转染合成mRNA后肿瘤细胞迁移与侵袭的实时定量检测

本方案表明，将感觉信使RNA转染与基于阻抗的细胞迁移和侵袭实时检测相结合，有助于鉴定能够促进肿瘤细胞迁移和侵袭的基因。基于阻抗的实时细胞分析系统可对基因表达变化条件下肿瘤细胞的迁移进行定量、连续和全面的监测。在肿瘤中过表达并促进肿瘤细胞迁移的基因可被识别为癌症治疗中抑制转移的潜在靶点。

首先，在微量离心管中加入 10 微升 10x 反应缓冲液、1.5 微升 PNE one 和 10 微克质粒 DNA，以用限制性内切酶线性化质粒 DNA。加入无核酸酶水，使反应体系总体积达到 100 微升。轻轻敲击混匀后短暂离心，然后将反应混合物在 37 摄氏度孵育过夜。

再次离心后，在反应混合物中加入5 µL 10% SDS和1 µL浓度为20 mg/mL的RNA级蛋白酶K，混匀后再次离心。在50 °C孵育30分钟后，取2 µL 10×转录缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP和T7，以及1 µg线性化DNA，加入微量离心管中，用于T7 RNA聚合酶介导的RNA合成。加入无核酸酶水，使反应体系总体积达到20 µL。

离心沉淀后，在37摄氏度下孵育反应混合物2小时以进行RNA合成。接着再次离心，加入1微升DNA酶，混匀后在37摄氏度下孵育15分钟，以去除模板DNA。通过向反应混合物中加入10微升7.5摩尔的氯化锂，开始RNA的氯化锂沉淀步骤。

轻弹并离心后，将反应混合物在负20摄氏度下孵育30分钟。进行加帽时，将RNA样本在65摄氏度下加热10分钟，然后置于冰上冷却。接着，加入加帽反应组分，并通过轻弹混匀。

离心反应混合物，并在37摄氏度下孵育1小时。进行poly-A加尾时，离心样品后加入poly-A加尾反应组分，轻轻振荡，离心，然后在37摄氏度下孵育反应混合物2小时。

为了沉淀和定量合成的mRNA，加入50微升7.5摩尔的氯化锂，并进行氯化锂沉淀。从冷冻箱中取出一份ECM凝胶原液，保持在冰上。通过在微量离心管中将990微升DMEM与10微升ECM凝胶混合，将10毫克/升的ECM凝胶稀释至工作浓度。

通过轻柔吹打混匀。向CIM板上室的每个孔中加入60 µL稀释后的ECM凝胶。将CIM板上室（不加盖）置于二氧化碳培养箱内塑料保护膜上，孵育约4小时，以形成凝胶层。

进行电穿孔时，向每管肿瘤细胞悬液中加入1毫升DPBS。轻弹细胞悬液，以每次10秒的速度离心沉淀三次。使用微量移液器吸除上清液。

加入110微升重悬缓冲液R至细胞沉淀中，以获得每10微升含0.1百万个细胞的悬液。向细胞沉淀中加入合成mRNA，使其终浓度为0.2至20纳克/微升，具体浓度根据所需表达水平而定。轻轻敲击管壁，混匀并轻柔地重悬细胞沉淀。

接下来，使用电穿孔系统对10微升细胞悬液进行电穿孔处理，参数设置为1,350伏、10毫秒，每次施加三个脉冲。操作完成后，将电穿孔处理后的细胞转移至新的微量离心管中，加入含有0.5% FBS的1.1毫升DMEM培养基。通过双击实时细胞分析软件图标，打开分析程序。

打开默认实验模式设置选项后，选择分别运行三个实验的选项。通过单击数字标签打开每个支架，然后单击实验记录标签。

选择文件夹并输入实验名称以保存数据。单击布局选项卡，每次选择四个孔，为每种处理条件设置四复孔。输入样品信息，然后单击应用。

单击“计划”选项卡，然后添加一个步骤以设置细胞阻抗测量的两步模式。接着，单击“应用”以设置第一步。再次单击“添加步骤”，将间隔设为10分钟，迁移和侵袭持续时间设为48小时。

然后，单击“应用”以设置第二步。在进行细胞阻抗测量前一小时，向CIM板下室的各孔中加入160 µL含有10%血清或其他趋化因子的DMEM培养基。将上室（含ECM凝胶包被的孔用于侵袭实验，或未包被的孔用于迁移实验）与下室组装在一起。

对于细胞迁移实验，向CIM板上室的各孔中加入50微升低血清培养基。将CIM板和系统的支架放入CO2培养箱中。单击消息标签。

连接正常后，系统将显示消息，此时CIM板即可用于实验。在进行实时细胞分析之前，将组装好的CIM板置于二氧化碳培养箱中预孵育30至60分钟，以使CIM板适应培养条件。进行基线读数时，点击每个支架的“开始”按钮。

当“另存为”窗口出现时，将实验文件保存以进行基线读数。进行细胞接种时，将CIM板从支架上取出，并置于生物安全柜内的板架上。然后向CIM板上室的各孔中加入含有100,000个电穿孔细胞的100微升细胞悬液，并将CIM板置于生物安全柜中室温下静置30分钟。

将完全组装好的CIM板放回相应的支架中，以测量细胞阻抗。通过点击支架的启动按钮和绘图选项卡，开始第二步的细胞阻抗测量。然后点击“全部添加”按钮，并选中平均值和标准差复选框，以实时可视化数据。

用不同浓度的合成crack one mRNA对U 118 mg胶质母细胞瘤细胞进行电穿孔转染，结果显示转染后一天flag标签的crack one蛋白表达量呈浓度依赖性增加。0.2和2纳克/微升mRNA导致外源性crack one蛋白表达不可检测或仅有轻微表达。20纳克/微升mRNA的表达水平高于内源性crack one蛋白。

细胞迁移实验表明，使用0.2或每微升2纳克的crack one mRNA进行电穿孔对细胞迁移影响不大。然而，使用每微升20纳克的crack one mRNA进行电穿孔则显著促进了细胞迁移，在2至13小时之间有更多细胞发生迁移，表明胶质母细胞瘤的细胞迁移受到crack one蛋白水平升高的刺激。使用合成的crack L mRNA进行电穿孔后，转染一天即可观察到flag标签标记的crack L蛋白的强烈表达。

对照细胞的侵袭能力随着ECM蛋白浓度的增加而减慢。Crack L过表达细胞表现出依赖于ECM凝胶浓度的细胞侵袭能力下降。在不同ECM凝胶浓度下，对照细胞与Crack L过表达细胞的比较表明，Crack L过表达总体上促进了细胞通过ECM凝胶层的侵袭。

结果还表明，这两种细胞群体在不同时间点受到细胞外基质凝胶浓度增加的影响存在差异。在重悬的气泡R电穿孔过程中，细胞应快速、轻柔且完全地重悬，因为细胞在重悬的气泡R中长时间孵育会导致细胞状态不佳。可通过分离快速和慢速迁移的肿瘤细胞，以表征这两种细胞群体之间的差异。