Name: 使用显微计算机断层扫描评估骨折愈合 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: 学习使用显微计算机断层扫描技术评估骨折愈合的标准化方案。本研究提供详细的μCT成像步骤，包括样本制备、图像采集、三维重建和骨痂体积分析，为临床前骨愈合研究提供可靠的定量评估方法。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）R01 DK121327（资助R.A.E）和R01 AR071968（资助F.K.）的支持。

以下方案旨在对安乐死小鼠采集的长骨愈合组织（骨痂）进行表征。然而，其中大部分步骤也可适用于大鼠，并可用于 体内 骨折的扫描。该方案描述了一种特定的 µCT 系统及特定的图像处理、分析和可视化软件（参见 材料清单），但该方法通常适用于其他扫描仪和软件。本方案已获宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会批准。本研究使用的小鼠为16周龄雄性C57BL/6J小鼠（平均体重31.45 ± 3.2 g）。
1. 组织采集与保存
注意：采用合适的鼠类骨折模型。本研究中使用的是中段骨干开放性胫骨骨折模型，具体操作依据文献12,13中所述的标准方案进行。
<ol>
	<li>骨折模型实验结束后，通过腹腔注射氯胺酮或赛拉嗪（剂量分别为 500 mg/kg 或 50 mg/kg）处死小鼠。</li>
	<li>使用剪刀从股骨中段至胫距关节处完整取下骨折骨组织，注意不要扰动骨折部位。去除骨骼周围的肌肉组织，仅保留与骨直接接触并能支撑骨折部位的软组织，以用于后续处理步骤。使用微型直蚊式止血钳取出髓内针。</li>
	<li>将样本保存在 4 °C 的甲醛溶液中或 -20 °C 的生理盐水中。保存介质的选择取决于后续是否进行微计算机断层扫描（µCT）分析。本研究中，样本保存于 -20 °C 的生理盐水中。</li>
</ol>
2. µCT 扫描
<ol>
	<li>样本制备
	<ol>
		<li>为实现多个样本的同时扫描，将最多六个样本放入定制开发的3D打印扫描夹具（图1 A,B）或类似装置中。同时扫描可减少扫描时间和成本。本研究中使用的定制夹具包含六个用于固定长骨样本的插槽，以及一个用于放置羟基磷灰石（HA）体模的中心孔（图1A,B；材料表）。 
		注：HA体模将在第4.2步（见下文）中作为标准，用于将µCT单位（通常为Hounsfield单位）转换为HA密度（mgHA/ccm）。</li>
		<li>将准备好的夹具放入与视野（FOV）直径相近的注射器或锥形管中（图1C）。本研究中使用了直径为20 mm的注射器，以匹配21.5 mm的视野。</li>
		<li>为防止样本在扫描过程中干燥，向注射器或锥形管中加入步骤1.3中使用的保存液（本研究中使用生理盐水）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扫描
	<ol>
		<li>扫描前，确认µCT设备已校准：将HA体模置于µCT视野（FOV）的中心线上，扫描该体模并测量其HA密度。确保测得的密度与制造商提供的密度一致。</li>
		<li>将样本夹具的中心线与µCT视野的大致中心线对齐。这可确保样本位于视野范围内，且其长轴方向与所得图像的轴向基本一致。 
		注：这种标准化的取向后续有助于减少分析过程中的变异性，例如在感兴趣体积内所考虑组织量方面的差异。</li>
		<li>设置µCT系统的扫描参数（材料表）。本研究使用的参数为：10.5 µm（各向同性体素尺寸）、55 kVp（能量/强度）、145 µA（电流）和300 ms（积分时间）。根据小鼠骨小梁的大致厚度（20–60 µm）8确定体素尺寸。通过不同视角观察扫描图像，确保覆盖所有骨痂样本的完整体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="羟基磷灰石（HA）模体扫描夹具、实验装置、示意图、生物医学研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64262/64262fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：定制扫描夹具的结构。（A）扫描夹具的图像（上图），显示六个样品槽，以及羟基磷灰石（HA）模体（下图）。（B）显示长骨样品（上图）和置于专用槽位中的羟基磷灰石（HA）模体（下图）的图像。（C）显示将扫描夹具放入20 mm注射器中的图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64262/64262fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 图像分割
注意：原始图像将自动重建为图像序列数据。
<ol>
	<li>图像转换：使用图像处理软件（参见材料表）将重建的图像序列数据转换为DICOM图像序列。将DICOM图像序列导入软件（参见材料表）中，用于图像处理、分析和可视化（图2A）。</li>
	<li>图像裁剪：逐个样本对每幅图像堆栈进行裁剪，确保裁剪后的体积包含整个样本（图2B）。保存裁剪后的图像：单击屏幕左上角的文件 选项卡，选择保存项目，然后从屏幕上显示的选项中选择最小化项目大小 。文件将以商业软件格式保存。</li>
	<li>图像去噪：采用滤波方法降低噪声水平并避免模糊，操作如下。
	<ol>
		<li>单击文件 选项卡，使用打开数据选择待处理的图像。打开的图像将显示在屏幕左上角的项目视图窗口中。</li>
		<li>右键单击，选择图像处理，然后选择滤波沙盒。单击创建。</li>
		<li>在属性窗口（位于屏幕左下角）中执行以下操作：选择数据 作为预览类型；从“滤波器”旁边的下拉菜单中选择滤波器类型；选择3D 作为解释模式；从“核类型”旁边的下拉菜单中选择可分离；在各自对应的空白框中填写标准差和核大小因子的数值；从“输出”旁边的下拉菜单中选择与输入相同；单击应用。 
		注：滤波器类型（可选类型包括双边、方框、高斯、中值、递归指数、轮廓提取、各向异性扩散、非局部均值、非锐化掩模和FFT滤波器）及参数的选择取决于扫描图像的噪声水平和体素大小。对于高斯滤波器，核大小因子通常使用3 × 3 × 3和5 × 5 × 5，标准差通常使用0.5–2.08。本研究中采用了高斯滤波器，核大小因子和标准差分别设置为5 × 5 × 5和0.8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像重对齐 
	注：此为可选步骤。在扫描过程中，若长骨样本相对于成像系统的坐标轴发生错位，可采用数字对齐方法校正错位（图2C）。
	<ol>
		<li>创建样本的三维渲染图像，操作如下：在项目视图窗口中选择步骤3.3生成的已滤波且已裁剪的图像。右键单击，从下拉菜单中选择显示 ，然后选择体绘制，再单击创建。在矢状面和冠状面中目视检查三维渲染图像。</li>
		<li>手动旋转渲染体积，使纵向轴对齐良好。对旋转后的图像应用变换，操作如下：在属性窗口中单击变换编辑器，进入变换编辑器-操作器，从下拉菜单中选择变换器 。此时可对样本进行旋转和重新对齐。完成重对齐后，再次单击变换编辑器以锁定图像。</li>
		<li>对滤波后的图像（步骤3.3生成）进行重采样，以生成新的横断面（轴向）图像切片，操作如下：在项目视图窗口中选择步骤3.4.2生成的图像。右键单击，从下拉菜单中选择几何变换，然后选择重采样变换图像，再单击创建。在属性窗口中，进入数据 部分并执行以下操作：插值方式选择下拉菜单中的标准 ；模式选择扩展；保留选项选择体素大小；在“填充值”对应的空白框中输入0。然后单击应用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定义感兴趣体积（VOI）
	<ol>
		<li>浏览横断面图像切片，确定骨折骨痂的中心层面。根据骨痂的近端和远端定义VOI。当骨痂端点难以界定时，可根据距骨痂中心层面标准化的距离来定义VOI（图2D）。 
		注：在骨重塑阶段之前的愈合期，由于新生编织骨的小梁结构与原始骨的皮质结构明显不同，因此矿化骨痂边缘较易界定。然而，当进入重塑阶段后，新生骨逐渐获得皮质结构，因此界定骨痂边缘变得越来越具挑战性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="骨成像分析；CT扫描切片；显示三维重建与对齐过程的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64262/64262fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：图像分割。（A）一幅显示单次扫描中六个样本的图像。（B）图像裁剪以分离各个样本。（C）数字对齐以校正偏离的纵向轴（黄色虚线）。（D）定义感兴趣体积（VOI）及骨痂中心平面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64262/64262fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
