Name: 合成mRNA转染后肿瘤细胞迁移和侵袭的实时定量测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-23T13:10:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学习利用合成mRNA转染结合阻抗实时测量技术定量分析肿瘤细胞迁移和侵袭行为。该方法可识别促进肿瘤转移的关键基因，为癌症治疗提供潜在靶点。

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作者感谢堪萨斯城儿童仁慈医院医学写作中心对本文稿的编辑。本工作由Natalie's A.R.T.基金会（资助T.P.）以及堪萨斯城儿童仁慈医院（CMH）与堪萨斯大学癌症中心（KUCC）联合提供的MCA合作伙伴咨询委员会资助（资助T.P.）。

1. mRNA 的合成
注意：进行 mRNA 合成时，所有试剂和设备在使用前必须经过特殊处理以灭活 RNase。有关本实验方案中使用的所有材料、仪器和试剂的详细信息，请参见材料表。
<ol>
	<li>DNA线性化 
	注意：如先前所述18,19，将小鼠CrkI和CrkL的cDNA克隆至pFLAG-CMV-5a表达载体中，以在C末端添加FLAG表位标签，并亚克隆至pcDNA3.1/myc-His载体中以引入T7启动子。
	<ol>
		<li>在微量离心管中加入10 µL 10x反应缓冲液、1.5 µL PmeI（10,000单位/mL）和10 µg质粒DNA，用限制性内切酶线性化质粒DNA。加入无核酸酶水，使反应体系总体积达到100 µL。</li>
		<li>轻弹混匀，短暂离心，于37 °C孵育过夜。</li>
		<li>短暂离心后，在反应体系中加入5 µL 10%十二烷基硫酸钠（SDS）和1 µL蛋白酶K（20 mg/mL，RNA级）。轻弹混匀，短暂离心，于50 °C孵育30分钟。</li>
		<li>在通风橱中，向质粒反应体系中加入100 µL酚:氯仿:异戊醇的下层相进行抽提。涡旋振荡，然后在室温下以18,800 × g离心5分钟。将上层相转移至新管中。</li>
		<li>使用氯仿:异戊醇（24:1）重复步骤1.1.4&#160;。</li>
		<li>在新管中加入200 µL无核酸酶水，使反应体系总体积达到300 µL，然后加入30 µL 3 M乙酸钠和600 µL 100%乙醇。</li>
		<li>涡旋混匀，置于−20 °C 30–60分钟，使DNA进行乙醇沉淀。</li>
		<li>在4 °C以18,800 × g离心20分钟，弃去上清液，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀。再次离心10分钟，然后彻底去除上清液。</li>
		<li>开盖干燥2分钟，加入30 µL无核酸酶水，重悬DNA沉淀。</li>
		<li>使用分光光度计测定DNA浓度。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳验证线性化DNA的大小和数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用T7 RNA聚合酶合成RNA
	<ol>
		<li>在微量离心管中加入各2 µL的10x转录缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP和T7，以及1 µg线性化DNA。加入无核酸酶水，使反应体系总体积达到20 µL。</li>
		<li>轻弹混匀，短暂离心，于37 °C孵育2小时以合成RNA。</li>
		<li>短暂离心后，加入1 µL DNase（2 U/µL），于37 °C孵育15分钟以去除模板DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA的氯化锂沉淀
	<ol>
		<li>向反应体系中加入10 µL氯化锂（7.5 M）。轻弹混匀，短暂离心，于−20 °C孵育30分钟。</li>
		<li>在4 °C以18,800 × g离心20分钟，弃去上清液，用500 µL 70%乙醇洗涤沉淀。再次离心10分钟，然后彻底去除上清液。</li>
		<li>开盖干燥2分钟，加入30 µL无核酸酶水，重悬RNA沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加帽反应
	<ol>
		<li>将RNA样品在65 °C加热10分钟，然后置于冰上冷却。</li>
		<li>加入各5 µL的10x加帽缓冲液、10 mM GTP和1 mM（10x）S-腺苷甲硫氨酸（SAM），各2 µL的加帽酶混合物和O-甲基转移酶混合物，以及1.25 µL RNase抑制剂。轻弹混匀，短暂离心，于37 °C孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加poly(A)尾
	<ol>
		<li>短暂离心样品，然后加入6 µL无核酸酶水、20 µL 5x E-PAP缓冲液、10 µL 25 mM MnCl2、10 µL 10 mM ATP和4 µL E-PAP poly(A)尾酶。轻弹混匀，短暂离心，于37 °C孵育2小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>合成mRNA的氯化锂沉淀与定量
