Name: 从P3HR1细胞系分离和定量EB病毒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习从P3HR1细胞系分离EB病毒颗粒并进行实时PCR定量分析的方法。该技术为病毒学研究提供简便、快速且可靠的病毒储备制备方案，适用于体外和体内实验模型。

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本工作的经费由阿斯玛研究基金、黎巴嫩国家科学研究中心（L-CNRS）以及贝鲁特美国大学医疗实践计划（MPP）向ER提供的资助支持。

注意：EBV 应被视为潜在的生物危害材料，因此必须在生物安全二级或更高级别的防护条件下操作。操作时应穿戴实验服和手套。如果存在溅洒暴露的风险，还应考虑使用眼部防护装备。以下操作应在生物安全柜中进行。
1. 计数P3HR1细胞
<ol>
	<li>离心并重悬细胞
	<ol>
		<li>将处于80%融合度的P3HR1细胞培养物（来自100 mm培养皿或T-25培养瓶）中的细胞悬液转移至15 mL圆锥形离心管中。P3HR-1细胞的接种密度为1 × 106 个细胞/mL。使用完全RPMI培养基（79% RPMI培养基、20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素抗生素）在37 °C、5% CO2条件下培养，每3–4天传代一次。</li>
		<li>以120 × g离心8分钟。离心后弃去上清液，将细胞沉淀用1 mL完全RPMI培养基重悬，并充分混匀（此溶液称为悬液A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备用于计数的细胞悬液
	<ol>
		<li>取2 µL细胞悬液A与8 µL培养基混合，制备稀释后的细胞悬液B。向悬液B中加入10 µL 0.4%台盼蓝，得到悬液C。通过轻柔吹打充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血细胞计数板进行细胞计数
	<ol>
		<li>将盖玻片盖在血细胞计数板上，加入10 µL悬液C。将血细胞计数板置于光学显微镜下，使用40倍物镜计数血细胞计数板四个象限中未被染成蓝色的细胞数量（图1）。</li>
		<li>台盼蓝可将死细胞染成蓝色；此类细胞不计入总数，位于每个计数象限顶部、底部、右侧或左侧边界上的细胞也不计入。</li>
		<li>使用以下公式计算每毫升的细胞浓度： 
		<img alt="细胞计数公式；总细胞数 × 稀释倍数 / 4×10⁻⁴；方程示意图。" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程1"> 
		注：计数的象限数为4个，血细胞计数板中方格的体积为10-4 mL。应计数的四个象限在图1中以绿色标示。公式中的总细胞数为第1、2、3和4象限中细胞数的总和。图1中蓝色标示的细胞应计入，红色标示的细胞不应计入，因其接触了象限的顶部、右侧、底部或左侧边界。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="数独网格模式、空间分布、图模拟、网格布局、数据点分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64279/64279fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：使用血细胞计数板进行细胞计数。 使用光学显微镜计数四个象限的细胞，这些象限以绿色表示。本方案第 1.3.3 步中公式所示的总细胞数为第 1、2、3 和 4 象限中细胞数量的总和。蓝色标记的细胞应被计入，而红色标记的细胞不应计入，因为它们接触了象限的上、右、下或左边界。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64279/64279fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 准备培养用的培养板
<ol>
	<li>将一定体积的细胞悬液A加入15 mL锥形管中。所需体积取决于细胞数量。调整体积，使细胞数量约为2.2 × 106个，用于接种100 mm培养皿。</li>
	<li>向管中加入5 mL完全培养基，然后将管内液体转移至100 mm培养皿中。向培养皿中加入80 µL二甲基亚砜（DMSO）。 
	注意：DMSO对光敏感，应储存于避光容器中，或用铝箔等不透光材料包裹。</li>
	<li>向管中加入350 µL浓度为1 mg/mL的佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）。PMA的终浓度应为35 ng/mL，DMSO的终浓度应为0.08%。 
	警告：PMA具有毒性、腐蚀性且为致癌物，操作时须格外小心。PMA对光敏感，应储存于避光容器中，或用铝箔等不透光材料包裹。</li>
	<li>加入4.27 mL培养基，使总体积达到10 mL。通过倾斜混匀管内液体，然后将内容物转移至100 mm培养皿中。将培养皿置于细胞培养箱中，在37 °C、5% CO2条件下培养5天。</li>
</ol>
3. 埃博病毒颗粒的诱导与分离
<ol>
	<li>在培养箱中培养5天后，以120 × g 离心8分钟，使细胞沉淀。收集不含细胞但含有病毒的上清液，并弃去细胞沉淀。</li>
	<li>将上清液在4 °C条件下以16,000 × g 离心90分钟，使病毒颗粒沉淀。弃去上清液，并将病毒沉淀重悬于5 mL培养基中。 
	注意：可使用磷酸盐缓冲液（PBS）代替培养基来重悬病毒沉淀。</li>
	<li>将获得的病毒悬液分装至20个管中，每管含250 µL病毒悬液。于-80 °C保存。</li>
</ol>
4. 从病毒颗粒中提取DNA
警告：处理苯酚时需格外小心，因为苯酚具有毒性和腐蚀性，可导致严重灼伤。苯酚对光敏感，接触光或空气后会发生氧化。应将其储存在避光容器中，或用铝箔等不透光材料包裹苯酚管。
<ol>
	<li>蛋白质与 DNA 的分离
	<ol>
		<li>向一个 250 µL 离心管中加入 500 µL TrisCl 饱和酚。加入 100 µL 水（以增加水相体积），充分涡旋震荡形成粉红色乳状液。在 9650 × g 条件下离心 15 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 沉淀
	<ol>
		<li>收集上清液（透明的水相），转移至一个新的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