4. 图像分析
<ol>
	<li>骨痂与皮质骨的分割
	<ol>
		<li>使用分割套索工具，结合自动追踪和边缘追踪功能，半自动勾勒出愈伤组织的外边界图3A如下所示：
		<ol>
			<li>图像重组完成后（步骤 3.4.3），单击 分割 在屏幕顶部的第二行标签中，点击相应标签。在分割编辑器窗口中，从“图像”旁边的下拉菜单中选择一幅已变换的图像（在步骤 3.4.3 中创建）。</li>
			<li>在“材料”窗口中，双击 添加；执行此操作后，将出现名为 material3 和 material4 的两个标签页。右键单击，将 material3 重命名为 callus，将 material4 重命名为 cortical bone。</li>
			<li>在“选择”窗口中，单击套索图标；从出现的选项中选择 徒手操作 对于2D模式， 内部 3D 模式，以及两者 自动追踪 和 追踪边缘 选择选项。使用套索工具标记感兴趣区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在VOI范围内选取多个切片，重复此勾画步骤图3B）。可将轮廓切片间隔一定距离排列（例如，间隔20个切片）。 
		注意：在具有复杂愈伤组织结构的区域，用户可考虑减小轮廓切片之间的间距，以捕获更多片段图 3A，B).</li>
		<li>对轮廓化的骨痂轮廓进行插值，以生成完整的骨痂标签（图 3C，D）操作如下：在“材料”窗口中，选择愈伤组织文件（于步骤4.1.1.2中创建），单击 选择 屏幕顶部的标签，然后选择 插值 从下拉菜单中选择。在“选择”窗口中，点击 加号.</li>
		<li>打开 皮质骨 在步骤 4.1.1.2 中创建的文件。按照步骤 4.1.1 和 4.1.2 中对骨痂的处理方法，对皮质骨（包括骨髓腔）进行分割。图 4A，B）。参照步骤 4.1.3 中对骨痂的处理方法，对轮廓化的骨膜皮质进行插值，以创建皮质骨标签（图4C，D).</li>
		<li>按如下步骤计算骨痂的轮廓体积和平均灰度值：点击 分割 屏幕顶部一行的标签并选择 材料统计学 从下拉菜单中选择。这将生成一个包含所有计算值的表格，其中皮质骨和骨痂（扣除皮质骨后）的数值将分别列出。表格生成后，点击 导出到工作区 以保存数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灰度单位转换为骨密度
	<ol>
		<li>裁剪4.5 mm HA模体的3D图像（图2B) 从整张图像中选取并单击 分割. HA 模体的树脂中包含五个小型 HA 圆柱体（图1A）。对于密度最高的 HA 圆柱体，通过视觉检查确定其第一层和最后一层切片。</li>
		<li>使用画笔工具在第一张和最后一张切片上（避开边缘）绘制两个圆圈图 5A）如下所述：在“材料”窗口中，点击 添加 四次。右键单击，将 material3、material4、material5 和 material6 分别重命名为 phantom1、phantom2、phantom3 和 phantom4。选择 幻影1单击“选择”窗口中的画笔图标，并使用滑块根据模体的大小调整画笔尺寸（圆形描迹），使圆的直径小于模体的尺寸。</li>
		<li>在两个圆之间应用插值，以生成每个 HA 圆柱体的体积图5B）如下所述：在“材料”窗口中，选择 Phantom1，点击 选择 屏幕顶部一行的标签，从下拉菜单中选择插值。在“选择”窗口中，单击 加号.</li>
		<li>对剩余的三个HA圆柱体重复分割过程，顺序从第二高的HA密度开始，到第二低的HA密度结束（图 5B). 可排除HA密度最低的圆柱体，因其通常难以分割。</li>
		<li>使用生成的三维标签计算所分析的四个 HA 圆柱体的平均灰度值。使用电子表格（参见 材料表）或类似设备，绘制模体制造商提供的平均灰度值与相应的骨密度（BMD）值。利用线性回归生成BMD与灰度值之间的相关性方程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>矿化骨痂的分割及骨密度（BMD）计算
	<ol>
		<li>根据步骤 4.2.5 中生成的相关方程以及用于区分矿化和未矿化骨痂的选定阈值，确定相应的灰度值阈值。据此，将灰度值高于该阈值的骨痂区域标记为矿化骨痂，其余部分标记为未矿化骨痂图6A，B在此项研究中，250 mgHA/ccm 被用作矿化骨痂的阈值14,15.</li>
		<li>计算总骨痂体积和矿化骨痂体积。根据这些数值，计算骨体积分数（矿化骨痂体积与总骨痂体积的比值，即 BV/TV）。利用测得的总骨痂平均灰度值，结合步骤 4.2.5 中建立的相关方程，计算骨痂的骨密度（BMD）。 
		注意：根据研究目的及所用分析软件，可计算其他参数，如结构模型指数（SMI）、小梁厚度和各向异性程度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="CT扫描分析；骨结构的3D模型；表示分割与重建的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64262/64262fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：骨痂外边界的分割。（A）骨痂外边界的轮廓（红线）。（B）在感兴趣体积（VOI）内采样切片上的轮廓（红片）。（C）通过插值得到的三维骨痂标签（红色体积）。（D）C中所示骨痂标签的横截面（包含皮质骨）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64262/64262fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示分割后三维结构的断层扫描分析示意图；数据可视化与分割结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64262/64262fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：皮质骨的分割。（A）皮质骨骨外膜表面的轮廓（绿色线条）。（B）在感兴趣体积（VOI）内采样切片处的轮廓（绿色切片）。（C）由骨外膜皮质骨和骨痂插值标签生成的皮质骨（包含骨髓腔；绿色）与骨痂（红色）的三维标签。（D）骨痂（红色）与皮质骨（包含髓腔；绿色）的横截面。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64262/64262fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="CT 扫描切片和三维模型示意图，展示使用成像软件工具的分割过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64262/64262fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：灰度单位转换为骨密度（BMD）。（A）第一层和最后一层切片中羟基磷灰石（HA）圆柱体的轮廓（红色圆圈）。（B）三维插值重建的 HA 圆柱体（左）及其横截面（右）。棕色：最高 HA 密度；蓝色：第二高 HA 密度；紫色：第三高 HA 密度；绿色：第四高 HA 密度。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64262/64262fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="骨愈合过程；三维CT扫描；矿化骨痂（蓝色），原始骨组织（绿色）；结构分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64262/64262fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：矿化骨痂的分割。（A）矿化骨痂（≥250 mgHA/ccm）以蓝色显示，其余骨痂部分（<250 mgHA/ccm）以红色显示，对应原始骨组织的空间以绿色显示。（B）各独立标签的三维视图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64262/64262fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtomographic+system+for+the+nondestructive+evaluation+of+bone+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture.</a> Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).</li>
<li>Müller, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+human+bone+biopsies%3A+a+quantitative+structural+comparison+of+histological+sections+and+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography.</a> Bone. 23 (1), 59-66 (1998).</li>
