Name: 符合当代无菌技术、麻醉和镇痛标准的改良小鼠异位心脏移植方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学习改良小鼠异位心脏移植技术，结合现代无菌操作、麻醉与镇痛标准，用于提升显微外科技能并研究移植免疫学。该模型经济可重复，适用于基因修饰小鼠品系，为心脏移植排斥反应和移植物存活机制研究提供可靠平台。

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作者谨向西澳大利亚大学和哈里·珀金斯医学研究所的动物护理团队表示衷心感谢，他们的奉献精神和专业技能为这些手术的可行性和成功实施提供了重要保障。

本研究严格遵循《科学用途动物护理与使用行为规范》15 进行，并已获得动物伦理协议 RA/3/100/1568 和 AE173 的批准（分别由西澳大利亚大学动物伦理委员会和哈里·珀金斯医学研究所动物伦理委员会审批）。有关本方案中使用的所有材料、仪器和动物的详细信息，请参见材料表。
1. 手术动物的准备
注意：在整个手术过程中，人员需专职负责手术操作或麻醉监护，不得兼任。
<ol>
	<li>术前镇痛时，至少在受体小鼠手术开始前1小时，皮下注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg，用0.9%氯化钠稀释至0.03 mg/mL）。将所有与药物使用相关的细节，包括药物剂量、给药时间及其效应，记录于麻醉记录表中。 
	注意：由于供体手术为非复苏性手术，器官获取后供体将在全身麻醉下立即实施安乐死，因此供体无需进行此步骤。</li>
	<li>麻醉诱导
	<ol>
		<li>将小鼠置于麻醉呼吸系统的诱导舱内，以1–2 L·min−1的氧气流速和4%异氟烷进行诱导。通过观察小鼠是否出现卧倒、翻正反射消失以及呼吸频率降低等表现，确认麻醉深度足够。</li>
		<li>当小鼠达到充分麻醉状态后，将其从诱导舱中取出，并使用电动剪毛器仔细剃除腹部腹侧的毛发。对于供体，剃毛区域应从生殖器延伸至胸腹交界上方；对于受体，剃毛区域应从生殖器延伸至肋缘。在两种情况下，均需确保剃毛区域向外侧延伸至腋中线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为维持麻醉状态，将小鼠置于仰卧位，通过呼吸系统鼻罩（非重复呼吸系统）持续吸入麻醉气体和氧气，氧气流速为1 L·min−1，异氟烷浓度为1.5%–2.5%。 
	注意：手术操作台为加热垫上的手术板，小鼠四肢使用微孔胶带固定。</li>
	<li>由于难以全面监测小鼠麻醉过程中相关的生理变化，需监测并记录有限的关键参数。在整个麻醉期间，至少每5分钟监测并记录一次体温、麻醉深度和呼吸频率。
	<ol>
		<li>为防止严重低体温或高体温（由加热垫主动加热引起），需在整个手术过程中持续监测体温。将一支清洁并润滑过的直肠探头插入动物直肠，随后用微孔胶带将其固定于手术板上。 
		注意：该探头连接至动态温控系统（麻醉输送系统的功能之一），可自动调节加热垫温度以维持小鼠体温稳定。</li>
		<li>由负责麻醉的人员通过观察足爪或尾部对无创镊子施加压力的反应、眼睑反射及肌张力来评估麻醉深度。</li>
		<li>通过观察胸壁运动并主观评估呼吸用力程度以判断潮气量。测量呼吸频率时，计数10–15秒内的呼吸次数，并分别乘以6或4，换算为每分钟呼吸次数（次/分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为准备皮肤，使用无菌棉签对术区进行消毒。以手术部位为中心，采用由内向外的环形方式涂抹氯己定。重复此过程3次（每次使用新的无菌棉签），最后再使用一支新的无菌棉签，以相同方式涂抹氯己定与乙醇的混合液，同样由术区中心向边缘操作。</li>
