Name: 用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-28T13:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 了解如何使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动系统。本方案通过微珠表面形成肌动蛋白彗星，模拟细胞运动机制，为非专业人员提供研究细胞生物物理学的实用工具。

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我们诚挚感谢LPENS新家的各位成员给予的热情欢迎，特别是ABCDJ团队提供的所有帮助与支持。J.P.感谢ARC基金会（项目号PJA 20191209604）提供的经费支持，C.S.感谢人类前沿科学计划组织（项目号RGP0026/2020）提供的经费支持。

1. 缓冲液的配制
注意：所有缓冲液均使用超纯水（H2O）。无需无菌。将1.1–1.4步骤中所述所有溶液用0.2 µm针头滤器过滤，根据使用需求分装为每管500 µL–2 mL，于-20 °C保存。
<ol>
	<li>配制10% BSA：称取2 g BSA至50 mL锥形管中，加入H2O至20 mL刻度线。混匀直至BSA完全溶解（约30分钟），然后定容至20 mL。 
	注意：使用高质量BSA（见材料表）。10% BSA溶液用于微珠制备和运动混合液。</li>
	<li>用于微珠制备时，配制Xb缓冲液（10 mM HEPES、0.1 M KCl、1 mM MgCl2和0.1 mM CaCl2，pH 7.5）作为10倍浓缩液，使用前稀释（100 µL 10x Xb储存液 + 900 µL H2O）。通过混合100 µL 10x Xb储存液 + 100 µL 10% BSA + 800 µL H2O配制含1% BSA的Xb缓冲液（Xb/1% BSA）。</li>
	<li>配制G缓冲液（2 mM Tris、0.2 mM CaCl2、0.2 mM DTT、2 mM ATP），该缓冲液用于稀释单体肌动蛋白（G-actin）。调节pH至7，而非传统使用的pH 8（见讨论部分）。</li>
	<li>配制运动缓冲液MB13（10 mM HEPES、1.5 mM ATP、3 mM DTT、1.5 mM MgCl2、1 mM EGTA、50 mM KCl、1% BSA，pH 7.5）。某些应用中可使用10倍浓缩的MB13。但配制10x MB13时不加BSA，以免在调节pH时产生问题。在将10x MB13稀释为1x MB13时，从步骤1.1配制的10% BSA储存液中添加BSA。</li>
</ol>
2. 蛋白质溶液的制备
注意：所有重悬步骤均使用超纯 H2O。无需无菌。所有蛋白质操作均需在冰上进行，并分装至预冷的离心管中。操作时动作轻柔，避免产生气泡，切勿涡旋震荡蛋白质溶液。对于需储存于 -80°C 的蛋白储备液，无需使用液氮速冻。应根据实验需要调整分装体积，避免反复冻融超过约五次，因为这似乎不会影响任何蛋白质的活性。工作分装液可在 -20 °C 保存数周。
<ol>
	<li>按以下方法制备G-actin（兔骨骼肌）溶液。
	<ol>
		<li>脉冲离心肌动蛋白粉末（参见 材料表在 4 °C 收集管底的固体。</li>
		<li>加入H2O，按照制造商说明书操作（1 mg 蛋白质在 100 µL 冷H2O 代表未标记的肌动蛋白， 100 µg 蛋白 100 µL 冷H2O（用于ATTO标记的肌动蛋白）</li>
		<li>在冰上静置至少15分钟。用移液器轻轻吹打混匀，再于冰上静置至少15分钟，再次混匀。短时离心 4 °C 收集管底溶液，并重新混匀。</li>
		<li>制备10-50 µL 根据使用需求分装未标记的肌动蛋白 20 µL ATTO标记的肌动蛋白等分试样。将等分试样保存于-80 °C.</li>
		<li>为了分解冻干和冷冻过程中形成的肌动蛋白寡聚体，将重悬的肌动蛋白等分试样在含有额外ATP和DTT的G缓冲液中稀释约8倍（例如，稀释至 20µL 从步骤 2.1.4 的重悬肌动蛋白溶液中，加入 134 µL G缓冲液 0.32 µL 0.2 mM ATP 0.16 µL 1 M DTT）。进行荧光标记时，加入约10%标记的肌动蛋白；例如，加入 5 µL ATTO标记的肌动蛋白的结合 40 µL 将稀释的未标记肌动蛋白置于冰上，偶尔通过移液混合，使其解聚，至少放置数天至一周。随后按照步骤3所述，采用Bradford法测定蛋白质浓度。 
		注意：将稀释后的未标记和荧光标记肌动蛋白置于冷室或冰箱中冰上保存；切勿冷冻或使其升温。样品会随时间持续发生解聚，若妥善处理，可至少使用6个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重悬Arp2/3复合物（猪脑来源）（参见 材料表）按照制造商的说明进行（20 µg 蛋白 20 µL 冷 H2O)，按照步骤2.1中针对肌动蛋白所述的在冰上脉冲离心、混匀等操作顺序进行。将两管冻干粉重悬后的蛋白质溶液合并，以获得较大量的储备液，用于可重复的实验。准备 2 µL 分装并储存于 -80 °C.</li>
	<li>重悬profilin（人重组）（参见 材料表) 浓度为制造商说明书规定浓度的 4 倍100 µg 蛋白 25 µL 冷 H2O)，操作顺序包括脉冲离心、混匀等，均在冰上进行，具体步骤同2.1中的肌动蛋白处理。在测定蛋白浓度前，将两管冻干粉重悬后的蛋白溶液合并，以获得较大量的储备液，确保实验的可重复性。 
	注意：在冷室或冰箱中保持冰上操作；切勿冷冻或使其升温。若处理得当，重悬的profilin可稳定保存至少6个月至1年。</li>
	<li>重悬加帽蛋白（α1β2，人重组）（参见 材料表）按照制造商的说明进行（50 µg 蛋白 50 µL 冷 H2O)，按照步骤 2.1 中针对肌动蛋白所述的脉冲离心、混匀等操作顺序在冰上进行。冷却 50 µL 在冰上加入甘油并添加 50 µL 将重悬的帽状蛋白加入其中；轻轻混匀。于 -20 °C. 