<li>Waarsing, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+and+tracking+local+changes+in+the+tibiae+of+individual+rats%3A+a+novel+method+to+analyse+longitudinal+in+vivo+micro-CT+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Detecting and tracking local changes in the tibiae of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data.</a> Bone. 34 (1), 163-169 (2004).</li>
<li>Boyd, S. K., Davison, P., Müller, R., Gasser, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+individual+morphological+changes+over+time+in+ovariectomized+rats+by+in+vivo+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Monitoring individual morphological changes over time in ovariectomized rats by in vivo micro-computed tomography.</a> Bone. 39 (4), 854-862 (2006).</li>
<li>Christiansen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+micro-computed+tomography+voxel+size+and+segmentation+method+on+trabecular+bone+microstructure+measures+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Reports%22%5BJournal%5D)">Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice.</a> Bone Reports. 5, 136-140 (2016).</li>
<li>Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+in+small+animal+and+specimen+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Micro-CT in small animal and specimen imaging.</a> Trends in Biotechnology. 20 (8), 34-39 (2002).</li>
<li>Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+micro-CT+in+small+animal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Application of micro-CT in small animal imaging.</a> Methods. 50 (1), 2-13 (2010).</li>
<li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li>
<li>Morgan, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+assessment+of+fracture+healing%3A+Relationships+among+callus+structure%2C+composition%2C+and+mechanical+function%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical function.</a> Bone. 44 (2), 335-344 (2009).</li>
<li>O'Neill, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).</li>
<li>Bissinger, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+segmentation+of+callus+by+micro-CT+compared+to+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Fully automated segmentation of callus by micro-CT compared to biomechanics.</a> Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 108(2017).</li>
<li>Brown, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fracture+healing+and+increased+callus+adiposity+in+a+C57BL%2F6J+murine+model+of+obesity-associated+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Delayed fracture healing and increased callus adiposity in a C57BL/6J murine model of obesity-associated type 2 diabetes mellitus.</a> PLOS One. 9 (6), 99656(2014).</li>
<li>Khajuria, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+structure+of+fibrillar+collagen+and+elevated+levels+of+advanced+glycation+end+products+typify+delayed+fracture+healing+in+the+diet-induced+obesity+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Aberrant structure of fibrillar collagen and elevated levels of advanced glycation end products typify delayed fracture healing in the diet-induced obesity mouse model.</a> Bone. 137, 115436(2020).</li>
<li>Sigurdsen, U., Reikeras, O., Hoiseth, A., Utvag, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+between+strength+and+quantitative+computed+tomography+measurement+of+callus+mineralization+in+experimental+tibial+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Correlations between strength and quantitative computed tomography measurement of callus mineralization in experimental tibial fractures.</a> Clinical Biomechanics. 26 (1), 95-100 (2011).</li>
<li>Duvall, C. L., Taylor, W. R., Weiss, D., Wojtowicz, A. M., Guldberg, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+angiogenesis%2C+early+callus+formation%2C+and+late+stage+remodeling+in+fracture+healing+of+osteopontin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Impaired angiogenesis, early callus formation, and late stage remodeling in fracture healing of osteopontin-deficient mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 22 (2), 286-297 (2007).</li>