	<ol>
		<li>加入50 µL氯化锂（7.5 M），按照步骤1.3.1–1.3.3所述进行氯化锂沉淀。</li>
		<li>使用分光光度计测定mRNA浓度。</li>
		<li>通过甲醛（1%–2%）琼脂糖（1%）凝胶电泳验证mRNA的大小和数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞侵袭和迁移（CIM）板的细胞外基质（ECM）凝胶包被
注意：细胞侵袭与迁移（CIM）板是一种商业化的16孔板，用于基于阻抗的实时细胞分析。对于细胞侵袭实验，按照先前所述方法并稍作修改，用ECM胶对CIM板进行包被11。
<ol>
	<li>从冷冻箱中取出一份ECM凝胶原液，并将其置于冰上保存。</li>
	<li>在微量离心管中，将990 µL无血清和抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）与10 µL ECM凝胶混合，将ECM凝胶（10 mg/mL）稀释至工作浓度（100 µg/mL）。通过轻柔吹打混匀。</li>
	<li>向CIM板上室的每个孔中加入60 µL稀释后的ECM凝胶。使用反向移液法操作，避免产生气泡20,21。 
	注意：针对不同细胞系，需优化ECM凝胶的浓度。对于胶质母细胞瘤细胞系，优化时使用的ECM凝胶浓度范围为0.1 µg/µL至1 µg/µL。</li>
	<li>将CIM板的上室（不加盖）放置于CO2培养箱内保护性塑料片上，孵育约4小时，以形成凝胶层。 
	&#8203;警告：在使用ECM凝胶包被CIM板过程中，CIM板上室的电极不应直接接触实验人员的手或任何设备表面，包括生物安全柜或CO2培养箱。</li>
</ol>
3. 肿瘤细胞的制备
注意：所有细胞培养材料必须保持无菌。在生物安全柜中，使用适当的个人防护装备（PPE），按照此前所述方法并结合部分修改，收获并进行肿瘤细胞电穿孔11。
<ol>
	<li>肿瘤细胞的培养
	<ol>
		<li>在37 °C、5% CO2培养箱中，将U-118MG细胞接种于含5%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的10 mL DMEM培养基中，每100 mm × 20 mm聚苯乙烯组织培养皿中培养（培养条件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤细胞的血清剥夺 
	注：在进行细胞迁移和侵袭实验前，需通过使用高浓度FBS最小化细胞对FBS中趋化因子的暴露。
	<ol>
		<li>弃去旧培养基，每皿加入10 mL预热的含0.5% FBS和1%抗生素的DMEM培养基（低血清培养基）。</li>
		<li>重复步骤3.2.1。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2培养箱中孵育细胞4小时或更长时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤细胞的收集
	<ol>
		<li>弃去旧培养基，每皿加入8 mL预热的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS），随后弃去DPBS，加入预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液（2 mL/皿），使其覆盖皿底表面，在CO2培养箱中孵育30秒。</li>
		<li>小心吸除胰蛋白酶-EDTA溶液，每皿加入7 mL低血清培养基，然后将细胞收集至50 mL或15 mL离心管中。</li>
		<li>取少量细胞悬液，使用手持式自动细胞计数仪进行细胞计数。</li>
		<li>计算细胞总数及配制10,000个细胞/µL所需的体积。</li>
		<li>在室温下以100 × g离心5分钟使细胞沉淀，吸除上清液，加入计算好的含0.5% FBS（不含抗生素）的DMEM培养基体积，轻轻重悬细胞沉淀。</li>
		<li>每种处理分别取含110万细胞的细胞悬液110 µL，转移至微量离心管中。</li>
		<li>重复步骤3.3.6，将细胞分装至四个微量离心管中，用于四种不同的处理。 
		&#8203;注：CIM板共有16个孔。设计四种不同处理以进行比较，每种处理分配CIM板上的四个孔。后续实验使用电穿孔后的细胞：Western blot分析（每35 mm组织培养皿0.3百万细胞）、实时细胞迁移实验四个孔（每孔0.1百万细胞）、实时细胞侵袭实验四个孔（每孔0.1百万细胞）。若实验设计有所更改，应相应调整需进行电穿孔的细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 肿瘤细胞的电穿孔
<ol>
	<li>为去除培养基，向每根离心管中的细胞悬液加入 1 mL DPBS，使用小型离心机每次离心 10 秒，共离心三次，每次间隔旋转离心管 180°，然后用移液器吸除上清液。 
	注意：应形成致密但易于重悬的细胞沉淀。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入 110 μL 重悬缓冲液 R，使每 10 μL 溶液中含有 0.1 × 10⁵ 个细胞。</li>
