从P3HR1细胞系分离和定量EB病毒
2022年9月28日
该协议允许在用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯诱导病毒裂解循环时从人P3HR1细胞系中分离Epstein-Barr病毒颗粒。随后从病毒制剂中提取DNA，并进行实时PCR以量化病毒颗粒浓度。
该方法将使我们能够从P3HR1细胞系中分离出Epstein Barr病毒颗粒并量化病毒原液，以便将其用于各种研究目的。该技术的主要优点是它提供了一种相对简单、廉价、快速和可靠的方法来制备EB病毒储液。该技术产生的重要颗粒可用于许多体外或体内实验模型的诊断 EB.To 开始，在15毫升锥形管中制备一定体积的细胞悬液A，调节体积使得细胞数量约为220万个细胞对于100毫米培养板。
向管中加入五毫升完全培养基。向管中加入80微升二甲基亚砜。然后在管中加入 350 微升每毫升 PMA 一毫克。
PMA的终浓度应为每毫升35毫微克，DMSO的终浓度应为0.08%加入4.27毫升培养基，使总体积为10毫升。通过倾斜混合管中的内容物，然后将内容物转移到100毫米培养板中。将板在细胞培养箱中以37摄氏度，5%二氧化碳放置五天。
在培养箱中五天后，将板的内容物以120G离心8分钟以沉淀细胞收集含有上清液的无细胞病毒并丢弃细胞沉淀。再次将上清液在16， 000 G下在4摄氏度下离心90分钟以沉淀病毒颗粒。弃去上清液并将病毒沉淀重悬于5毫升培养基中，将病毒悬浮液等分到20个装有250微升病毒悬浮液的管中，并将悬浮液储存在零下80摄氏度。
为了从DNA中分离蛋白质，将500微升Tris饱和苯酚添加到含有病毒制剂的试管之一中。加入100微升水并涡旋良好以获得粉红色乳液。在9，650G下离心15分钟，收集上清液并将其转移到新的1.5毫升微量离心管中。
加入相当于上清液体积的十分之一的冷醋酸钠，并通过上下移液混合。然后加入一微升每毫升20毫克的糖原，并通过移液混合。加入三倍于上清液体积的冷100%乙醇，并将其储存在零下80摄氏度过夜。
分离病毒DNA离心机在9， 650 G下在4摄氏度下15分钟。弃去上清液以获得DNA沉淀，并用一毫升冷的70%乙醇洗涤沉淀三次。再次以9， 650 G离心15分钟，弃去上清液。
将沉淀空气干燥约10分钟后，将沉淀重悬于10至50微升无核酸酶的蒸馏水中。将样品储存在零下20摄氏度下以供以后处理，或在4摄氏度下储存过夜以确保最大的DNA溶解度，然后在零下20摄氏度下储存。用精细的任务刮水器清洁微型分光光度计的基座后，加载一微升制备的DNA样品并注意样品中DNA的浓度。
检查260至280纳米和260至230纳米的吸光度比。DNA将在260纳米处吸收，蛋白质将在280纳米处吸收，而苯酚等有机物质将在230纳米处吸收。1.8:2的比率被认为足以进行实时PCR。
要制备PCR反应混合物，请将5微升网络绿色实时PCR混合物放入0.2毫升PCR管中。向每个管中加入每微升正向引物一微升 7.5 皮摩尔和每微升反向底漆一微升 7.5 皮摩尔。在这里，EBV小RNA 2基因被扩增。
确定EBV基因组拷贝数。然后在其中一个试管中加入两微升无核酸酶水和一微升病毒DNA。反应混合物的总体积为10微升。
准备其他管，这些管将用作具有已知EBV基因组拷贝数的标准品。从在95摄氏度下激活的初始步骤开始运行PCR混合物五分钟。然后在 95 摄氏度下循环 40 次，持续 15 秒，在 58 摄氏度下循环 30 秒。
将所有数据表导出为CSV文件，并计算每个标准管的EBV基因组拷贝数和平均CQ值的日志。通过将标准的CT值与基因组拷贝数的日志绘制来生成qPCR标准曲线。采用标准曲线图方程，得出含有诱导病毒DNA的PCR管中EBV基因组拷贝数。
最后，使用屏幕上显示的公式计算诱导的病毒制剂的浓度。这里X是从标准曲线得出的EBV基因组拷贝数，F是用于建立每个PCR反应的DNA的稀释因子。此处显示了使用血细胞计数器室进行细胞计数。
使用光学显微镜对四个象限进行计数。这里应该对蓝色表示的单元格进行计数，而红色的单元格不应计数，因为它们正在接触象限的顶部、右侧、底部或左侧边框。进行优化试验以确定产生最多EBV颗粒的PMA和二甲基亚砜的浓度。
DMSO浓度为0.8%，PMA浓度为每微升35毫微克是最佳的，并导致高EBV浓度。我们的实验室使用这种技术产生的重要颗粒来检查对这种病毒的自身免疫或炎症反应。以及开发新型抗EBV药物。
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概述
该协议通过诱导病毒裂解循环从人类P3HR1细胞系中分离Epstein-Barr病毒颗粒。分离的病毒颗粒随后可以使用实时PCR进行定量。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 细胞生物学
- 分子生物学
背景
- Epstein-Barr病毒（EBV）与多种疾病相关。
- P3HR1细胞系是研究EBV的有用模型。
- 诱导裂解循环对于病毒分离至关重要。
- 实时PCR是一种可靠的定量病毒颗粒的方法。
研究目的
- 分离EBV颗粒用于研究应用。
- 提供一种定量病毒库存的方法。
- 促进EBV在实验模型中的使用。
使用的方法
- 用P3HR1细胞制备细胞悬液。
- 使用12-十四酸13-乙酸酯（PMA）诱导裂解循环。
- 从制备中提取病毒DNA。
- 使用实时PCR定量病毒颗粒。
主要结果
- 从P3HR1细胞中成功分离EBV颗粒。
- 通过PCR实现病毒库存的定量。
- 展示了该方法的效率和可靠性。
- 在体外和体内研究中的潜在应用。
结论
- 该协议提供了一种简单的EBV分离方法。
- 病毒颗粒的定量对研究至关重要。
- 这种技术可以增强对EBV相关疾病的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Reliable isolation and quantification of Epstein-Barr virus (EBV) from the P3HR1 cell line enables standardized production of viral stocks for mechanistic studies and assay development. This protocol supports predictive confidence in EBV-related research by providing reproducible viral preparations for downstream applications. The method is positioned at the intersection of early discovery and translational research, facilitating portfolio decisions in virology and immunology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EBV-driven pathways in disease-relevant cellular models.