	注意：该溶液不会冻结，且活性稳定，因此若小心操作，可作为单次分装保存数月甚至数年。小鼠重组帽蛋白是过去最常用的 体外 实验13，即将上市。</li>
	<li>重悬钙调蛋白结合蛋白（人重组，带His标签）（参见 材料表）按照制造商的说明进行（20 µg 蛋白 20 µL 冷 H2O)，按照步骤2.1中针对肌动蛋白所述的脉冲离心、混匀等操作顺序在冰上进行。约 2 µL 每天实验使用一份gelsolin；因此，准备大份量（5-10 µL）并于 -80 °C. 
	注意：以凝溶胶蛋白（gelsolin）进行的实验方案仅供参考，建议使用加帽蛋白（capping protein）替代凝溶胶蛋白，可直接购买或参照相应方法进行纯化13.</li>
	<li>重悬VCA（人WASP-VCA，GST标签）（参见 材料表比制造商说明书规定的浓度高2倍500 µg 蛋白 250 µL 冷 H2O)，操作顺序为脉冲式离心、混匀等，置于冰上进行，步骤同2.1中的肌动蛋白处理。制备 10 µL 分装并储存于 -80 °C. 
	注意：一旦SpVCA（人源pVCA、链霉亲和素和带His标签的蛋白）实现商业化或进行蛋白纯化14 如果可能，建议使用 SpVCA 代替 VCA。在本文所述条件下，VCA 无法稳定地产生彗星状条带。</li>
</ol>
3. 蛋白质浓度的测定
<ol>
	<li>构建由两组重叠的BSA系列稀释液制成的Bradford标准曲线。 
	注意：只要分光光度计不更换，标准曲线仅需每几个月（或更长时间）构建一次。
	<ol>
		<li>在微量离心管架的第1行，放置用于BSA稀释系列#1的离心管：四个2 mL离心管，后接四个1.5 mL离心管。在管架的第3行，按与系列#1相同的方式放置BSA稀释系列#2的离心管。在管架的第5行，为每个待测样品各放置一个2 mL离心管，并放置两个1.5 mL离心管。在第5行额外添加一个1.5 mL离心管用于空白对照。</li>
		<li>测定 Bradford 试剂（参见 材料表) 加入1.5 mL离心管中。
		<ol>
			<li>将Bradford试剂加至15 mL锥形管顶部（便于移液，多余试剂将放回冰箱中的原试剂瓶）并置于冰上。吸取 200 µL Bradford 试剂并将其重新排回锥形管中，以润湿移液枪头。由于溶液黏稠，移液时应缓慢操作，使溶液充分进入和离开枪头，避免产生气泡。</li>
			<li>使用“预润湿”枪头，缓慢移液 200 µL 将 Bradford 试剂加入到试管架中的每个 1.5 mL 离心管中（每种 BSA 稀释液四管，空白对照一管，每个待测样品两管）。首先进行此步骤，以便在与蛋白质溶液混合前，使 Bradford 试剂充分恢复至室温。将 15 mL 离心管中剩余的试剂倒回原瓶中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>测量 H2O至2 mL离心管中。在支架的第1排中加入 1,990 µL H2O 加入第一支试管中，然后 900 µL 到其余三个试管中。对于第3行，加入1，992.5 µL 加入第一支试管中 900 µL 到其余三个试管中。加入 2,000 µL H2向第5行的每个样品管中加入O。 
		注意：对于所有体积大于 1,000 µL，使用一个 1,000 µL 移液枪，但需分两次移取以确保加入全部体积。在开始后续步骤之前，务必将所有试剂和材料准备就绪，以避免蛋白质在 H 中长时间处于高度稀释状态2长时间。</li>
		<li>为制备BSA稀释系列#1，混合 10 µL 2 mg/mL BSA 标准品（参见 材料表) 加入到管中 1,990 µL H2O 以制作一个 10 µg/mL 溶液。由此进行三次连续稀释（5 µg/mL, 2.5 µg/mL，以及 1.25 µg/mL BSA）通过转移 900 µL 每种溶液依次加入下一管（含有 900 µL H2O</li>
		<li>为制备BSA稀释系列#2，混合 7.5 µL 将校准的 2 mg/mL BSA 加入含有 1 的试管中，992.5 µL H2O以制作一个 7.5 µg/mL 溶液。由此进行三次连续稀释（3.75 µg/mL, 1.875 µg/mL 和 0.9375 µg/mL BSA）通过转移 900 µL 每种溶液依次加入下一管（含有 900 µL H2O</li>
		<li>混合并读取吸光度以生成标准曲线。添加 800 µL H2向空白管中的 Bradford 试剂加入 O，然后启动计时器。尽可能高效地混合，避免产生气泡 800 µL 每种BSA标准品 200 µL 将 Bradford 试剂加入已准备好的试管中。待所有标准品均与 Bradford 试剂混合后（&lt; 5 分钟后，将每个标准品加入一次性比色皿中，使用分光光度计在 600 nm 处测定吸光度，测定前需先用空白样校准仪器。 
		注意：如果先测定浓度最低的标准品，并在每次测定后将比色皿充分排空，则可使用同一比色皿连续测定整个系列。重复绘制标准曲线，直至线性拟合的 R 值至少达到 0.99。只有在熟练掌握移液和轻柔混匀操作后，方可进行样品测定。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定肌动蛋白及肌动蛋白结合蛋白的浓度