	<li>向细胞沉淀中加入合成 mRNA，使其终浓度为 0.2–20 ng/µL，具体浓度根据所需蛋白表达水平而定。通过轻弹管壁或轻柔吹打，充分混匀并重悬细胞沉淀。 
	注意：可使用不同浓度的合成 mRNA，通过 Western 印迹分析检测蛋白表达水平，确定能够达到目标表达水平的合成 mRNA 浓度，以研究蛋白表达水平与生物学效应之间的特定相关性。</li>
	<li>取 10 µL 细胞悬液，使用电穿孔系统在 1,350 V 条件下进行电穿孔，每次脉冲 10 ms，共施加三次脉冲。</li>
	<li>将电穿孔后的细胞转移至新的微量离心管中，加入含 0.5% FBS 的 1.1 mL DMEM 培养基。</li>
	<li>重复上述电穿孔步骤，直至所有细胞悬液均完成电穿孔。将所有电穿孔后的细胞合并至同一微量离心管中，最终获得 1.1 × 10⁶ 个细胞于 1.1 mL 溶液中。 
	注意：可使用 100 µL 或 10 µL 的电穿孔专用枪头对大量细胞进行电穿孔，但 10 µL 和 100 µL 的电穿孔枪头分别包含在两个独立的试剂盒中，需分别购买。重悬缓冲液 R 在两个试剂盒中均有提供。</li>
	<li>完成全部电穿孔操作后，轻柔地重悬混合后的细胞。</li>
	<li>将 0.3 × 10⁶ 个细胞接种至一个 35 mm × 10 mm 的聚苯乙烯组织培养皿中，加入含 5% FBS 的 2 mL DMEM 培养基，在常规培养条件下培养 1 天，用于后续全细胞裂解液制备及 Western 印迹分析。</li>
	<li>将剩余的电穿孔细胞在室温下保存，直至实时细胞分析系统准备就绪。</li>
</ol>
5. 实时细胞分析仪、程序及CIM板的设置
注意：按照之前所述方法准备实时细胞分析仪和两块CIM板11。
<ol>
	<li>实时细胞分析仪的平衡
	<ol>
		<li>在使用前数小时，将实时细胞分析仪移入 CO2 培养箱中，使其在培养条件下达到系统平衡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置分析程序
	<ol>
		<li>通过双击桌面上的 实时细胞分析软件图标&#160;打开分析程序。</li>
		<li>打开默认实验模式设置选项后，选择分别运行三个实验的选项。 
		注意：每个支架都有独立的窗口。可通过不同的选项卡设置测量间隔和持续时间、数据分析以及其他实验条件。</li>
		<li>点击编号选项卡，打开每个支架。</li>
		<li>点击实验备注选项卡，选择数据保存的文件夹，并输入实验名称。</li>
		<li>点击布局选项卡，每次选择四个孔，为每种处理条件设置四重复孔，并输入样品信息，然后点击应用。</li>
		<li>点击时间表选项卡 | 添加步骤，以设置细胞阻抗测量的两步模式。然后点击应用，设置第一步。</li>
		<li>再次点击添加步骤，输入迁移和侵袭实验的测量间隔为 10 min，持续时间为 48 h，然后点击应用，设置第二步。 
		注意：第一步进行一次基线测量（1 min 间隔的一次扫描）。第二步在支架上对实验期间的细胞阻抗进行测量（例如，48 h 内以 10 min 间隔进行 289 次扫描）。根据实验设计调整测量间隔和持续时间。</li>
		<li>转至下一个支架，并重复步骤 5.2.3–5.2.7 进行设置。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CIM 板的准备
	<ol>
		<li>在开始细胞阻抗测量前 1 小时，向 CIM 板下室的各孔中加入含 10% 血清或其他趋化因子的 160 µL DMEM 培养基。</li>
		<li>将上室（含 ECM 凝胶包被孔用于侵袭实验，或未包被孔用于迁移实验）与下室组装在一起。</li>
		<li>在细胞迁移实验中，向上室各孔中加入 50 µL 低血清培养基，并将 CIM 板放入仪器的支架中。</li>
		<li>点击消息选项卡，确认显示连接正常信息。此时 CIM 板已准备就绪，可用于实验。</li>
		<li>在开始实时细胞分析前，将组装好的 CIM 板在 CO2 培养箱中预孵育 30–60 min，使其适应培养条件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 实时细胞分析与数据导出
注意：按照先前所述方法进行基线读数、细胞接种、细胞阻抗测量和数据导出11。
<ol>
	<li>基线读数 
	注意：应在 CIM 板完成平衡后、且在将细胞加入上室孔之前读取基线。
	<ol>
		<li>点击每个支架上的 开始 按钮。当出现 另存为 窗口时，保存实验文件以执行基线读数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞接种
	<ol>
		<li>将 CIM 板从支架上取下，并置于生物安全柜内的板架上。</li>
		<li>根据控制单元中的程序，向上室的孔中加入 100 µL（含 100,000 个细胞）电转染后的细胞。采用反向移液法操作，避免产生气泡。</li>
		<li>将 CIM 板置于生物安全柜中，室温下静置 30 分钟，以确保细胞在孔底均匀铺展。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞阻抗测量
	<ol>
		<li>将组装完整的 CIM 板放回相应的支架中。点击支架上的 开始 按钮，启动第二步的细胞阻抗测量。</li>