<li>Gerstenfeld, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+effects+of+the+bisphosphonate+alendronate+versus+the+RANKL+inhibitor+denosumab+on+murine+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of effects of the bisphosphonate alendronate versus the RANKL inhibitor denosumab on murine fracture healing.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 196-208 (2009).</li>
<li>Alentado, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+the+modified+radiographic+union+score+for+tibia+fractures+%28mRUST%29+in+murine+femoral+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Validation of the modified radiographic union score for tibia fractures (mRUST) in murine femoral fractures.</a> Frontiers in Endocrinology. 13, 911058(2022).</li>
<li>Yu, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+impaired+MRSA-infected+fracture+healing+by+combinatorial+antibiotics+and+modulation+of+sustained+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Enhancement of impaired MRSA-infected fracture healing by combinatorial antibiotics and modulation of sustained inflammation.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 37 (1), 1352-1365 (2022).</li>
<li>Nyman, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measures+of+femoral+fracture+repair+in+rats+derived+by+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Quantitative measures of femoral fracture repair in rats derived by micro-computed tomography.</a> Journal of Biomechanics. 42 (7), 891-897 (2009).</li>
<li>Fiset, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+validation+of+the+radiographic+union+score+for+tibial+fractures+%28RUST%29+using+micro-computed+tomography+scanning+and+biomechanical+testing+in+an+in-vivo+rat+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Bone+and+Joint+Surgery%22%5BJournal%5D)">Experimental validation of the radiographic union score for tibial fractures (RUST) using micro-computed tomography scanning and biomechanical testing in an in-vivo rat model.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery. 100 (21), 1871-1878 (2018).</li>
<li>Shefelbine, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+fracture+callus+mechanical+properties+using+micro-CT+images+and+voxel-based+finite+element+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis.</a> Bone. 36 (3), 480-488 (2005).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-induced+delayed+fracture+healing+and+impaired+bone+biomechanical+properties+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Interventions+in+Aging%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-induced delayed fracture healing and impaired bone biomechanical properties in mice.</a> Clinical Interventions in Aging. 13, 1465-1474 (2018).</li>
<li>Watson, P. J., Fitton, L. C., Meloro, C., Fagan, M. J., Gröning, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+adaptation+of+trabecular+bone+morphology+in+the+mammalian+mandible%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanical adaptation of trabecular bone morphology in the mammalian mandible.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7277(2018).</li>
<li>Nie, C., Wang, Z., Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+depression+on+fracture+healing+and+osteoblast+differentiation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatric+Disease+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 1705-1713 (2018).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本研究旨在描述一种用于µCT分析的详细方案，目标是对三维矿化骨痂结构进行准确定量，这在骨组织及骨折愈合研究中通常具有基础性意义。该方案采用一种通用的、先进的三维图像分析软件平台，可实现从简单到复杂的图像可视化、分割/标记及各类测量。
该方案中最耗时的步骤是骨痂的半自动分割，需排除皮质骨和骨髓腔区域。许多先前的研究也已排除了该区域9,16,17,18。一些研究在其分析中包含了原始皮质骨和骨髓腔区域19,21，而其他研究中该方法并不明确。包含原始皮质骨可避免对粉碎性骨折皮质骨区域进行轮廓勾画的困难和潜在的主观性，但会高估骨痂矿化程度的测量值。
该方案重点关注获取...