		<li>加入相当于上清液体积 1/10 的冷乙酸钠溶液（3 M，pH 5.2），通过移液器反复吹打混匀。加入 1 µL 20 mg/mL 甘油三酯，再次通过移液器吹打混匀。 
		注意：此步骤为可选步骤，但加入甘油三酯可增强 DNA 沉淀，并有助于更清晰地观察 DNA 沉淀颗粒。</li>
		<li>加入相当于上清液体积三倍的冷 100% 乙醇。于 -80 °C 下保存过夜。 
		注意：此处可暂停实验流程，待后续继续操作。样品可在 -80 °C 下保存 1 小时，或过夜保存。过夜保存有助于提高 DNA 沉淀效率，因此推荐采用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>病毒 DNA 的提取
	<ol>
		<li>次日，在 4 °C 条件下以 9650 × g 离心 15 分钟，弃去上清液，获得 DNA 沉淀。</li>
		<li>用 1 mL 冷 70% 乙醇洗涤沉淀三次，每次在 9650 × g 条件下离心 15 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将沉淀在空气中干燥约 10 分钟。根据 DNA 沉淀的大小，将其重悬于 10–50 µL 无核酸酶的蒸馏水中。</li>
		<li>将样品储存于 -20 °C 以备后续处理，或在 4 °C 下过夜保存以确保 DNA 充分溶解，随后转移至 -20 °C 保存。也可直接进入第 5 步操作。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 检测 DNA 浓度和纯度
<ol>
	<li>使用精细擦拭纸清洁显微分光光度计的样品台后，加入 1 µL DNA 样品。</li>
	<li>记录样品中 DNA 的浓度。检测在 <img alt="核酸纯度比值公式，260nm/280nm，用于光谱分析。" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 2"> 和 <img alt="光谱比值 260nm/230nm；吸光度测量；核酸纯度示意图。" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Equation 3"> 处的吸光度比值。DNA 在 260 nm 处有吸收峰，蛋白质在 280 nm 处有吸收峰，而苯酚等有机物质在 230 nm 处有吸收峰。比值在 1.8–2.0 之间时，可满足实时荧光定量 PCR 的要求。</li>
</ol>
6. 实时聚合酶链式反应定量分析
<ol>
	<li>PCR反应体系的配制
	<ol>
		<li>在0.2 mL PCR管中加入5 µL SYBR Green实时荧光定量PCR混合液。向每管中加入1 µL浓度为7.5 pmol/µL的正向引物和1 µL浓度为7.5 pmol/µL的反向引物。正向引物序列：5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'；反向引物序列：5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'。用于检测EBV基因组拷贝数的扩增基因为Epstein-Barr病毒小RNA 2（EBER-2）基因。</li>
		<li>向其中一管中加入2 µL无核酸酶水和1 µL步骤4中提取的病毒DNA。反应体系总体积为10 µL。 
		注意：根据样品中DNA的浓度，可能需要进行稀释。稀释倍数F应予以记录，并在步骤6.3的计算公式中纳入考虑。</li>
		<li>准备其他作为标准品的PCR管，其中含有已知EBV基因组拷贝数的标准品（1000、2000、5000、10,000和54,000拷贝）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>运行PCR程序：首先在95 °C激活5分钟，随后进行40个循环，每个循环包括95 °C变性15秒和58 °C退火30秒。</li>
	<li>通过将各标准品的Ct值对其EBV基因组拷贝数的对数值作图，绘制qPCR标准曲线。根据标准曲线的拟合方程，推算出含有诱导病毒DNA的PCR管中的EBV基因组拷贝数。然后，使用以下公式计算诱导病毒制备物的浓度： 
	<img alt="EBV颗粒浓度计算公式；DNA重悬液的实验室计算方程" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq04.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="方程4"> 
	其中X为根据标准曲线得出的EBV基因组拷贝数，F为PCR反应中所用DNA样本的稀释倍数。</li>
</ol>
7. 检测病毒颗粒的生物学活性/感染性
<ol>
	<li>将处于80%融合度的100 mm培养皿中的BC-3细胞转移至15 mL圆锥形离心管中。P3HR-1细胞的接种密度为1 × 106 个细胞/mL。使用完全RPMI培养基（79% RPMI培养基、20%胎牛血清、1%青霉素-链霉素抗生素）在37 °C、5% CO2条件下培养，每3-4天传代一次。</li>
	<li>按照步骤1的方法对BC-3细胞进行计数。向96孔板中每孔加入105个BC-3细胞。使用三、六、九或十二个孔，以确保结果的显著性并减少误差。</li>
	<li>根据步骤6.3中确定的病毒制备物浓度，向每孔加入相应体积的病毒原液。感染复数（MOI）可变，通过本方案的优化可确定最佳MOI（建议MOI范围为2-50）。确保每孔中混合液的总体积为250 µL。
	<ol>
		<li>为确定所需体积，需已知病毒原液的浓度，并选择一个MOI值。例如，若MOI为2，则加入的病毒颗粒数量应为细胞数量的两倍。使用公式：<img alt="静力学平衡方程 V=n/c；数学公式。" src="/files/ftp_upload/64279/64279eq05.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式5"> 计算所需病毒原液的体积 V，其中n为所需的病毒颗粒数，C为已知的病毒原液浓度</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将96孔板内容物孵育5天。5天后，将每孔内容物转移至1.5 mL离心管中。</li>
	<li>以120 × g离心8分钟，使细胞与含病毒的培养基分离。对细胞沉淀及上清液均进行DNA提取，随后进行实时PCR定量，以检测各组分中病毒基因组的存在情况，从而评估病毒颗粒的感染能力。</li>
</ol>