		<li>点击 绘图 标签，然后点击 全部添加 按钮，并选中 平均值 和 标准差 复选框，以实时显示数据。 
		&#8203;注意：默认的绘图选项为 x 轴为 时间，y 轴为 细胞指数。绘图选择 区域允许用户为 y 轴选择其他选项：归一化细胞指数 或 Δ细胞指数。完成最终扫描后，实验即告结束，结果将自动保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>导出数据用于分析
	<ol>
		<li>点击 绘图 标签，并选中 平均值 和 标准差 复选框，以逐个复制每个孔的数据。</li>
		<li>在图表区域右键点击，选择 以列表格式复制数据。</li>
		<li>打开一个空白电子表格文件，粘贴数据，然后保存该文件。</li>
		<li>返回分析程序，点击每个支架的 板 标签，并选择 释放，以关闭该支架的实验。</li>
		<li>返回电子表格文件，调整原始数据的时间，使第二步的起始时间成为测量的实际起始时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Zhao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGI174+protein+and+its+functional+domain+peptides+exert+antitumour+effects+on+renal+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma.</a> International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).</li>
<li>Witte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta1-induced+cell+migration+in+pancreatic+carcinoma+cells+is+RAC1+and+NOX4-dependent+and+requires+RAC1+and+NOX4-dependent+activation+of+p38+MAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK.</a> Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).</li>
<li>Bui, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aquaporin+3+expression+by+the+AhR+pathway+is+critical+to+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration.</a> Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+in+membrane+repair+capacity+between+cancer+cell+lines+and+a+normal+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line.</a> The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

迁移和侵袭是肿瘤细胞的重要特征。测量肿瘤细胞的运动能力并理解调控肿瘤细胞运动能力的潜在机制，可为治疗干预提供关键见解2,27。目前已开发出多种方法用于研究细胞迁移7。利用划痕或培养插件进行的伤口愈合实验是一种简单且常用的方法，可提供间隙闭合的对比图像。单细胞追踪实验则需要通过延时成像对单个细胞进行监测，细胞可通过荧光染料进行标记。伤口愈合实验和单细胞追踪实验均可用于检测细胞的自发运动。
借助延时成像和密集的后续数据处理，这两种检测方法均可实现样本间的定量比较28。然而，这些检测方法不适用于研究细胞穿过细胞外基质（ECM）蛋白层的侵袭过程。相比之下，Transwell迁移与侵袭实验可测量细胞在有或无ECM蛋白层的情况下，穿过Transwell小室膜的定向迁移能力。但这些实验无法实现持续监测，因为需要在特定时间点收集已迁移的细胞，且Transwell装置无法重复使用。所有这些...

肿瘤细胞的运动性在转移过程中起着至关重要的作用1,2。肿瘤细胞向邻近及远端健康组织的扩散使癌症治疗变得困难，并导致复发3,4。因此，了解肿瘤细胞运动性的机制并开发相应的治疗策略至关重要。由于许多肿瘤细胞具有改变的基因表达谱，明确基因表达谱中哪些变化导致肿瘤细胞运动性的改变尤为关键5,6。
已开发出多种检测方法用于测量细胞迁移 体外某些检测方法由于仅允许在特定时间点进行测量，因此提供的信息有限，而其他方法则能够实时提供关于肿瘤细胞运动性的全面信息7尽管许多细胞迁移实验可以在特定时间点或实验终点提供定量结果，但它们无法充分揭示整个实验期间细胞迁移速率的动态变化细节。此外，根据实验设计、细胞类型和细胞数量的不同，可能难以检测细胞迁移速率的潜在变化。再者，对于简单的处理干预，可通过传统迁移实验的简单量化进行分析，但若要研究多种联合处理的复杂效应，则可能需要更精细的定量方法。8.
