：底层为红色发光闪烁体层（Gd2O2S: Eu），上层为pH敏感层（含溴百里酚蓝或溴甲酚绿的水凝胶），用于监测。聚焦的X射线束照射植入物上的某一点，闪烁体产生的红光（峰值为620 nm和700 nm）穿过上层感应层，其光谱比会随pH值变化而改变。通过逐点扫描X射线束并测量穿过组织的光的光谱比，即可生成图像。此前，我们已利用该成像技术结合改良的可植入板式传感器，在股骨骨表面监测与植入物相关的感染。目前，我们正在研究胫骨髓内钉感染所引起的pH变化。在前期兔模型研究中采用了两种不同设计的髓内钉，结果表明XELCI技术不仅可用于监测骨表面的化学变化，还可用于监测骨内部的化学变化。因此，该技术实现了无创、高空间分辨率、低背景干扰的局部pH成像，为研究与植入物相关感染的生化过程提供了有力工具。

作为一项初步研究，我们在兔尸体胫骨扩髓后的髓内钉传感器上进行了成像14。该传感器具有三个不同的区域：参考区域、pH 8 区域（碱性 pH）和 pH 4 区域（酸性 pH）。参考区域为掺杂了闪烁体（Gd2O2S:Eu）颗粒的粗糙化环氧树脂膜。独特的酸性和碱性 pH 区域分别代表髓腔内感染和非感染状态（图 6A、B）14。
扫描完成后，在 MATLAB 中分别生成了 620 nm、700 nm 处的图像以及比值图像（图 7A-C）。颜色的变化反映了 pH 值的变化。由于溴百里酚蓝在碱性 pH 区域对发射光的吸收显著强于酸性 pH 区域，因此较低的 pH 区域在 620 nm 处呈现更亮的信号。700 nm 处的闪烁体发射作为光谱参...

本文介绍了一种利用X射线激发发光化学成像（XELCI）技术对植入性医疗器械周围化学信息进行高分辨率光学检测的实验方案。该新型成像技术由本实验室研发，可用于研究与植入物相关的感染生物化学过程。

通过组织的X射线激发发光化学成像实现植入物相关感染的高空间分辨率化学成像

与植入式医疗器械相关的微生物感染是导致骨折固定失败的主要问题。此类感染的早期诊断将……

该技术将使我们能够透过骨骼和组织对植入物相关感染的生化变化进行成像和定位。我们可以获得植入物表面附近化学浓度变化的高分辨率图像。这将使我们能够监测植入物相关感染局部的化学环境。由生物科学系的研究生 Erin Levon 演示细菌培养步骤。首先，打开 PMT 冷却器，并在打开 PMT 之前完成其余初始化步骤。然后启动成像系统控制软件，并将载物台的 x 轴和 y 轴移动至所需的起始位置。将样品置于可移动的xyz载物台上，通过调节X射线源和/或载物台的高度，使样品高度定位至放射致发光装置位于聚毛细管聚焦光学元件下方5至5.5厘米处。同时，在激光十字准线的辅助下，将样品在x-y平面内准确定位，并移除聚焦光学元件以获取样品的普通X射线图像。锁紧成像腔室前门上的按钮式安全联锁装置。然后打开X射线源的电源。接着，启动X射线控制软件。使用X射线控制软件设置X射线功率并打开X射线快门。然后打开X射线相机的软件，点击曝光按钮以拍摄普通X射线片。关闭曝光和X射线，然后打开防护罩门。再次将多毛细管光学器件连接到X射线源上。然后关闭成像室，固定联锁装置，并打开光电倍增管（PMT）电源。接着，启动成像系统控制软件，设定步进尺寸、扫描速度和扫描区域。所有参数设置完毕后，点击“运行”按钮开始扫描。关闭X射线，运行背景扫描，以确定样品以外 enclosure 中任何光源产生的暗计数。确保样品位于激光十字头的正确位置后，关闭 enclosure 并固定联锁装置。然后打开成像系统控制软件，输入步长、扫描速度和扫描区域的数值。所有参数设置完成后，点击“运行”按钮开始扫描，获取开启X射线后的样品扫描图像。首先，采用较大的步长和较高的扫描速度进行低分辨率扫描，以获得目标区域的初步图像。在获取样品目标区域的低分辨率扫描图像后，再通过较小的步长和较低的扫描速度进行高分辨率扫描。为制备金黄色葡萄球菌1945的新鲜培养物，取一株一周内划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单菌落，接种至3毫升无菌胰蛋白胨大豆肉汤中。随后，在37°C下轻轻振荡培养16至18小时，直至进入稳定期。接着，在室温下以4,000 ×g离心10分钟，将菌体从胰蛋白胨大豆肉汤中沉淀下来，并用PBS洗涤沉淀物两次。使用600纳米处的光密度（OD）在线性范围内定量细菌浓度，该线性范围即符合比尔-朗伯定律的光密度范围。然后用无菌PBS将样品稀释至每毫升200,000个细胞。通过高压灭菌法对胰蛋白胨大豆琼脂进行灭菌，随后混合冷却，直至温度降至45摄氏度。接下来，将细菌接种到胰蛋白胨大豆琼脂中。然后，用移液器将稀释后的细菌培养物滴加到植入式传感器表面，并将100 µL未接种的胰蛋白胨大豆琼脂滴加到另一片无菌植入物表面作为对照。在植入式传感器上再额外添加100 µL未接种的胰蛋白胨大豆琼脂，随后于37°C孵育48小时，之后再进行植入。扫描完成后，在 MatLab 中分别生成了 620 纳米、700 纳米及比值的图像，颜色的变化反映了 pH 值的变化。由于碱性 pH 区域对发射光的吸收显著强于酸性 pH 区域，因此较低的 pH 区域在 620 纳米处呈现更亮的信号。700 纳米处的闪烁体发射作为光谱参考，用于校正闪烁体薄膜的不一致性、组织成分变化以及每次扫描之间检测光学系统位置的任何变动。样品需正确放置在载物台上。在打开室内光源或打开 enclosure 之前，应关闭 PMT 电源，并在进行高分辨率成像前先执行低分辨率扫描。除了 X 射线源，我们还可以使用超声波源进行超声发光化学成像，以监测与植入式医疗设备相关的 pH 值变化。是的，在优化系统后，我们能够检测到骨髓腔内部与骨表面之间的pH值变化，这一结果可用于骨髓炎的研究。

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