大豆共生根瘤中多聚核糖体的纯化

本方案具有重要意义，因为据我们所知，这是首个描述基于离心技术从大豆共生根瘤中进行动力学多聚核糖体纯化的方法。该技术的主要优势在于，结合RNA-Seq，可实现对复杂组织（如共生根瘤）中基因表达关系及其调控机制的研究。实验开始时，称取约0.2克完整根瘤置于称量皿中，并将其转移至预冷的2毫升离心管中。

然后加入 1.2 毫升多聚核糖体提取缓冲液，让样品解冻两分钟，并使用组织研磨器充分研磨，直至根瘤完全破碎并均质化。接着将样品置于冰上，轻轻振荡孵育 10 分钟，或直至所有样品处理完毕，然后在 4°C 条件下以 16,000 × g 离心 15 分钟，使细胞碎片沉淀。随后收集上清液，并重复一次离心步骤。

在仔细回收澄清的胞质提取物后，取200微升等分试样转移至洁净的1.5毫升微量离心管中，用于总分离。然后，将4.5毫升33.5%蔗糖层倒入离心管中，并使用P-1000微量移液器小心缓慢地加入4.5毫升12%蔗糖层。接着，将离心管置于冰上，直至加入澄清的胞质提取物。

用移液器将1毫升澄清的胞质提取物小心地沿离心管管壁加至蔗糖垫上方。然后将超速离心管转移至预冷的转子桶中，在4°C条件下以217,874 ×g离心2小时。弃去残留的胞质提取物和蔗糖垫后，用200微升预冷的重悬缓冲液重悬多聚核糖体沉淀。

接下来，将多聚核糖体重悬液置于冰上孵育30分钟，然后转移至预冷的1.5毫升离心管中，以进行RNA提取。加入750 µL RNA提取试剂匀浆样品后，在室温下孵育5分钟。随后加入200 µL预冷的氯仿，剧烈振荡离心管15秒。

接下来，在室温下孵育10分钟。在4摄氏度下以12,000 × g离心15分钟以进行相分离，然后将上层水相500微升转移至洁净离心管中，注意不要扰动下方的粉红色有机相。随后加入375微升预冷的异丙醇和0.5微升无RNase的糖原。

随后，通过上下吹打充分混匀。在4 °C条件下孵育10分钟，然后在12,000 ×g下离心15分钟。弃去上清液，用1 mL冰冷的75%乙醇洗涤RNA沉淀。

短暂涡旋混匀。随后，在4 °C条件下以7,500 ×g离心5分钟。弃去上清液，并将RNA沉淀在空气中干燥。

然后，将沉淀溶解于50 µL无RNA酶的水中，在65 °C下孵育5分钟。使用高灵敏度毛细管电泳和/或2%无RNA酶琼脂糖凝胶电泳评估RNA的浓度和完整性。估算样品体积后，加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠、3倍体积的冷乙醇以及0.5 µL无RNA酶的糖原。

然后充分混匀。对多个总RNA及多聚核糖体相关RNA样品组分进行毛细管电泳分析，结果显示清晰的核糖体RNA条带，无任何拖尾现象。然而，这一结果并未体现在RIN值上，因为RIN值介于5.9至7.5之间，属于非完整RNA样品的范围。

生物分析仪未能识别出电泳图谱中的18S和25S峰，该现象在总RNA和多聚核糖体相关RNA样本中均存在。样本在外观上无明显降解迹象。然而，为进行对比，另分析了一个几乎完全降解的样本以展示其结果。

最重要的是在整个实验过程中保持核糖体多聚体（polysome）和RNA的保存条件。在对总RNA和多聚核糖体相关RNA（par RNA）组分进行测序后，可利用所分析基因表达的标准模式，鉴定转录水平和翻译水平上差异表达的基因。