	<ol>
		<li>在含有2 mL的离心管中 2,000 µL H的2O（在步骤 3.1.3 中制备），轻柔混入以下成分： 2 µL Arp2/3复合物和profilin各一份 4 µL 标记的G-actin 5 µL gelsolin 和 VCA 各自 8 µL 人重组加帽蛋白。立即进行 800 µL 将溶液与预先配制的Bradford试剂混合，每份样品重复测定两次，确保两次读数差异在5%-10%以内。若差异较大，表明样品重悬或操作过程中存在问题。与Bradford试剂混合后数分钟内完成读数。 
		注意：如果使用其他日期的标准曲线，则除了样品外，只需准备步骤 3.1.6 中的空白样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准曲线和稀释倍数计算肌动蛋白及肌动蛋白结合蛋白的浓度。每次重新悬浮样品后均需重复测量。利用分子量将测得的 mg/mL 数值进行转换 通过 Bradford 法测定蛋白质浓度 µM 肌动蛋白 43 kD，Arp2/3 复合物 224 kD，profilin 15 kD，gelsolin 95 kD，帽蛋白 68 kD（人重组）或 63.5 kD（小鼠重组），VCA 43 kD，以及 SpVCA 54 kD（单体分子量）。</li>
</ol>
4. 磁珠包被
<ol>
	<li>预冷离心机至 4 °C 并设置振荡干式恒温器（参见 材料表) 至 18 °C.</li>
	<li>洗涤磁珠：用移液器吹打 50 µL 将Xb缓冲液加入1.5 mL微量离心管中，添加 9 µL 的 4.5 µm 直径珠悬浮液或 2 µL 的 1 µm 直径珠悬浮液（2.5 % w/v 悬浮液）（参见 材料表). 充分混匀，并在20,000 x g条件下离心样品 g 10 分钟 4 °C. 
	注意：两种尺寸微珠的总表面积为3 cm2: 
	<img alt="S值测定公式，微珠体积计算，悬浮液分析方程，科学研究" src="/files/ftp_upload/64261/64261eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> 
	通过使用球体体积和表面积的经典公式计算微珠数量及其总表面积而得出。若调整用量以保持总表面积恒定在3 cm²，也可使用其他尺寸的微珠。2.</li>
	<li>包被珠子：小心移除上清液，避免扰动珠子，将珠子沉淀重悬于 40 µL 的 2 µM SpVCA（或 7 µM 在Xb缓冲液中通过轻柔吹打进行VCA混合。振荡处理 18 °C，1,000 rpm 离心 20 分钟。</li>
	<li>洗涤包被珠：将混合物离心（20,000 x g 10 分钟 4 °C）并小心移除上清液。将珠子重悬于 50 µL 冷的 Xb/1% BSA，然后在 20,000 x g 10 分钟 4 °C. 吸去上清液，并重复洗涤步骤1次。</li>
	<li>将第4.4步中的包被珠沉淀物重悬于 120 µL 冷的 Xb/1% BSA，适用于两种尺寸的磁珠，以确保磁珠表面积/µL 磁珠溶液的浓度应保持一致。将磁珠置于冰上，并储存在冰箱或冷室中。包被后的磁珠在至少数周内可保持正常功能。</li>
</ol>
5. 准备用于观察的运动混合液和载玻片
注意：运动性反应体系的总体积为 8.4 µL，可确保载玻片与 18 mm × 18 mm 盖玻片之间约有 25 µm 的间隙，从而避免挤压所有尺寸的微珠（直径最大达 10 µm）。基础运动性反应体系包含约 5 µM G-肌动蛋白（其中 10% 为荧光标记肌动蛋白）、5 µM 胸腺素 β4 结合蛋白（profilin）、50 nM Arp2/3 复合物以及 25 nM 封端蛋白（或 240 nM 凝溶胶蛋白）。
<ol>
	<li>配制运动反应混合液。肌动蛋白（以及因此的胸腺素/前纤维蛋白结合蛋白，profilin）的具体用量取决于步骤 3.3 中计算出的浓度，但一个代表性反应如下：按以下顺序在冰上混合：3.2 µL MB13 缓冲液，1.5 µL 浓度为 30 µM 的 profilin（用 MB13 缓冲液稀释），1 µL 浓度为 0.21 µM 的封端蛋白（用 MB13 缓冲液稀释）或浓度为 2 µM 的凝溶胶蛋白（gelsolin，用 MB13 缓冲液稀释），1 µL 浓度为 0.47 µM 的 Arp2/3 复合物（用 MB13 缓冲液稀释），0.2 µL 微球悬浮液（使用前充分涡旋振荡），以及 1.5 µL 浓度为 30 µM 的肌动蛋白（溶于 G-buffer 中）。充分但迅速混匀后立即启动计时。</li>
	<li>将整个运动反应混合液滴加到载玻片上。盖上一块 18 mm × 18 mm 的盖玻片，并用熔化的 VALAP 封固盖玻片边缘，使用小号画笔操作。VALAP 是由羊毛脂、石蜡和凡士林按质量比 1:1:1 混合而成（参见材料表），加热熔化并搅拌均匀。</li>
</ol>
6. 显微镜观察
<ol>
	<li>立即使用直立或倒置显微镜的100倍物镜观察运动性反应（参见 材料表），配备相差显微镜和/或落射荧光显微镜（GFP滤光片组，参见 材料表）。观察在室温（23-25 °C).