- Supports biological de-risking by providing consistent viral stocks for hypothesis testing.
- Facilitates functional target validation in EBV-associated tumorigenesis studies.
Screening & Assay Development
- Provides validated EBV preparations for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative outputs through real-time PCR-based viral genome measurement.
- Supports scalable production of viral stocks for compound screening and mechanistic assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying EBV pathogenesis and immune responses.
- Ensures continuity from in vitro discovery to in vivo preclinical validation using standardized viral inputs.
- Reduces biological variability in translational biomarker and therapeutic agent development.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying reproducible EBV stocks for mechanistic studies, assay development, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in EBV-related disease models.
- Screening: Delivers assay-ready viral preparations with quantitative genome copy outputs.
- Analytics: Provides real-time PCR data for precise viral quantification and condition comparison.
- Translational Research: Enables risk-adjusted advancement of EBV-targeted interventions using standardized viral inputs.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for EBV stock preparation across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EBV research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable viral stock preparation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency in EBV-focused portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of EBV-related discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, virology, and quantitative PCR analysis.
- Needs access to cell culture facilities, centrifugation equipment, and real-time PCR instrumentation.
- Demands cross-team standardization of viral induction and quantification protocols.
- Adaptation may be needed for different EBV strains or alternative cell lines.
- Dependent on optimization of induction conditions for maximal viral yield and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:36
Preparing the Plate for Culture
1:49
Induction and Isolation of Epstein-Barr Virus Particles
2:45
DNA Extraction from Viral Particles
4:45
Checking DNA Concentration and Purity
5:34
Quantification by Real-Time Polymerase Chain Reaction
7:54
Results: Cell Counting and Induction of P3HR-1 Cells with PMA and DMSO
8:48
Conclusion