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<li>Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus+nuclear+protein+2+%28EBNA2%29+binds+to+a+component+of+the+human+SNF-SWI+complex%2C+hSNF5%2FIni1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1.</a> Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).</li>
<li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBNA2-deleted+Epstein-Barr+virus+%28EBV%29+isolate%2C+P3HR1%2C+causes+Hodgkin-like+lymphomas+and+diffuse+large+B+cell+lymphomas+with+type+II+and+Wp-restricted+latency+types+in+humanized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice.</a> PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590(2020).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

产生EBV病毒颗粒对于理解该病毒的生物学特性及其相关疾病至关重要。本文描述了从P3HR-1细胞系中产生这些病毒颗粒的方法。P3HR-1并非唯一可产生EBV的细胞系；事实上，EBV颗粒也已从B95-8细胞21,22以及Raji细胞系18,19中分离获得。在这些细胞中，EBV的裂解周期可通过正丁酸盐（n-butyrate）诱导激活。此外，也可使用佛波酯类化合物，如12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA），亦称佛波醇12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）。总体而言，本文详述的实验方案同样适用于上述细胞系替代P3HR-1细胞。然而，B95-8细胞系源自棉顶狨（Saguinus oedipus），该物种目前被列为极危灵长类动物23，因此供应商极少出售该细胞系，且对其销售和运输存在严格限制。根据《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）规...