	<li>术者在穿戴无菌手术衣和无菌外科手套之前，应先使用含乙醇的手部消毒凝胶进行手部消毒。</li>
	<li>为建立无菌手术区域，将两块已预裁为25 cm × 25 cm的无菌手术巾分别置于手术板两侧，作为放置无菌器械的区域。使用无菌剪刀在一块25 cm × 40 cm的无菌大单上开窗，剪出一个略大于切口部位的椭圆形开口。将此大单覆盖于动物体表，使开窗部位对准预定切口位置。确保该第三块手术巾的两侧边缘分别与两侧较小的手术巾重叠，以形成连续的无菌手术区域。</li>
</ol>
2. 供体手术
注意：供体手术的关键步骤参见补充图 S1。
<ol>
	<li>在手术双目显微镜的辅助下进行供体手术。开始时使用8倍放大倍率，用手术刀片（#23）行腹正中皮肤切口。确保切口从剃毛区域的尾端延伸至肋缘，两端均保留完整的一段已准备好的皮肤边缘。 
	注意：初始放大倍率为8倍，以便在手术开始时充分观察受试动物的宏观结构。此后，放大倍率由操作者根据需要自行调整，应选择适当的倍率，以在低倍率提供的整体视野与高倍率下可观察到的精细结构之间取得平衡。</li>
	<li>使用两根无菌棉签，蘸取预热的生理盐水，将小肠移开，暴露腹主动脉和下腔静脉（IVC）。用棉签钝性分离这些血管与其周围组织。</li>
	<li>使用3.0 mL注射器配30 G、0.5英寸针头，抽取2.5 mL浓度为100 IU·mL−1的肝素化0.9%氯化钠溶液（该溶液在手术前需保持在4 °C）。用非优势手持直头圆体缝合镊夹住膈下区域的腹主动脉，优势手将1.5 mL溶液朝向心脏方向注入主动脉。用棉签压迫穿刺口以封闭主动脉切口。</li>
	<li>使用直头显微手术剪剪断下腔静脉，以实现放血。</li>
	<li>使用手术剪行胸廓切开术，在双侧腋中线处各做一切口。此时确认动物死亡，并关闭异氟烷蒸发器。</li>
	<li>用微型止血钳夹住胸壁形成的中段组织并固定。将此部分交由非无菌手术助手，使用微孔手术胶带将其固定于鼻罩上。 
	注意：目的是对该段胸壁施加牵引力，以利于心脏组织的暴露。</li>
	<li>使用圆体缝合镊识别并游离胸内段下腔静脉。 
	注意：理想情况下，直头镊应由非优势手持握，弯头镊由优势手持握。</li>
	<li>用非优势手的镊子固定下腔静脉，优势手将剩余的1.5 mL浓度为100 IU·mL−1的肝素化0.9%氯化钠溶液注入心脏。</li>
	<li>使用两把镊子，用一段长2 cm的7/0编织丝线结扎下腔静脉。采用器械打结法打外科结，并额外加两圈以确保牢固。打结位置应尽可能靠近心脏端。</li>
	<li>用动脉夹固定该结扎线的两端。将动脉夹放置在适当位置，使其对心脏施加轻柔的尾向牵引力，以便为后续解剖提供最佳的血管定位。</li>
	<li>在心脏前上方识别胸腺。使用镊子将该器官从供体中钝性分离，以暴露上腔静脉（SVC）。</li>
	<li>用镊子去除上腔静脉的外膜及周围组织。使用弯头镊钝性分离，在血管后方建立一个小通道。确保该通道尽可能靠近心脏。</li>
	<li>用镊子将一段长2 cm的7/0编织丝线穿过该通道，然后采用前述方法打结固定。</li>
	<li>在距离该结扎点约2 mm处（远离心脏一侧），使用弯头显微手术剪剪断上腔静脉。</li>
	<li>使用棉签将心脏翻转至解剖学右侧。</li>
	<li>在心脏解剖学左侧识别奇静脉。使用镊子将其从周围结构中钝性分离。同前，使用弯头镊在该血管后方建立一个小通道。</li>
	<li>使用第三段长2 cm的7/0编织丝线，采用相同的打结技术，在尽可能靠近心脏的位置结扎奇静脉。在远离心脏一侧、距离结扎点2 mm处剪断该血管。</li>