已开发出一种用于监测覆盖有微电极的微孔板孔底电流量的仪器9。细胞与孔表面的黏附会阻碍电子流动，其阻抗与细胞的定量和定性结合相关。孔底存在微电极可实现对细胞黏附、铺展和增殖的测量。当微电极位于上室微孔膜下方时，可测量细胞从上室向下室的迁移和侵袭能力，其中上室涂有细胞外基质（ECM）蛋白以允许细胞侵袭10。
此前已证明，基于阻抗的肿瘤细胞迁移和侵袭实时检测方法可在整个实验过程中提供实时数据，并可在不同实验条件下进行即时比较和定量分析11。在该方法学论文中，通过基因敲低来检测目的蛋白在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用。由于在电穿孔导入小干扰RNA（siRNAs）后，达到完全的基因敲低效应需要3-4天时间8，因此在电穿孔后将细胞重新接种，并在3天后重新收集，用于基于阻抗的肿瘤细胞迁移和侵袭实时检测。
CT10调节激酶（Crk）和Crk样蛋白（CrkL）是衔接蛋白，可介导多种生长因子受体激酶通路及非受体酪氨酸激酶通路下游的蛋白质-蛋白质相互作用12。Crk和CrkL蛋白水平的升高与多种人类癌症（包括胶质母细胞瘤）的不良预后相关13。然而，目前尚不清楚Crk和CrkL蛋白水平升高如何导致预后不良。因此，明确Crk和CrkL过表达对肿瘤细胞功能的影响具有重要意义。此前，通过基因敲低研究已证实内源性Crk和CrkL蛋白水平对胶质母细胞瘤细胞的迁移和侵袭是必需的8。本文建立了一种改良的检测体系，用于研究Crk和CrkL过表达对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。
最近， 体外 mRNA的合成及其治疗应用因SARS-CoV-2 mRNA疫苗的开发而重新受到关注（Verbeke等综述）14此外，在癌症及其他疾病中使用合成mRNA已取得显著进展15,16电穿孔是一种有效的递送合成mRNA并诱导瞬时基因修饰的方法（参见Campillo-Davo等人的综述）。17，并且使用合成mRNA可在永生化成纤维细胞中实现快速高效的基因表达18本方法论文结合使用合成mRNA进行基因过表达与实时细胞分析，以研究肿瘤细胞的迁移和侵袭。然而，用于siRNA的实验方案不适用于合成mRNA转染，因为在合成mRNA转染后，外源蛋白的表达水平迅速升高，并逐渐下降18因此，该方法已改进为可在转染后直接进行细胞迁移和侵袭的实时分析，无需额外的细胞培养步骤。
本方法论文表明，将基于阻抗的实时检测技术与肿瘤细胞转染合成mRNA相结合，可快速、全面地分析基因上调对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。本文详细描述了检测Crk和CrkL过表达如何影响胶质母细胞瘤细胞迁移与侵袭的具体实验步骤。通过考察合成mRNA浓度依赖性对肿瘤细胞迁移的影响，论文清晰地阐述了蛋白水平升高如何促进肿瘤细胞的迁移。此外，本文还提出了一种通过调节细胞外基质（ECM）凝胶浓度的方法，用于评估基因表达变化对肿瘤细胞侵袭能力的影响。

<table><tbody><tr><td>AlphaImager HP</td><td>ProteinSimple</td><td>92-13823-00</td><td>琼脂糖凝胶成像系统</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T9026</td><td>用于检测&amp;alpha;-微管蛋白（稀释比例 1:3,000）</td></tr><tr><td>CIM-plate 16</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>5665825001</td><td>细胞侵袭与迁移实验板</td></tr><tr><td>Crk 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>610035</td><td>用于检测 CrkI 和 CrkII 蛋白（稀释比例 1:1,500）</td></tr><tr><td>CrkL 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-319</td><td>用于检测 CrkL 蛋白（稀释比例 1:1,500）</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>302002</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>用于洗涤细胞的缓冲液</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td>培养基添加剂</td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030285</td><td>CO2 培养箱</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG 二抗</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>Western 印迹分析用二抗（稀释比例 1:10,000）</td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗兔 IgG 二抗</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>Western 印迹分析用二抗&amp;nbsp;（稀释比例 