用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

通过成分和功能化表面的简单混合，该协议重现了细胞的重要功能，由肌动蛋白组装驱动的运动。力产生的生化和生物物理机制可以通过改变成分混合物和功能化表面的性质来评估。该方案的主要优点是可以购买所有成分，因此不需要蛋白质纯化方面的专业知识。

这允许非专业人士将该系统用作其研究的工具。该协议提供了一个本科水平的教学模块，让学生亲身体验操作蛋白质并在显微镜下观察自制备的生物系统。它们可以控制和改变系统参数。

物理分析，如朗缪尔方程，可以在轨迹上运行。首先重悬冻干蛋白。通过在 4 摄氏度下脉冲离心蛋白粉来收集管底部的固体。

然后按照制造商的说明加水，并在冰上孵育至少 15 分钟。通过移液轻轻混合。在冰上再保持15分钟，然后再次混合。

通过离心收集管底部的溶液。重新混合，并在冰上等分试样。为了解聚在冻干和冷冻过程中形成的肌动蛋白低聚物，在加有额外 ATP、DTT 和 10% 标记肌动蛋白的 G 缓冲液中稀释等分试样 8 倍重悬肌动蛋白。

在测量蛋白质浓度之前，让它在冰上解聚，偶尔混合至少几天到一周。要测量重悬蛋白的蛋白质浓度，首先制备BSA稀释系列。首先按照手稿中的说明将两毫升和 1.5 毫升的管子放在架子上。

用布拉德福德试剂将15毫升的锥形管填充到顶部，并将其放在冰上。取200微升Bradford试剂并将其弹出回锥形管中以润湿移液器吸头。由于溶液是粘稠的，请缓慢移液，使溶液完全进入和离开吸头，而不会产生气泡。

然后使用预湿吸头，将 200 微升布拉德福德试剂移液到架子中每个 1.5 毫升管中。并将15毫升锥形管的剩余内容物放回瓶中。将水量入第一、第三和第五行的两个毫升管中。

按照手稿中的说明稀释校准的BSA储备溶液，制备BSA稀释系列。然后通过将900微升每种溶液转移到下一个试管中进行连续稀释。向布拉德福德试剂管中加入800微升水用于空白并启动计时器。

在制备的试管中将800微升每种BSA标准品与200微升布拉德福德试剂混合。在与布拉德福德试剂或一次性比色皿中的每种标准品混合后五分钟内，读取600纳米处的吸光度。将获得的吸光度值绘制为已知BSA浓度的函数，并获得R值为0.99的线性相关性。

在装有2000微升水的试管中，按照手稿中的描述轻轻稀释溶解的蛋白质。立即将每种溶液800微升加入制备的布拉德福德试剂中并混合。在五分钟内读取分光光度计中的吸光度。

使用先前构建的标准曲线计算蛋白质浓度。对于珠子涂层，将离心机预冷至四摄氏度。将50微升Xb缓冲液移液到1.5毫升微量离心管中。

通过涡旋彻底混合4.5微米直径的珠悬浮液，并将9微升悬浮液加入含有Xb缓冲液的管中。将样品在 20， 000 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。要涂覆磁珠，请小心地除去上清液而不干扰磁珠，并通过轻轻移液将磁珠沉淀重悬于Xb缓冲液中的40微升两微摩尔SpVCA中。

现在在 1000 rpm 的干燥块中搅拌 18 分钟的珠子 20 分钟。接下来，通过离心洗涤包被的珠子。除去上清液并将珠子重悬于含有1%BSA的50微升冷Xb中。

洗涤珠子后，将包被的珠子沉淀重悬于120微升冷Xb，1%BSA中。存放在冰箱或冷藏室的冰上。按照手稿中的说明制备运动反应混合物。

快速混合反应并启动计时器。在载玻片上发现整个运动反应混合物。用 18 毫米 x 18 毫米的盖玻片盖住它，并使用小画笔用融化的 VALAP 密封盖玻片。

要获得整个磁珠群的平均位移速度，请通过扫描整个载玻片来记录一段时间内的相衬或荧光静止图像。手动测量彗星长度并记录值。绘制彗星长度与时间的关系图。

线性拟合的斜率是平均增长速度。在相衬显微镜中选择延时动画以评估单个磁珠速度。根据磁珠速度和所需的分辨率，每 1 到 10 秒拍摄一次帧。

使用任何图像处理程序的跟踪工具来获取磁珠速度和轨迹。将BSA标准品与布拉德福德试剂混合可获得具有分级蓝色色调的解决方案。绘制吸光度值与标准蛋白质浓度的关系图，并使用线性相关性来确定重悬的蛋白质浓度。

将SPVCA编码的磁珠和含有封端蛋白的运动培养基混合会导致肌动蛋白云在几分钟内形成。云极化发生在大约5分钟，彗星产生在15到20分钟。肌动蛋白彗星继续拉长数小时，但速度不一致。

因此，在一小时内评估磁珠运动性。运动与封端蛋白或凝胶索林的混合以类似的方式产生彗星。肌动蛋白云在反应的前20分钟内极化形成彗星，彗星随着时间的推移而伸长。

评估随时间测量的彗星长度用于计算位移速度。在没有封顶活动的情况下，肌动蛋白云在珠子周围形成，但不会发生彗星的形成。小心处理和移液蛋白质对于该过程的成功至关重要，不仅在制作运动混合物时，而且在使用Bradford测定法测量蛋白质浓度时也是如此。

通过该协议获得的彗星形成和珠子轨迹允许使用软物质和统计物理分析和生物物理实验（包括力测量和显微操作）了解运动的物理机制。