Epstein-Barr 病毒（EBV）是首个被分离出来的人类肿瘤病毒1。EBV 正式称为人疱疹病毒 4 型（HHV-4）2，属于疱疹病毒科中的γ疱疹病毒亚科，是淋巴隐病毒属的原型种。全球约 90–95% 的成年人群均感染过该病毒3。大多数情况下，初次感染发生在出生后前 3 年内，且无明显症状；然而，若在青春期后期发生感染，则可能引发一种称为传染性单核细胞增多症的疾病4。EBV 能够感染静息态 B 细胞，诱导其转化为具有增殖能力的 B 淋巴母细胞，并在其中建立并维持潜伏感染状态5。EBV 可在任何时间被重新激活，从而导致反复感染6。
在过去的50年中，某些病毒与人类恶性肿瘤发生之间的关联变得越来越明显，目前估计所有人类癌症中有15%至20%与病毒感染有关7。疱疹病毒（包括EB病毒）是这类肿瘤病毒中研究最为深入的代表之一8。事实上，EB病毒可导致多种人类恶性肿瘤，例如伯基特淋巴瘤（BL）、霍奇金淋巴瘤（HL）、弥漫性大B细胞淋巴瘤以及免疫功能低下宿主中的淋巴增殖性疾病9,10。EB病毒还被证实与系统性自身免疫性疾病的发生相关。这类自身免疫性疾病的一些例子包括类风湿关节炎（RA）、多发性肌炎-皮肌炎（PM-DM）、系统性红斑狼疮（SLE）、混合性结缔组织病（MCTD）和干燥综合征（SS）11。此外，EB病毒还与炎症性肠病（IBD）的发生有关12。
这些疾病中的许多可通过细胞培养、小鼠或其他生物体进行研究或建模&#160;感染EBV的细胞或生物体需要EBV颗粒来进行感染，无论是在 体外 或 体内 模型13,14,15,16因此，有必要开发一种低成本的病毒颗粒分离技术。本文所述方案为从相对易得的细胞系中可靠地分离EBV颗粒提供了一种简便方法，并可通过实时PCR对颗粒进行定量，该方法成本较低，且大多数实验室均可实现。与已报道的多种从不同细胞系中分离EBV的方法相比，本方案具有明显优势。17,18,19,20.
P3HR-1 是一种伯基特淋巴瘤（BL）细胞系，以悬浮状态生长，并潜伏感染EBV 2型毒株。该细胞系可产生EB病毒，经诱导后能够释放病毒颗粒。本文旨在展示一种从P3HR-1细胞系中分离EB病毒颗粒并定量病毒原液的方法，所得病毒原液可用于后续的 体外 和 体内 EBV 实验模型

<table><tbody><tr><td>0.2 mL 薄壁 PCR 管</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0620</td><td>使用前应高压灭菌</td></tr><tr><td>0.2–10 &amp;micro;L 微量滤芯吸头</td><td>Corning</td><td>4807</td><td>使用前应高压灭菌</td></tr><tr><td>0.5–10 &amp;micro;L 移液器</td><td>BrandTech</td><td>704770</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 一次性刻度移液管</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>QSP</td><td>TF-112-1000-Q</td><td></td></tr><tr><td>100–1000 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>100 × 20 mm 培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>10–100 &amp;micro;L 移液器</td><td>BrandTech</td><td>704774</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>QSP</td><td>TF-108-200-Q</td><td></td></tr><tr><td>20–200 &amp;micro;L 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 实时荧光定量 C-1000 热循环仪</td><td>Bio-Rad</td><td>184-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Amresco</td><td>0231</td><td></td></tr><tr><td>无 DNase/RNase 水</td><td>Zymo Research</td><td>W1001-1</td><td></td></tr><tr><td>EBER 引物</td><td>Macrogen</td><td>N/A</td><td>定制引物</td></tr><tr><td>EBV DNA 对照品（标准品）</td><td>Vircell</td><td>MBC065</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（实验室试剂级）</td><td>Fischer Chemical</td><td>E/0600DF/17</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Fresco 21 微型离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>10651805</td><td></td></tr><tr><td>糖原溶液</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>BOECO</td><td>BOE 01</td><td></td></tr><tr><td>倒置光学显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Costar (Corning)</td><td>3621</td><td>使用前应高压灭菌</td></tr><tr><td>P3HR-1 细胞系</td><td>ATCC</td><td>HTB-62</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Biowest</td><td>L0022</td><td></td></tr><tr><td>苯酚</td><td>VWR</td><td>20599.297</td><td></td></tr><tr><td>佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>移液管助吸器</td><td>Thermo Scientific</td><td>9501</td><td></td></tr><tr><td>精密擦拭纸</td><td>Kimtech</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Sigma</td><td>R7388</td><td></td></tr><tr><td>SL 16R 离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Riedel-de Ha&amp;euml;n (Honeywell)</td><td>25022</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>水套式 CO2 培养箱</td><td>Thermo Scientific</td><td>4121</td><td></td></tr></tbody></table>