1:10,000）</td></tr><tr><td>氯化锂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM9480</td><td>用于 RNA 沉淀</td></tr><tr><td>Matrigel 基质</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>细胞外基质 (ECM) 凝胶</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 转录试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td>用于 RNA 合成</td></tr><tr><td>Millennium RNA 标记物</td><td>Invitrogen</td><td>AM7150</td><td>用于甲醛琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>ISC BioExpress</td><td>C1301P-ISC</td><td>用于离心收集细胞</td></tr><tr><td>小鼠脑 QUICK-Clone cDNA</td><td>TaKaRa</td><td>637301</td><td>克隆用基因（插入片段）来源</td></tr><tr><td>NanoQuant</td><td>Tecan</td><td>M200PRO</td><td>核酸定量系统</td></tr><tr><td>Neon 电穿孔系统&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>电穿孔系统&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Neon 转染系统 10 &amp;micro;L 试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1025</td><td>电穿孔试剂盒</td></tr><tr><td>Neon 转染系统 100 &amp;micro;L 试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>电穿孔试剂盒</td></tr><tr><td>NorthernMax 变性凝胶缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>AM8676</td><td>用于甲醛琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>NorthernMax 甲醛上样染料</td><td>Invitrogen</td><td>AM8552</td><td>用于甲醛琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>NorthernMax 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>AM8671</td><td>用于甲醛琼脂糖凝胶电泳</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Teknova</td><td>W3331</td><td>用于 mRNA 合成过程中的多种反应</td></tr><tr><td>Odyssey CLx 成像仪</td><td>Li-Cor</td><td></td><td>Western 印迹分析成像仪</td></tr><tr><td>pcDNA3.1/myc-His</td><td>Invitrogen</td><td>V80020</td><td>插入片段（小鼠 CrkI 和 CrkL cDNA）克隆所用载体</td></tr><tr><td>pFLAG-CMV-5a</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7523</td><td>FLAG 表位标签来源</td></tr><tr><td>苯酚:氯仿:异戊醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2069</td><td>用于 DNA 提取</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560L</td><td>用于线性化质粒以进行 mRNA 合成</td></tr><tr><td>多聚(A)加尾试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>AM1350</td><td>用于多聚(A)加尾反应</td></tr><tr><td>聚苯乙烯组织培养皿（100 x 20 mm 规格）</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>用于转染前细胞培养</td></tr><tr><td>聚苯乙烯组织培养皿（35 x 10 mm 规格）</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>用于培养转染后细胞</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Invitrogen</td><td>25530049</td><td>用于去除反应混合物中的蛋白质</td></tr><tr><td>Purifier Axiom II 级生物安全柜，C1 型</td><td>Labconco Corporation</td><td>304410001</td><td>用于细胞无菌操作的生物安全柜</td></tr><tr><td>重悬缓冲液 R</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>电穿孔试剂盒（MPK1025 和 MPK10096）中包含的缓冲液，用于电穿孔前重悬细胞，其成分为专有信息。