	<ol>
		<li>为获得整个微珠群体的平均位移速度，需通过扫描整张载玻片，随时间记录相差或荧光静态图像。手动测量彗星长度，并将其对时间作图。线性拟合的斜率即为平均生长速度。</li>
		<li>为评估单个微珠的运动速度，使用相差显微镜采集延时成像视频。根据微珠运动速度及所需分辨率，每1-10秒采集一帧图像。利用任意图像处理软件中的追踪工具获取微珠的速度与运动轨迹。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明，他们对本文内容不存在利益冲突。

本方案详细描述了如何利用商业化蛋白质在微珠表面获得肌动蛋白网络生长、彗星状结构形成及微珠运动。然而，有时彗星状结构无法稳定重复观察到，或在载玻片与盖玻片之间存在不均一性。以下讨论强调了本方案中的一些关键点，并建议了一些可调整的参数。需要注意的一个因素是，彗星状结构的形成和微珠运动速度受温度影响，温度显著高于25 °C或显著低于23 °C均会负面影响彗星状结构的形成，并导致实验数据不可重复。强烈建议使用温控显微镜或在温控环境中进行显微观察。尽管在运动反应体系中通常加入荧光标记的肌动蛋白，以便通过荧光显微镜观察彗星状结构，但当彗星长度超过一个微珠直径时，也可通过相差显微镜在微珠旁观察到暗色条纹状结构。对于延时成像而言，相差显微观察更为合适，因为即使在较低光照条件下，荧光成像仍可能伴随一定的光毒性 通过 旋转圆盘。由于珠子会随时间沉降，倒置显微镜相比正置显微镜能减少珠子的水平漂移，更适合用于拍摄动态影像。使用熔融的VALAP密封载玻片至关重要，因为指甲油等物质会干扰彗星结构的形成。可在烧杯中大量制备VALAP，随后舀出分装至更易于快速熔化的较小烧杯中。VALAP在室温下可长期保存多年。
另一个关键的技术环节是缓冲液和运动混合液的精细配制。配制MB13时需特别注意pH调节步骤。应迅速用NaOH将MB13的pH调至中性，以避免ATP水解，但也不能过快，因为随着pH接近中性，EGTA会逐渐溶解。EGTA是关键组分，因为它能与肌动蛋白结合的钙离子形成复合物，从而在运动混合液中释放出活性更高的镁形式肌动蛋白16。若MB13配制过快或过慢，均会导致彗星结构形成不佳，甚至完全无法形成。另一个关键点是在调整实验条件时，需精确控制运动混合液中的KCl浓度。例如，当在反应体系中使用1x MB13，并将profilin、封端蛋白和Arp2/3复合物溶解于MB13中时，由于G缓冲液的稀释作用，运动反应体系中的终末KCl浓度约为40–50 mM。该浓度在彗星实验中效果最佳，而KCl浓度超过60 mM则会降低Arp2/3复合物的成核活性。
在蛋白质方面，获得肌动蛋白彗尾的一个关键技术要点是正确处理市售的肌动蛋白结合蛋白，特别是精确移取微升级别的样品。Bradford标准曲线的线性程度是检验移液操作是否准确的良好指标，该标准曲线随后可用于蛋白质浓度的常规测定。事实上，在将市售蛋白质重悬后用于彗尾实验时，始终验证蛋白质浓度至关重要，因为不同批次间的差异以及重悬过程中操作者的误差可能导致实际浓度与预期浓度之间存在差异。有时蛋白质浓度的微小差异就可能导致完全无法形成彗尾结构。
该方法另一个重要方面是使用与凝溶蛋白结合的G-肌动蛋白作为聚合反应的燃料。从历史上看， 体外 以预先聚合的丝状肌动蛋白（F-actin）作为肌动蛋白来源的系统：体相中的解聚为表面聚合提供原料10,17这虽然能够控制G-actin的水平，但增加了复杂性，需要额外的组分来催化去聚合。由于肌动蛋白网络的周转对于力的产生和运动并非必需——这些过程由珠子表面的成核和聚合提供动力——而诸如ADF/cofilin等促进肌动蛋白去聚合的因子作用于远离表面的老化网络18，大多数 体外 为简化实验，目前基于肌动蛋白的运动重建通常在无周转条件下进行。然而，使用G-actin存在一些缺点。首先，市售的冻干肌动蛋白中常含有寡聚体。因此，本文所述的去聚合步骤对于获得可重复的实验结果至关重要。特别是，尽管传统上G缓冲液的pH值调节至8，但在本文所述的实验中，较低的pH值（例如pH 7）似乎效果更佳，可能是因为较低的pH值有助于增强去聚合过程。19使用G-actin的另一个缺点是，一旦置于允许聚合的盐条件下，就会发生自发成核，导致在溶液本体中以及微球表面均形成F-actin。将G-actin与profilin结合可抑制溶液本体中的自发成核和钝端聚合，从而将成核和锋端聚合集中于表面进行20Profilin-G-actin具有生理相关性，因为细胞中大部分肌动蛋白以这种形式存在21此处使用 1:1 的profilin:actin比例；然而，更高的比例（例如 3:1）对体相中聚合的抑制更彻底，尽管较高比例在一定程度上也会抑制Arp2/3复合物和钝端的延伸22,23.