从p3hr1细胞系中分离与定量eb病毒

Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line

EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV），正式命名为人疱疹病毒4型（Human herpesvirus 4，HHV-4），是首个被分离的人类肿瘤病毒。全球约90%-95%的成年人群感染过EB病毒。随着分子生物学和免疫学的最新进展，体外（in vitro）和体内（in vivo）实验模型的应用已为深入理解EB病毒在多种疾病中的致病机制以及EB病毒相关肿瘤的发生提供了重要见解。本可视化实验论文旨在概述从P3HR1细胞系细胞中分离EB病毒颗粒并对其进行定量分析的实验流程。P3HR1细胞最初来源于人类伯基特淋巴瘤，能够产生一种P3HR1病毒，该病毒属于EB病毒2型毒株。通过佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯（phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）处理，可诱导P3HR1细胞进入EB病毒裂解周期，从而产生EB病毒颗粒。
采用本实验方案分离EBV病毒颗粒时，将P3HR1细胞在含有35 ng/mL PMA的完全RPMI-1640培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养5天。随后，将培养基在120 × g条件下离心8分钟，以沉淀细胞。收集含病毒的上清液，并在16,000 × g条件下离心90分钟，以沉淀EBV病毒颗粒。将病毒沉淀重悬于完全RPMI-1640培养基中，随后进行DNA提取和定量实时PCR检测，以评估制备物中EBV病毒颗粒的浓度。

本实验的目的是分离出具有已知病毒滴度的EBV颗粒悬液，可用于建立EBV感染模型。因此，使用各种试剂的最佳浓度以获得最高的EBV产量至关重要。
为确定可产生最多EBV颗粒的PMA和DMSO浓度，进行了优化实验（图2）。0.8%的DMSO浓度和35 ng/µL的PMA浓度为最佳条件，可获得较高的EBV浓度。通过优化方案获得的病毒颗粒浓度为917,471 个病毒颗粒/µL。
<img alt="条形图显示在不同PMA浓度的实验条件下EBV DNA拷贝数/μL。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64279/64279fig02v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图2"> 
图2：P3HR-1细胞经...

本方案通过佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导人P3HR1细胞系的病毒裂解周期，从而分离出EB病毒颗粒。随后从病毒制备物中提取DNA，并进行实时PCR以定量病毒颗粒浓度。

从P3HR1细胞系中分离与定量EB病毒

爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus，EBV），正式命名为人疱疹病毒4型（Human herpesvirus 4，HHV-4），是首个被分离的人类肿瘤病毒。全球约90-95%的人群感染过该病毒。