</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNA 去污染溶液</td></tr><tr><td>Scepter</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>手持式自动细胞计数器&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>ScriptCap 2'-O-甲基转移酶试剂盒</td><td>Cellscript</td><td>C-SCMT0625</td><td>用于加帽反应</td></tr><tr><td>ScriptCap m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G 加帽系统</td><td>Cellscript</td><td>C-SCCE0625</td><td>用于加帽反应</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15553-035</td><td>用于蛋白酶 K 反应的去垢剂</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004532</td><td>台式离心机，用于离心收集细胞</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>用于细胞解离</td></tr><tr><td>U-118MG&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>HTB15</td><td>源自人胶质母细胞瘤患者的贴壁细胞系</td></tr><tr><td>连环蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>V9131</td><td>用于检测连环蛋白（vinculin）（稀释比例 1:100,000）</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>380601050</td><td>用于实时细胞分析的仪器</td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;不同细胞系的电穿孔参数及其他相关信息可在制造商官网获取（https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?）。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

转染合成mrna后肿瘤细胞迁移与侵袭的实时定量检测

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

肿瘤细胞具有高度运动性和侵袭性，并表现出异常的基因表达模式。了解基因表达变化如何调控肿瘤细胞的迁移和侵入，对于理解肿瘤细胞浸润邻近健康组织及发生转移的机制至关重要。此前研究表明，通过基因敲低并结合基于阻抗的实时检测技术监测肿瘤细胞的迁移与侵袭，可鉴定出调控这些过程所必需的基因。近期，针对 SARS-CoV-2 的 mRNA 疫苗推动了合成 mRNA 在治疗领域应用的兴趣。本文改进了利用合成 mRNA 的方法，用于研究基因过表达对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。本研究证明，通过转染合成 mRNA 提高基因表达水平，再结合基于阻抗的实时检测，有助于识别能够促进肿瘤细胞迁移和侵袭的基因。本方法学论文详细阐述了评估基因表达改变对肿瘤细胞迁移和侵袭影响的实验流程。

Crk 和 CrkL 蛋白在多种细胞类型的运动性中发挥重要作用，包括神经元22、T 细胞23、成纤维细胞18,19以及多种肿瘤细胞13。由于已有报道显示 Crk 和 CrkL 蛋白在胶质母细胞瘤中表达升高24,25,26，本研究探讨了 Crk 的剪接变体 CrkI 过表达对胶质母细胞瘤细胞迁移的影响。通过电穿孔法将不同浓度的合成 CrkI mRNA 导入 U-118MG 细胞，并检测其蛋白表达水平和细胞迁移能力。在转染后 1 天，以不同浓度的合成 CrkI mRNA 对 U-118MG 胶质母细胞瘤细胞进行电穿孔，导致 FLAG 标签的 CrkI 蛋白表达呈浓...

许多上调的基因会促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，从而导致预后不良。确定哪些基因调控肿瘤细胞的迁移和侵袭至关重要。本实验方案介绍了一种实时研究基因表达升高对肿瘤细胞迁移和侵袭影响的方法。

转染合成mRNA后肿瘤细胞迁移与侵袭的实时定量检测

肿瘤细胞具有高度运动性和侵袭性，并表现出改变的基因表达模式。了解基因表达变化如何调控肿瘤细胞……