	<li>使用棉签将心尖部轻轻翻回解剖学左侧。使用镊子识别并游离升主动脉。将弯头镊置于主动脉弓下方，在升主动脉与降主动脉之间建立一个通道。</li>
	<li>使用直头显微手术剪，在主动脉弓分支近端处将其剪断。</li>
	<li>使用镊子识别并游离肺动脉。使用弯头镊在血管后方建立一个通道。</li>
	<li>使用直头显微手术剪，在肺动脉分叉近端处将其剪断。</li>
	<li>使用Rycroft灌注导管，经肺动脉和升主动脉缓慢注入2 mL浓度为10 IU·mL−1的肝素化0.9%氯化钠溶液，以冲洗心脏内残留的血液。 
	注意：冲洗充分的标志是冠状血管中可见血液完全清除。</li>
	<li>使用一段长3 cm的7/0编织丝线，采用外科结加两圈的方法，整体（en bloc）结扎剩余的后部血管（肺静脉）。使用手术剪小心剪断，将心脏从后侧胸壁分离。</li>
	<li>轻柔地将心脏从胸腔取出，浸入威斯康星大学溶液（UWS）中，随后置于冰上保存（4 °C）。</li>
</ol>
3. 受体手术
<ol>
	<li>在按照第1节所述完成动物准备后，涂抹眼用润滑剂。沿预定切口部位的腹侧腹部皮下组织，注射按体重计算的布比卡因剂量（8 mg/kg）（0.25%浓度用0.9%氯化钠溶液稀释至0.625 mg/mL）。使用29 G胰岛素注射器进行注射，并观察是否形成一条清晰可见的线状隆起，该隆起应覆盖预定切口的整个范围补充图 S2A-C). 
	注：五至七&#160;应给予足够时间（数分钟）以达到药物的峰值效应&#160;局部麻醉药</li>
	<li>使用无菌手术刀片（#23），在显微镜8倍放大条件下沿腹侧正中线做皮肤切口。确保剖腹切口从下腹部延伸至肋缘。插入牵开器以充分暴露手术视野（补充图 S2D).</li>
	<li>用预热的0.9%氯化钠溶液浸润一块5 cm × 5 cm的无菌纱布，将其置于手术部位上方。用湿润的无菌棉签轻轻将肠管还纳，放置于该纱布之上，并将纱布包裹住器官补充图 S3A). 
	注意：该操作有助于减少术中非显性液体丢失，并有助于组织牵拉。</li>
	<li>使用钝性分离技术游离并松解腹主动脉和下腔静脉周围的组织。此步骤可结合使用棉签和圆头缝合镊。确保分离范围位于肾下血管区域至腹主动脉分叉上方之间补充图 S3B). 
	注意：在此阶段进行适当的可视化操作将有助于实现高质量的血管吻合。</li>
	<li>识别腹后部血管。使用镊子轻轻牵拉主动脉，使其远离脊柱方向（即沿腹血管轴线纵向牵拉）。 
	注意：由于下腔静脉较脆，操作时应仅处理主动脉，避免触碰下腔静脉。</li>
	<li>结扎计划吻合区域中辨认出的每一条腹腔血管。使用弯钳在每侧腹腔血管后方由头侧向尾侧分离，于血管两侧分别建立通道。对以这种方式辨认并游离的每条血管，使用10/0尼龙线进行结扎，用器械打成外科结并多绕一个结扣。补充图 S3C).</li>
	<li>将吻合部位与循环隔离。为此，先在腹部血管的头端、再在尾端放置外科血管夹（重要的是，必须严格按照此顺序）。确保血管夹充分交叉夹闭两条血管，以实现完全阻断。</li>
	<li>用非优势手持镊子固定主动脉，使用30 G针头在主动脉前壁做主动脉切开。随后用直头显微外科剪刀扩大切口。补充图 S3D).</li>
	<li>进行静脉切开术。使用直血管钳，在与主动脉切口中部对齐的位置，对下腔静脉（IVC）施加轻柔的前向牵引。采用弯型显微外科剪刀，使其凹面朝向前方，切除一段与主动脉切口等长的下腔静脉节段。补充图 S4A).</li>
	<li>使用 10 IU·mL−1 肝素化氯化钠溶液，冲洗已打开血管内残留的血液。</li>