微型计算机断层扫描（µCT）成像已广泛应用于临床前骨研究，可提供无创、高分辨率的图像，用于评估骨的微结构1,2,3,4,5。µCT通过旋转样品，或使用旋转的X射线源和探测器，获取大量X射线图像，并利用算法重建为一系列图像切片形式的三维体数据。临床CT是人体骨骼三维成像的金标准，而µCT是评估实验动物骨愈合效率的常用技术1,2,3,4,6,7。矿化骨组织对X射线具有良好的对比度，而软组织在未使用对比剂的情况下对比度相对较低。在骨折愈合评估中，µCT可生成提供矿化骨痂三维结构和密度详细信息的图像。体内 µCT扫描还可用于骨折愈合过程的纵向、时间序列评估。
采用µCT对完整皮质骨和松质骨进行定量分析的方法已较为成熟且标准化8。尽管临床前研究中存在多种用于分析骨折愈合的定量方法9,10,11，但目前尚未发表针对骨痂定量的µCT图像分析详细操作流程。因此，本研究旨在提供一套详细的µCT成像及骨愈合骨痂分析的逐步操作方案。

<table><tbody><tr><td>10%中性缓冲福尔马林&amp;nbsp;</td><td>Fisher chemical</td><td>SF100-20</td><td>用于骨组织固定</td></tr><tr><td>Avizo</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>图像处理与分析软件</td></tr><tr><td>羟基磷灰石体模&amp;nbsp;</td><td>Micro-CT HA D4.5, QRM</td><td>QRM-70128</td><td></td></tr><tr><td>图像处理语言</td><td>Scanco</td><td></td><td>用于将原始图像转换为DICOM图像</td></tr><tr><td>微型直蚊式止血钳</td><td>Medline</td><td></td><td>用于取出髓内针&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>电子表格软件</td></tr><tr><td>Scanco mCT系统（vivaCT 40）</td><td>Scanco</td><td></td><td>用于&amp;micro;CT成像&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