该方法可使我们从P3HR1细胞系中分离出EB病毒颗粒，并对病毒原液进行定量，以便用于各种研究目的。该技术的主要优势在于，它提供了一种相对简便、经济、快速且可靠的EB病毒原液制备方法。通过该技术产生的具有活性的病毒颗粒，可用于多种体外或体内实验模型，以进行EB病毒的相关诊断。首先，在一个15毫升的锥形管中制备一定体积的细胞悬液A，调整体积，使细胞数量约为每100毫米培养皿220万个细胞。向试管中加入5毫升完全培养基。向试管中加入80微升二甲基亚砜。然后向试管中加入350微升浓度为1毫克/毫升的PMA。PMA 的终浓度应为 35 纳克/毫升，DMSO 的终浓度应为 0.08%。加入 4.27 毫升培养基，使总体积达到 10 毫升。通过倾斜混匀管内溶液，然后将内容物转移至 100 毫米的培养皿中。将培养皿置于细胞培养箱中，在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育五天。将培养板中的内容物在孵育箱中孵育五天后，于120 ×g离心八分钟，使细胞沉淀。收集含病毒的上清液，并弃去细胞沉淀。再次于4 °C、16,000 ×g离心90分钟，使病毒颗粒沉淀。弃去上清液，将病毒沉淀重悬于5 mL培养基中。将病毒悬液分装至20管，每管含250 µL病毒悬液，并于-80 °C保存。为了将蛋白质与DNA分离，向含有病毒制备物的离心管中加入500微升Tris饱和酚。加入100微升水，充分涡旋振荡以形成粉红色乳状液。在9,650 ×g条件下离心15分钟，收集上清液并转移至新的1.5毫升微量离心管中。加入相当于上清液体积十分之一的冰冷乙酸钠，用移液器吹打混匀。然后加入1微升浓度为20毫克/毫升的糖原溶液，再次通过移液混匀。加入上清液体积三倍的冰冷100%乙醇，于-80摄氏度保存过夜。为了分离病毒DNA，在4°C条件下以9,650 G离心15分钟。弃去上清液以获得DNA沉淀，并用1毫升冰冷的70%乙醇洗涤沉淀三次。再次以9,650 G离心15分钟，弃去上清液。将沉淀物在空气中干燥约10分钟后，用10至50微升无核酸酶的蒸馏水重悬沉淀。将样品在-20摄氏度保存以备后续处理，或在4摄氏度下过夜以确保DNA充分溶解，随后转移至-20摄氏度保存。用精细擦拭纸清洁微量分光光度计的测量台后，加载1微升制备好的DNA样品，并记录样品中DNA的浓度。检测 260 与 280 纳米以及 260 与 230 纳米处的吸光度比值。DNA 在 260 纳米处有吸收峰，蛋白质在 280 纳米处有吸收峰，而苯酚等有机物质在 230 纳米处有吸收峰。比值在 1.8 至 2.0 之间被认为适用于实时 PCR。配制PCR反应体系时，将5微升Cyber Green实时PCR预混液加入0.2毫升PCR管中。向每根PCR管中加入1微升浓度为7.5皮摩尔/微升的正向引物和1微升浓度为7.5皮摩尔/微升的反向引物。此处扩增的是EBV小RNA 2基因。为了确定EBV基因组拷贝数，向其中一个试管中加入2 µL无核酸酶水和1 µL病毒DNA。反应体系总体积为10 µL。准备其他将用作标准品的试管，其中含有已知的EBV基因组拷贝数。首先在95摄氏度下激活5分钟，随后进行PCR扩增反应。然后进行40个循环：95摄氏度下15秒，58摄氏度下30秒。将所有数据表导出为 CSV 文件，并计算每根标准管中 EBV 基因组拷贝数的对数值以及平均 CQ 值。通过将标准品的 CT 值对其基因组拷贝数的对数值作图，生成 qPCR 标准曲线。利用标准曲线图的拟合方程，推算出含有诱导病毒 DNA 的 PCR 管中 EBV 基因组的拷贝数。最后，使用屏幕上显示的公式计算诱导病毒制剂的浓度。其中，X 是根据标准曲线得出的 EBV 基因组拷贝数，F 是用于建立 PCR 反应中 DNA 的稀释倍数。此处展示了使用血细胞计数板进行细胞计数的方法。使用光学显微镜计数四个象限。此处应计数标为蓝色的细胞，而标为红色的细胞不应计数，因为它们接触了象限的上、右、下或左边界。已开展优化实验，以确定可产生最多EBV颗粒的PMA和二甲基亚砜浓度。DMSO 浓度为 0.8% 且 PMA 浓度为每微升 35 纳克时效果最佳，可获得较高的 EBV 浓度。本实验室利用该技术产生的活病毒颗粒来研究针对此病毒的促自身免疫或炎症反应，并用于开发新型抗 EBV 药物。

isolation-quantification-epstein-barr-virus-from-p3hr1-cell

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免疫学与感染

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从P3HR1细胞系中分离与定量EB病毒

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