本方案表明，将感觉信使RNA转染与基于阻抗的细胞迁移和侵袭实时检测相结合，有助于鉴定能够促进肿瘤细胞迁移和侵袭的基因。基于阻抗的实时细胞分析系统可对基因表达变化条件下肿瘤细胞的迁移进行定量、连续和全面的监测。在肿瘤中过表达并促进肿瘤细胞迁移的基因可被识别为癌症治疗中抑制转移的潜在靶点。首先，在微量离心管中加入 10 微升 10x 反应缓冲液、1.5 微升 PNE one 和 10 微克质粒 DNA，以用限制性内切酶线性化质粒 DNA。加入无核酸酶水，使反应体系总体积达到 100 微升。轻轻敲击混匀后短暂离心，然后将反应混合物在 37 摄氏度孵育过夜。再次离心后，在反应混合物中加入5 µL 10% SDS和1 µL浓度为20 mg/mL的RNA级蛋白酶K，混匀后再次离心。在50 °C孵育30分钟后，取2 µL 10×转录缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP和T7，以及1 µg线性化DNA，加入微量离心管中，用于T7 RNA聚合酶介导的RNA合成。加入无核酸酶水，使反应体系总体积达到20 µL。离心沉淀后，在37摄氏度下孵育反应混合物2小时以进行RNA合成。接着再次离心，加入1微升DNA酶，混匀后在37摄氏度下孵育15分钟，以去除模板DNA。通过向反应混合物中加入10微升7.5摩尔的氯化锂，开始RNA的氯化锂沉淀步骤。轻弹并离心后，将反应混合物在负20摄氏度下孵育30分钟。进行加帽时，将RNA样本在65摄氏度下加热10分钟，然后置于冰上冷却。接着，加入加帽反应组分，并通过轻弹混匀。离心反应混合物，并在37摄氏度下孵育1小时。进行poly-A加尾时，离心样品后加入poly-A加尾反应组分，轻轻振荡，离心，然后在37摄氏度下孵育反应混合物2小时。为了沉淀和定量合成的mRNA，加入50微升7.5摩尔的氯化锂，并进行氯化锂沉淀。从冷冻箱中取出一份ECM凝胶原液，保持在冰上。通过在微量离心管中将990微升DMEM与10微升ECM凝胶混合，将10毫克/升的ECM凝胶稀释至工作浓度。通过轻柔吹打混匀。向CIM板上室的每个孔中加入60 µL稀释后的ECM凝胶。将CIM板上室（不加盖）置于二氧化碳培养箱内塑料保护膜上，孵育约4小时，以形成凝胶层。进行电穿孔时，向每管肿瘤细胞悬液中加入1毫升DPBS。轻弹细胞悬液，以每次10秒的速度离心沉淀三次。使用微量移液器吸除上清液。加入110微升重悬缓冲液R至细胞沉淀中，以获得每10微升含0.1百万个细胞的悬液。向细胞沉淀中加入合成mRNA，使其终浓度为0.2至20纳克/微升，具体浓度根据所需表达水平而定。轻轻敲击管壁，混匀并轻柔地重悬细胞沉淀。接下来，使用电穿孔系统对10微升细胞悬液进行电穿孔处理，参数设置为1,350伏、10毫秒，每次施加三个脉冲。操作完成后，将电穿孔处理后的细胞转移至新的微量离心管中，加入含有0.5% FBS的1.1毫升DMEM培养基。通过双击实时细胞分析软件图标，打开分析程序。打开默认实验模式设置选项后，选择分别运行三个实验的选项。通过单击数字标签打开每个支架，然后单击实验记录标签。选择文件夹并输入实验名称以保存数据。单击布局选项卡，每次选择四个孔，为每种处理条件设置四复孔。输入样品信息，然后单击应用。单击“计划”选项卡，然后添加一个步骤以设置细胞阻抗测量的两步模式。接着，单击“应用”以设置第一步。再次单击“添加步骤”，将间隔设为10分钟，迁移和侵袭持续时间设为48小时。然后，单击“应用”以设置第二步。在进行细胞阻抗测量前一小时，向CIM板下室的各孔中加入160 µL含有10%血清或其他趋化因子的DMEM培养基。将上室（含ECM凝胶包被的孔用于侵袭实验，或未包被的孔用于迁移实验）与下室组装在一起。对于细胞迁移实验，向CIM板上室的各孔中加入50微升低血清培养基。将CIM板和系统的支架放入CO2培养箱中。单击消息标签。连接正常后，系统将显示消息，此时CIM板即可用于实验。在进行实时细胞分析之前，将组装好的CIM板置于二氧化碳培养箱中预孵育30至60分钟，以使CIM板适应培养条件。进行基线读数时，点击每个支架的“开始”按钮。当“另存为”窗口出现时，将实验文件保存以进行基线读数。进行细胞接种时，将CIM板从支架上取出，并置于生物安全柜内的板架上。然后向CIM板上室的各孔中加入含有100,000个电穿孔细胞的100微升细胞悬液，并将CIM板置于生物安全柜中室温下静置30分钟。将完全组装好的CIM板放回相应的支架中，以测量细胞阻抗。通过点击支架的启动按钮和绘图选项卡，开始第二步的细胞阻抗测量。然后点击“全部添加”按钮，并选中平均值和标准差复选框，以实时可视化数据。用不同浓度的合成crack one mRNA对U 118 mg胶质母细胞瘤细胞进行电穿孔转染，结果显示转染后一天flag标签的crack one蛋白表达量呈浓度依赖性增加。0.2和2纳克/微升mRNA导致外源性crack one蛋白表达不可检测或仅有轻微表达。20纳克/微升mRNA的表达水平高于内源性crack one蛋白。细胞迁移实验表明，使用0.2或每微升2纳克的crack one mRNA进行电穿孔对细胞迁移影响不大。然而，使用每微升20纳克的crack one mRNA进行电穿孔则显著促进了细胞迁移，在2至13小时之间有更多细胞发生迁移，表明胶质母细胞瘤的细胞迁移受到crack one蛋白水平升高的刺激。使用合成的crack L mRNA进行电穿孔后，转染一天即可观察到flag标签标记的crack L蛋白的强烈表达。对照细胞的侵袭能力随着ECM蛋白浓度的增加而减慢。Crack L过表达细胞表现出依赖于ECM凝胶浓度的细胞侵袭能力下降。在不同ECM凝胶浓度下，对照细胞与Crack L过表达细胞的比较表明，Crack L过表达总体上促进了细胞通过ECM凝胶层的侵袭。结果还表明，这两种细胞群体在不同时间点受到细胞外基质凝胶浓度增加的影响存在差异。在重悬的气泡R电穿孔过程中，细胞应快速、轻柔且完全地重悬，因为细胞在重悬的气泡R中长时间孵育会导致细胞状态不佳。可通过分离快速和慢速迁移的肿瘤细胞，以表征这两种细胞群体之间的差异。

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