利用微型计算机断层扫描评估骨骨折愈合

Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography

微型计算机断层扫描（µCT）是转化科学研究中用于表征骨折愈合过程中骨组织及新生骨三维（3D）形态最常用的成像方式。啮齿类动物长骨骨折愈合的研究通常涉及继发性愈合以及矿化性骨痂的形成。不同时间点和不同处理条件下，所形成的骨痂形态及其新生骨密度可能存在显著差异。尽管目前已有广泛使用且集成于商业软件中的标准方法用于定量完整皮质骨和小梁骨的参数，但针对愈合骨痂分析的操作流程尚缺乏统一共识。本研究旨在描述一种标准化的定量分析方案，用于测定愈合骨痂中的骨体积分数和骨痂矿化密度。该方案详细说明了成像与分析过程中应考虑的各项参数，包括成像时样本的对齐方式、感兴趣区域的大小，以及用于界定骨痂轮廓的切片数量。

为监测骨折愈合过程中的骨形成，对成年雄性C57BL/6J小鼠建立胫骨中段开放性骨折模型。采用髓内钉固定骨折，该模型为继发性愈合的既定模型。13在骨折后第14、21和28天采集愈伤组织12. 这些时间点代表了愈合过程的不同阶段。继发性骨愈合过程中的软骨内成骨进行如下 通过 纤维软骨（软性）骨痂的初期形成，随后在后期阶段发生矿化，以减少骨折间隙的微动，从而促进新生血管跨越骨折线的形成13在本研究采用的小鼠骨折模型中，骨折后第14天代表矿化软性骨痂阶段。随着愈合进程从第14天进展至第21天，矿化软性骨痂被新形成的编织骨完全替代，从而实现骨折间隙的骨性桥接13在第21至28天之间，骨痂经历吸收和重塑过程，以重建皮质骨的特征性结构12.
采用上述方案在三个时间点获取并分析了µCT图像，每个时间点至少分析10个样本。针对每个样本，计算骨体积...

微型计算机断层扫描（µCT）是一种非破坏性成像工具，在临床前研究中对评估骨结构具有重要作用，然而目前在分析骨愈合骨痂的µCT操作流程方面尚缺乏统一共识。本研究提供了一套逐步实施的µCT实验方案，可用于监测骨折愈合过程。