加帽活性对于彗星结构的形成也至关重要，因为它通过表面激活的 Arp2/3 复合物介导的成核循环，确保新的肌动蛋白插入到表面via成核循环24,25。若无加帽作用，肌动蛋白云无法打破对称性形成彗星结构，因为表面的聚合无法积累足够的张力以破裂肌动蛋白云26。过去，我们曾使用自行纯化的重组小鼠加帽蛋白13，但本文所进行的测试表明， commercially available 重组人加帽蛋白同样有效；此外，市售的凝溶胶蛋白（gelsolin）也具有类似效果，尽管其使用浓度需高出 10 倍，且在某些应用中可能并不合适，因为它兼具肌动蛋白切割活性和加帽活性27。
最后，该方法的稳健性在于使用了一种活性极高的Arp2/3复合物激活剂——链霉亲和素-pVCA（SpVCA）。28SpVCA 包含 WASP 的凝溶胶蛋白-G-肌动蛋白结合结构域（p 结构域）以及 Arp2/3 复合物结合结构域，因为在含有凝溶胶蛋白-G-肌动蛋白的条件下，这种组合被发现效率最高29更重要的是，链霉亲和素标签的使用，最初旨在实现表面功能化 通过 生物素-链霉亲和素连接还具有增强Arp2/3复合物活化的作用，这可能是由于链霉亲和素为四聚体，因而能够使活化因子发生簇集，而活化因子的簇集已知可提高Arp2/3复合物的活性30目前，商业生产的 SpVCA 正在研发中，即将可购买。还应注意，尽管通常使用 40 µL 的 2 µM SpVCA 涂覆 3 cm2 珠子表面的包被浓度（更高或更低）也有效，调整这些条件可导致彗星状结构生长速度和形态的不同。实际上，当彗星状结构未形成或载玻片上彗星大小不均一时，应尝试不同的包被条件，以及运动缓冲液中不同浓度的KCl和凝溶蛋白（profilin）。运动缓冲液中肌动蛋白、Arp2/3复合物和封端蛋白的浓度也可调整以优化彗星状结构的形成，但在我们的实验中，改变这些组分的比例常导致结果不明确。
总之，本文所述方法可在微珠表面诱导肌动蛋白组装及运动，但任何可用SpVCA功能化的表面均可使用。若此处所述的吸附方法不适用，可在目标表面进行生物素化后，利用链霉亲和素部分将SpVCA连接至该表面。由此形成的肌动蛋白结构（如彗星状结构或其他形态）可用于检测肌动蛋白网络的不同生化与生物物理特性，尤其适用于利用微管、光镊和激光消融进行的物理操作15,26,31,32。除在科研领域中的应用外，本文所述方法也适合作为本科生物物理学教学工具，用于帮助学生理解活性物质中的对称性破缺和自组织等概念。

细胞中肌动蛋白的聚合受到细胞信号通路下游肌动蛋白丝成核过程的严格调控，具有精确的空间和时间控制1成核发生 通过 肌动蛋白三聚体的形成，随后新生纤维的两端均会自发聚合，但其中一端（钝端）比另一端（尖端）更具动态性。2当成核和正端聚合被导向某一表面时，能够产生足够的力（在皮牛至纳牛范围内），利用ATP水解作为能量来源，推动细胞膜向外突出以实现运动，并推动细胞内微米级物体的移动。3一些示例包括 单核细胞增生李斯特菌 利用肌动蛋白彗尾在细胞间传播的细菌，以及在线粒体中，基于肌动蛋白彗尾的运动在有丝分裂期间的随机遗传过程中具有重要作用4,5内体及其他细胞内囊泡上的肌动蛋白彗尾与从供体膜上的脱离有关6,7,8.