微型计算机断层扫描（µCT）是最常用的成像方法，用于表征骨组织及新生骨的三维（3D）形态……

Micro-CT 是一种用于量化骨组织三维形态和质量的常用方法。尽管针对完整皮质骨和松质骨的分析方案已相对成熟，但在骨折愈合分析的标准化流程方面仍缺乏共识。该技术包括无创成像以及结合手动与自动化方法、经过准确校准的三维分析。它还使用了一个复杂且灵活的软件环境。演示该操作过程的是来自我实验室的研究助理 Hwabok Wee。首先，取一个定制开发的3D打印扫描夹具或类似装置，其中包含用于骨密度校准的微型羟基磷灰石模体。将最多六根长骨样本放入固定装置中，以实现多个样本的同时扫描。将准备好的固定装置置于注射器或锥形管中，其尺寸应与扫描视野的直径相近。向注射器中加入防腐液（如生理盐水），以防止样本在扫描过程中干燥。确认显微CT设备校准后，将样品夹具的中心线与显微CT的近似中心线对齐，以确保样品位于成像视野范围内，且其长轴方向与所得图像的轴向基本一致。接下来，设置显微CT系统的扫描参数：能量或强度设为55千伏峰值，电流设为145微安，各向同性体素大小设为10.5微米，积分时间设为300毫秒。然后从不同视角目视检查定位图像，确保覆盖所有骨痂样品的完整体积。启动扫描采集，完成后将图像转换为 DICOM 序列，以便导入分析软件。开始图像裁剪时，每次选择一个样本，对每个图像序列进行裁剪，确保裁剪后的体积包含整个样本。单击屏幕左上角的“文件”选项卡，选择“另存项目为”，然后选择“最小化项目大小”，以保存裁剪后的图像。为了对图像进行去噪，单击文件选项卡，使用“打开数据”选择要处理的图像，该操作会将图像打开在屏幕左上角的项目视图窗口中。右键单击以选择图像处理，接着选择滤波沙盒，然后单击创建。在屏幕左下角的属性窗口中，选择数据作为预览类型。在“滤波器”旁边的下拉菜单中选择滤波器类型，并选择 3D 以进行解释。在下拉菜单中保持“可分离”作为核类型，在可用的空白框中填入标准差和核大小因子的值。然后在输出旁边的下拉菜单中选择“与输入相同”。最后，点击“Apply”。对于未对齐的样本，用户可通过在“Project View”窗口中选择经过滤波和裁剪的图像，生成样本的三维渲染图像，从而进行图像重新对齐。右键单击，从下拉菜单中选择“Display”，然后选择“Volume Rendering”。然后点击“创建”，在矢状面和冠状面中直观检查三维渲染图像。接着手动旋转渲染的体积，以获得沿长轴的良好对齐。要在旋转后的图像中应用变换，在“属性”窗口中，点击“变换编辑器”。然后转到变换编辑器操作工具，从下拉菜单中选择变换器。如有需要，进行旋转、重新对齐，然后再次单击变换编辑器以锁定图像。接下来，要创建新的横断面图像切片，请在项目视图窗口中选择图像，对滤波后的图像进行重采样。右键单击以选择几何变换，然后从下拉菜单中选择重采样变换后的图像，再单击创建。在属性窗口中，转到数据选项，从下拉菜单中选择插值方法为标准，模式选择扩展，保留选项选择体素大小。在填充值的空白框中输入零，最后单击应用。为确定感兴趣区域的体积，需浏览横断面图像切片，识别骨折愈合组织（骨痂）的中心平面，并根据骨痂近端和远端的边界来定义该体积。若骨痂末端难以明确界定，可依据距骨痂中心平面标准化距离来定义体积。在完成图像变换与重组后，如需分割骨痂的外边界，请点击屏幕顶部第二行选项卡中的“Segmentation”（分割）选项卡。在分割编辑器窗口中，从图像旁边的下拉菜单中选择已转换的图像。在“MATERIALS”窗口中，双击“Add”。执行此操作后，将出现两个名为 Material3 和 Material4 的标签页。右键单击，将 Material3 重命名为愈伤组织，将 Material4 重命名为皮质骨。接下来，在“选择”窗口中，单击套索图标。在出现的选项中，选择 2D 模式下的“手绘”，3D 模式下的“内部”，并同时勾选“自动追踪”和“追踪边缘”选项。然后使用套索工具标记愈伤组织的外边界。对感兴趣区域内的切片重复上述轮廓绘制步骤，切片之间可以间隔一定数量的切片，例如每隔20个切片进行一次。要创建完整的愈伤组织标签，在“MATERIALS”窗口中选择愈伤组织文件，点击屏幕顶部的“Selection”选项卡，然后从下拉菜单中选择“Interpolate”。然后，在“选择”窗口中，单击加号。接下来，对皮质骨进行分割，包括骨髓腔。随后，对轮廓化的骨膜皮质表面进行插值，以生成皮质骨标签，操作方法与之前生成骨痂标签的方法相同。为计算骨痂的轮廓体积和平均灰度值，点击屏幕顶部一行的“分割”选项卡，从下拉菜单中选择“材料统计”，以生成计算值表格。注意，在减去皮质骨后，皮质骨和骨痂的数值将分别提供。点击“导出到工作区”导出生成的表格并保存数据。为了将灰度单位转换为骨密度，从整幅图像中裁剪出4.5毫米羟基磷灰石（HA）体模的3D图像，然后点击“分割”（Segmentation）。在第一个和最后一个切片上绘制圆形：在“材料”（MATERIALS）窗口中，点击“添加”四次，然后右键依次将Material3、4、5和6重命名为Phantom1、2、3和4。接下来，选择 Phantom1。在“选择”窗口中点击画笔图标，并使用滑块调整画笔大小，使圆圈的尺寸小于模体的尺寸。为了为每个羟基磷灰石（HA）圆柱体创建体积，在“材料”（MATERIALS）窗口中选择 Phantom1，点击屏幕顶部的“选择”选项卡，然后从下拉菜单中选择“插值”（Interpolate）以进行插值操作。然后，在“选择”窗口中点击加号。对剩余的HA圆柱体重复此过程。利用生成的三维标签计算所分析的四个HA圆柱体的平均灰度值。绘制模体制造商提供的平均灰度值及其对应的骨矿物质密度（BMD）值。使用线性回归生成BMD与灰度值之间的相关性方程。为分割矿化骨痂，请在“材料”（MATERIALS）窗口中点击“添加”（Add）。然后右键单击，将新材料重命名为“愈伤组织矿化”。接下来，在“材料”窗口中选择“愈伤组织”，然后点击“选择”。随后在“选择”窗口中点击“阈值”。在阈值掩膜中选择较低的值，并应用从HA模体计算得到的阈值。然后在“选择”（SELECTION）窗口中点击“仅选择当前材料”（Select only current material），接着点击“选择被掩膜的体素”（Select Masked Voxels）。随后在“材料”（MATERIALS）窗口中选择骨痂矿化（callus mineralized），并在“选择”（SELECTION）窗口中点击加号。最后，点击 MATERIALS 窗口中骨痂矿化的 3D 按钮。在三个时间点分析的显微CT图像显示，第14天时矿化骨痂已显著形成。随着修复进程从第14天推进至第21天和第28天，骨体积分数和骨矿物密度逐步增加，与骨折间隙的骨性连接一致。与预期一致，在第21天至第28天期间，骨痂发生吸收或重塑，表现为骨痂总体积减少。在第28天时，骨痂的皮质连接比此前任何时间点都更为明显。对于复杂骨折，我们建议通过逐层滚动查看所有图像切片（有时需在不同平面上）仔细检查半自动分割结果，并在必要时调整轮廓。一旦准确分割出骨折愈合组织，除了本方案中报告的参数外，还可通过附加脚本计算其他结果参数，例如惯性矩和连接密度。

assessment-of-bone-fracture-healing-using-micro-computed-tomography

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用显微计算机断层扫描评估骨折愈合

对骨折愈合过程中骨祖细胞功能进行定量测量，需要高分辨率的连续成像技术。本文提供了利用活体显微镜结合成骨谱系示踪技术，对内源性成骨干细胞/祖细胞在修复骨骨折过程中的迁移、增殖和分化进行连续成像与定量分析的实验方案。...

依次 体内 骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

在骨科植入物感染的小鼠模型中，结合光学成像与显微计算机断层扫描（μCT）成像，并利用一种经基因工程改造的发光葡萄球菌（Staphylococcus...

结合 体内 光学成像与 µCT 成像以监测小鼠骨科植入物感染中的感染、炎症及骨解剖结构

自体和同种异体骨移植是治疗严重颅面骨缺损的公认方法。然而，移植物成分对血管新生、细胞分化与骨形成之间相互作用的影响尚不明确。本文介绍一种多模态成像方案，旨在阐明移植物邻近区域血管生成与成骨作用之间的相互依赖关系。...

利用计算机断层扫描和光学成像技术研究颅骨自体移植与异体移植中成骨-血管生成偶联以评估骨整合

在软骨内骨愈合过程中，评估骨折愈合组织中组织发育情况对于监测愈合进程至关重要。本文报道了一种适用于小鼠股骨的磁共振成像（MRI）兼容外固定装置，可在小鼠骨再生过程中实现MRI扫描。...

体内评估小鼠股骨骨折愈合过程中骨痂发育：采用一种适用于小鼠股骨的磁共振成像兼容骨固定装置

本方案描述了一种使用髓内螺钉进行股骨骨折标准化固定的微创接骨技术，可用于分析小鼠的软骨内成骨愈合过程。...

一种在标准化生物力学条件下分析小鼠软骨内骨折愈合的微创模型

小鼠闭合性股骨骨折模型是研究骨折愈合及加速骨再生新型治疗策略的有力平台。本手术方案的目标是通过使用髓内钢针固定股骨，在小鼠体内建立单侧闭合性股骨骨折。...

小鼠闭合性股骨骨折的建立：一种用于研究骨愈合的模型

本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。...

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在CCL5诱导下的迁移

该方案通过结合大体积显微CT扫描、定制压缩载台以及先进的图像处理工具，实现了对整个人类股骨近端骨微结构变形及其韧性的测量。...

人体髋关节微结构失效机制的成像研究

本方案通过结合苏木精-伊红（HE）染色与显微计算机断层扫描（Micro-CT）技术，提出了一种在骨质疏松小鼠模型中对骨微结构进行定量评估的经济且高效的方法。...

骨质疏松小鼠模型中骨小梁微结构的评估

我们提出一种用于分析纵向研究中用户自定义感兴趣区域（ROI）的方法 体内...

针对大段骨缺损中用户自定义感兴趣区域的纵向显微计算机断层成像分析

我们提出了一种在多个层次水平上评估骨再生的实验方案。该多模态方法能够实现跨不同长度尺度的结构分析，有效解决了样本制备中的挑战，并为评价生物材料促进骨再生的效果提供了可靠的分析流程。...

评估骨再生与支架性能的多模态方法

学习使用显微计算机断层扫描技术评估骨折愈合的标准化方案。本研究提供详细的μCT成像步骤，包括样本制备、图像采集、三维重建和骨痂体积分析，为临床前骨愈合研究提供可靠的定量评估方法。

利用微型计算机断层扫描评估骨骨折愈合

探索更多视频