通过本文介绍的方法，可绕过细胞内肌动蛋白聚合的信号调控过程，直接在微米级聚苯乙烯微球上通过包被分支型肌动蛋白成核激活剂——人WASP蛋白的活性结构域VCA（也称为WA或WCA）1，诱导肌动蛋白聚合。将包被后的微球孵育于含有肌动蛋白聚合所需组分的混合液中，其中包括细胞内主要的肌动蛋白成核因子Arp2/3复合物；该复合物在微球表面被VCA激活，从而在子代肌动蛋白丝的侧边形成新的分支纤维1。肌动蛋白最初在微球周围均匀聚合，随后自发打破对称性，形成推动微球向前运动的肌动蛋白彗尾结构，从而以可控方式重建类似细胞的突出结构和彗尾现象。过去，我们及其他研究者曾利用包被微球或其他包被表面的类似方法研究肌动蛋白聚合的生物化学与生物物理机制9,10,11,12，但这些实验需要研究者具备丰富的肌动蛋白结合蛋白操作经验。本文所述方案则详细说明了如何仅使用 commercially available（或即将可获得）的试剂，稳定地构建肌动蛋白彗尾及其运动行为，使该方法可被广泛研究人员（包括用于教学生物物理概念的教育场景）所采用。关键步骤包括轻柔且可靠的移液操作、使用profilin复合的肌动蛋白单体作为聚合原料，以及必须采用高活性的Arp2/3复合物激活剂作为微球包被试剂。

<table><tbody><tr><td>肌动蛋白，兔肌，Alexa Fluor 488 标记&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen (ThermoFisher Scientific)</td><td>A12373 (近期已停产)</td><td>该产品可用 Hypermol 公司的 ATTO-488 标记肌动蛋白替代。</td></tr><tr><td>肌动蛋白，兔肌，ATTO-488 标记</td><td>Hypermol</td><td>8153</td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白，兔骨骼肌</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Arp2/3 复合物</td><td>Cytoskeleton</td><td>RP01P</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BioSpectrometer 基础型</td><td>Eppendorf</td><td>035739</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>BSA，高纯度</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>BSA 标准品 2 mg/mL (Pierce)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23209</td><td></td></tr><tr><td>封端蛋白 (a1b2，小鼠重组)</td><td>实验室自制 (参考文献 13)</td><td></td><td>该产品即将由 Cytoskeleton 公司商业化供应。</td></tr><tr><td>封端蛋白 (a1b2，人重组)</td><td>Hypermol</td><td>8322</td><td></td></tr><tr><td>GFP 滤光块：U-MNIBA3 或 U-MWB2</td><td>Olympus</td><td>已停产</td><td>可使用任何适配所用显微镜的 GFP 滤光块。</td></tr><tr><td>带振荡功能的干式恒温仪：ThermoMixer C (带制冷功能)</td><td>Eppendorf</td><td>035963</td><td></td></tr><tr><td>** 配 SmartBlock，24 个 2 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>035969</td><td></td></tr><tr><td>凝溶胶蛋白 (人重组，带 His 标签)</td><td>Cytoskeleton</td><td>HPG6</td><td></td></tr><tr><td>羊毛脂</td><td>Sigma</td><td>49909</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机 5427R + 转子</td><td>Eppendorf</td><td>934126</td><td></td></tr><tr><td>正置显微镜：BX51</td><td>Olympus</td><td>已停产</td><td>任何配备相差光学系统的落射荧光正置显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>倒置显微镜：IX70</td><td>Olympus</td><td>已停产</td><td>任何配备相差光学系统的落射荧光倒置显微镜均可使用。</td></tr><tr><td>石蜡</td><td>Sigma</td><td>76244</td><td></td></tr><tr><td>凡士林：Vaseline</td><td>Sigma</td><td>16415</td><td></td></tr><tr><td>Research Plus 移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Gilson 移液器在加样极小体积（例如 0.5 &amp;micro;L）时表现不佳。</td></tr><tr><td>**10 &amp;micro;L</td><td></td><td>933954</td><td></td></tr><tr><td>**2.5 &amp;micro;L</td><td></td><td>933953</td><td>这两个规格至关重要，但建议使用高质量移液器（例如整套 Research Plus 移液器）。</td></tr><tr><td>聚苯乙烯羧基微球</td><td>Polysciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>**直径约 1 &amp;micro;m</td><td></td><td>08226</td><td></td></tr><tr><td>**直径约 4.5 &amp;micro;m</td><td></td><td>17140-5</td><td></td></tr><tr><td>Profilin 1 (人重组，无标签)</td><td>Cytoskeleton</td><td>PR02</td><td></td></tr><tr><td>SpVCA (人 WASP pVCA 结构域，N 端 His 标签，C 端链霉亲和素标签)</td><td>实验室自制 (参考文献 14)</td><td></td><td>该产品即将由 Cytoskeleton 公司商业化供应。</td></tr><tr><td>VCA (人 WASP VCA 结构域，GST 标签)</td><td>Cytoskeleton</td><td>VCG03</td><td></td></tr></tbody></table>

使用市售蛋白质重建基于肌动蛋白的运动

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

许多细胞运动和形态变化，以及某些类型的细胞内细菌和细胞器运动，均由生物聚合物肌动蛋白（actin）驱动，该蛋白在细胞、细胞器或细菌表面形成动态网络。通过在功能化修饰并孵育了特定组分的惰性表面（如微珠）上以无细胞方式重现基于肌动蛋白的运动，可研究此过程中力产生的生化与力学基础。在适当条件下，弹性肌动蛋白网络在微珠表面组装，并因网络生长所产生的应力而破裂，形成推动微珠前进的“肌动蛋白彗尾”（actin comet）。然而，此类实验通常需要纯化多种不同的肌动蛋白结合蛋白，往往使非专业研究人员难以开展。本文详细描述了一种利用市售试剂可重复获得肌动蛋白彗尾及微珠运动的实验方案。可通过改变微珠包被方式、微珠尺寸和运动反应混合物，观察其对微珠运动速度、轨迹及其他参数的影响。该检测方法可用于测试不同肌动蛋白结合蛋白的生化活性，以及进行定量的物理测量，从而揭示肌动蛋白网络的活性物质特性。这一工具将为科研群体提供便利，使研究人员无需具备肌动蛋白结合蛋白纯化的专业知识即可开展体外（in vitro）基于肌动蛋白的运动研究。

可重复地在微珠上形成肌动蛋白彗尾的一个关键环节，是对精细的肌动蛋白结合蛋白进行轻柔且精确的移液操作。制作考马斯亮蓝（Bradford）标准曲线是评估移液技能的有效方法。图1A、B展示了标准曲线所用试管以及牛血清白蛋白（BSA）经连续稀释后与考马斯亮蓝试剂混合后的外观示例。注意溶液呈现的梯度蓝色（蛋白质浓度越高，溶液蓝色越深）。当在分光光度计中读取数据并作图时，这些溶液可得到如图1C所示的标准曲线。为练习精细移液操作，应重复该检测，直至线性相关系数达到0.999，如图所示。
在仔细评估商品化重悬蛋白的浓度后 通过 将 Bradford 法检测试剂、包被珠和运动混合液进行配制并混合在一起。 图 2A 展示了彗星状结构形成不同阶段的代表性图像：在将SpVCA包被的微珠与运动缓冲液混合后几分钟内形成肌动蛋白云；约5分钟时出现云状结构的极化，15-20分钟时产生彗星状结构。这些肌动蛋白彗星可在落射荧光显微镜和相差显微镜下观察到图2A），会持续伸长数小时，但其速度并不恒定，因此通常在1小时内评估珠粒运动性。另一方面，使用VCA包被的珠粒约需30分钟即可形成明亮的肌动蛋白云图2B），且无彗星状结构形成，尽管在1-2小时时对称性开始出现破坏（箭头所示 图2B）和云雾状物在过夜孵育后显示极化现象。
图3展示了在存在加帽蛋白的情况下对珠粒运动速度进行评估的示例。由于所有珠粒几乎在同一时间打破对称性，因此采用“伪时间序列”记录方式，即对载玻片进行扫描，并随时间推移拍摄整个彗星状结构群体的图像（图3A）。彗星状结构不会发生解聚，因此可通过随时间测量彗星长度的增加来计算位移速度（图3B）。若使用gelsolin替代加帽蛋白诱导彗星形成，则需加入10倍量的gelsolin以弥补其较弱的加帽活性。在gelsolin存在下形成的彗星状结构在性质上与加帽蛋白存在时形成的彗星相同，且运动速度大致相等（图3C）。加帽活性对于将聚合反应集中于珠粒表面至关重要；当运动反应体系中既不添加加帽蛋白也不添加gelsolin时，肌动蛋白云无法极化形成彗星状结构，尽管珠粒周围仍会形成明亮的肌动蛋白云（图3D）。通过改变运动反应体系的生化组成，并结合不同的显微操作技术观察运动行为的变化，可利用珠粒上的彗星状结构在不同生化条件下测量肌动蛋白介导的力生成，例如15。
<img alt="Bradford 法测定蛋白浓度：使用 BSA 梯度稀释液、试剂及标准曲线图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：Bradford 标准曲线。（A）用于制备 Bradford 标准曲线的试管设置示意图，未显示样品管。（B）两种重叠的 BSA 系列稀释液与 Bradford 试剂混合后的图像。（C）在分光光度计中测定（B）中溶液在 600 nm 处的吸光度，并将其对 BSA 溶液的蛋白浓度作图。利用线性拟合计算样品浓度，线性拟合的相关系数 R 为 0.999。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SpVCA 和 VCA 包被珠子随时间的聚集情况；显微镜图像；时间点从 1 分钟到 17 小时。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图 2：SpVCA 包被珠子与 VCA 包被珠子上的彗星状结构形成对比。（A）随时间变化的代表性 SpVCA 包被珠子图像（每张图像中为不同珠子），时间自混合起始时刻开始计算。肌动蛋白云立即形成，随后云状结构发生极化，形成彗星状结构，并持续数小时不断延长。（B）随时间变化的代表性 VCA 包被珠子图像（每张图像中为不同珠子）。需要超过 1 小时才能观察到肌动蛋白云极化的初始迹象（箭头所示），即使长时间孵育也无法形成彗星状结构。所有图像均为直径 4.5 µm 的珠子，其中（A）中 15 和 20 分钟时间点采用荧光标记肌动蛋白的落射荧光成像，并结合相差成像进行观察，比例尺 = 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="肌动蛋白聚合延时，CP/凝溶胶蛋白效应，彗星长度随时间变化图，蛋白质研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64261/64261fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：彗星结构与珠粒运动速度分析。 （A）和（C）在存在加帽蛋白（CP）或凝溶胶蛋白的情况下，肌动蛋白云在反应开始后的前20分钟内发生极化，形成彗星结构，并随时间逐渐延长。每张图像标注了混合后的时间；每张图像来自不同的珠粒。不同珠粒及其制备之间存在一定变异性，但在本实验所述的标准条件下，珠粒平均移动速度为每分钟微米/亚微米级别（0.2–1 µm/min）。（B）代表性图表，显示随时间推移对彗星长度（全部珠粒群体）的评估结果。线性相关斜率对应平均位移速度，本例中为0.24 µm/min。（D）在无加帽活性（无加帽蛋白或凝溶胶蛋白）的情况下，肌动蛋白云可在珠粒周围形成，但无法形成彗星结构。所有图像均为直径4.5 µm的珠粒，通过落射荧光显微镜观察荧光标记的肌动蛋白，比例尺 = 5 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64261/64261fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案描述了如何使用市售蛋白质组分在微珠表面产生肌动蛋白彗尾结构。此类系统可模拟细胞中的突出结构，能够以简化的方式研究力生成的生理机制。

许多细胞运动和形态变化，以及某些类型的细胞内细菌和细胞器运动，是由形成...的生物聚合物肌动蛋白驱动的

通过简单的成分混合和功能化表面，本方案可重现细胞的一种关键功能——由肌动蛋白组装驱动的运动。通过改变成分组合和功能化表面的特性，可评估产生力的生化与生物物理机制。本方案的主要优势在于所有组分均可直接购买，无需具备蛋白质纯化的专业知识。这使得非专业人员也能将该系统作为研究工具加以使用。本方案提供了一个适合本科生教学的模块，使学生能够亲手操作蛋白质，并在显微镜下观察自行制备的生物系统。学生可对系统参数进行控制和调节。可对轨迹进行物理分析，例如朗缪尔方程分析。首先将冻干蛋白重新悬浮。将蛋白粉末在4 °C下短暂离心，使固体聚集于离心管底部。然后根据制造商的说明加入水，并在冰上孵育至少15分钟。用移液器轻轻混匀。再在冰上放置15分钟，并再次混匀。通过离心收集管底的溶液。重新混匀后，在冰上分装。为了去聚合在冻干和冷冻过程中形成的肌动蛋白寡聚体，用含有额外ATP、DTT和10%标记肌动蛋白的G缓冲液将重悬的肌动蛋白稀释八倍。将样品置于冰上，间歇混匀，使其解聚至少数天至一周，然后测定蛋白质浓度。为测定重悬蛋白质的浓度，首先制备牛血清白蛋白（BSA）梯度稀释系列。按照文稿中的描述，先将2毫升和1.5毫升离心管放入试管架中。用考马斯亮蓝试剂（Bradford Reagent）注满一支15毫升的锥形管，并将其置于冰上。取200微升考马斯亮蓝试剂，再将其排回锥形管中以润洗移液枪头。由于溶液黏稠，移液时应缓慢操作，确保液体完全进入和离开枪头，避免产生气泡。然后使用预先润湿的枪头，将200微升考马斯亮蓝试剂加入到架子上的每个1.5毫升离心管中。并将15毫升锥形管中剩余的试剂倒回原瓶中。向第一、第三和第五行的两个2毫升离心管中分别加入适量的水。按照文稿中所述方法，通过稀释校准的 BSA 储备液来制备 BSA 梯度稀释系列。然后通过将每种溶液 900 微升转移至下一试管中进行连续稀释。向 Bradford 试剂管中加入 800 微升水作为空白对照，并启动计时器。在已准备好的试管中，将每种BSA标准品800微升与200微升Bradford试剂混合。混合后5分钟内，将每种标准品取适量加入一次性比色皿，于600纳米处测定吸光度。以已知BSA浓度为横坐标，测得的吸光度值为纵坐标作图，获得线性相关曲线，R值应达到0.99。在含有 2000 µL 水的离心管中，按照文中的描述轻柔稀释重新溶解的蛋白质。立即将每种溶液 800 µL 加入已配制好的 Bradford 试剂中并混匀。在五分钟内用分光光度计读取吸光度。使用先前构建的标准曲线计算蛋白质浓度。用于珠子包被时，将离心机预冷至四摄氏度。用移液器将50微升Xb缓冲液移入1.5毫升微量离心管中。通过涡旋充分混匀直径为4.5微米的珠子悬浮液，并向含有Xb缓冲液的离心管中加入9微升该悬浮液。在4°C条件下，以20,000 G离心10分钟。为包被珠子，小心移除上清液，避免扰动珠子沉淀，然后用移液枪轻轻吹打，将珠子沉淀重悬于40微升含2微摩尔SpVCA的Xb缓冲液中。现在将珠子置于干燥模块中，在18摄氏度、1000 RPM条件下振荡20分钟。随后，通过离心洗涤包被的珠子，弃去上清液，并将珠子重悬于50微升含1% BSA的冷Xb溶液中。洗涤磁珠后，将包被的磁珠沉淀重悬于 120 微升冰冷的 Xb 缓冲液（含 1% BSA）中。置于冰上，并在冰箱或冷室中保存。按照论文所述方法配制运动反应混合液。迅速混合反应液并启动计时器。将全部运动反应混合物点样到载玻片上。用18毫米×18毫米的盖玻片覆盖，并用小画笔蘸取熔化的VALAP密封盖玻片边缘。为了获得整个微珠群体的平均位移速度，通过扫描整个载玻片，随时间记录相差或荧光静态图像。手动测量彗星长度并记录数值。绘制彗星长度随时间变化的曲线图。线性拟合的斜率即为平均生长速度。在相差显微镜下选择延时录像以评估单个微珠的运动速度。根据微珠运动速度及所需分辨率，每1至10秒采集一帧图像。使用任意图像处理程序的追踪工具获取微珠的速度和轨迹。将 BSA 标准品与 Bradford 试剂混合，得到具有梯度蓝色色调的溶液。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，利用线性相关性确定重悬蛋白的浓度。将SPVCA编码的微珠与含有封端蛋白的运动缓冲液混合，可在数分钟内形成肌动蛋白云。约五分钟后出现肌动蛋白云的极化，15至20分钟后产生彗星状结构。肌动蛋白彗星可持续延长数小时，但其移动速度并不恒定。因此，珠子运动性在1小时内进行评估。无论使用帽蛋白还是凝溶胶蛋白，运动性混合物均能以类似方式产生彗星状结构。在反应开始的前20分钟内，肌动蛋白云极化形成彗星状结构，并随时间推移而延长。通过测量随时间变化的彗星尾长度来计算位移速度。在缺乏加帽活性的情况下，肌动蛋白会在微珠周围形成云状聚集，但不会形成彗星尾结构。在整个实验过程中，对蛋白质的小心操作和移液至关重要，这不仅包括运动混合液的配制，也包括使用Bradford法测定蛋白质浓度时的操作。通过本方案获得的彗星形成过程和珠粒运动轨迹，可用于结合软物质与统计物理分析以及生物物理实验（包括力测量和微操作）来理解其运动的物理机制。

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