	<li>将供体心脏置于腹腔内，确保其位置使升主动脉紧邻腹主动脉切口，同时旋转心脏，使肺动脉能够被牵拉至对侧以完成第二次吻合。</li>
	<li>使用10/0尼龙线，在主动脉切口的12点位置与升主动脉管腔的相应末端之间缝置一根固定缝线。使用直头镊子和显微外科持针器完成缝合，并以外科结加三重打结方式结扎。剪断线尾，留取约2 mm长度。</li>
	<li>在主动脉切口6点位置与升主动脉相应部位之间放置第二根固定缝线。由于该缝线还将作为后续连续缝合的基点，需预留至少10 mm的线尾以备最终打结。</li>
	<li>以10/0尼龙线连续缝合，自下而上缝合主动脉切口的解剖学右缘与升主动脉相应的游离缘。此缝线约打四个结。</li>
	<li>将缝线的自由端绕过远端的固定缝线，然后在解剖学左侧沿剩余的主动脉切口游离缘继续进行第二次连续缝合，以实现对合。使用外科结加两个额外结扣，将缝线与线尾打结固定。</li>
	<li>在下腔静脉切口的12点位置与肺动脉管腔的相应末端之间放置一根固定缝线。</li>
	<li>从该锚定点开始，沿肺动脉解剖左侧边缘与静脉切口相应边缘之间，连续向下进行连续缝合。此段缝合平均使用四个结，随后在静脉切口6点钟位置与肺动脉管腔对应端点之间缝合一针。再进行四次缝合，将肺动脉与静脉切口的最后游离边缘拉拢对合。</li>
	<li>使用器械打结法，以方结加两道额外结扣的方式，将缝线的自由端与锚定端结扎固定。</li>
	<li>使用棉签将心脏重新定位至腹腔中央位置。检查血管是否存在扭曲，以免影响血流。</li>
	<li>将凝胶泡沫置于所有缝合线上补充图 S4B将两块约2 mm的材料放置于其周围并塑形，确保覆盖所有可见的缝合线。</li>
	<li>松开血管夹：先松开尾侧夹，再松开头侧夹。由于可能会有少量出血，应预先将棉签置于吻合口处以提供压迫。</li>
	<li>一旦确认无可见泄漏，即对心脏进行搏动评估（补充图 S4C）。如果未出现此情况，应检查是否发生了心脏血管扭曲（尤其是下腔静脉）。</li>
	<li>将肠管重新置于心脏上方及周围。若肠管表面干燥，可用预热的氯化钠溶液湿润腹膜腔。</li>
	<li>使用不可吸收的6/0普理灵单丝缝线逐层缝合腹腔： 
	首先为肌层，然后是皮肤（补充图 S4D）。采用连续不间断技术。</li>
	<li>轻轻地将受体从手术板上取下，并移除麻醉。</li>
	<li>皮下注射1 mL温热生理盐水，将受体动物置于预先准备好的加温笼中，按照术后恢复方案进行观察（补充图 S4E).</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>手术后立即将受体动物置于干净的笼子中，放在加热垫上，并密切观察至少3小时。在此期间，至少每30分钟监测一次各项参数（活动度、身体姿势、毛发状况、面部表情、步态、呼吸、手术部位外观、腹部可触及的心搏）。对每项参数评分（0 = 正常，1 = 轻度或间歇性异常，2 = 中度或持续性异常）。 
	注意：当被监测参数的总和超过设定值时，将触发干预措施&#160;伦理协议中为此模型规定的福利评分</li>
	<li>将受体小鼠转移至保持在25 °C的温控柜中，直至术后第7天。术后前3天内，每天至少监测2次；剩余4天内，每天至少监测1次。术后镇痛处理：于手术当晚皮下注射一剂布托啡诺（0.5–0.1 mg/kg，用0.9%氯化钠稀释至0.03 mg/mL）给受体小鼠，之后在接下来的3个术后日内每日给药两次。</li>
	<li>从温育柜中取出后，至少每周监测受体动物两次，直至达到预定的实验终点。</li>
</ol>

<ol><li>Mann, F. C., Priestley, J. T., Markowitz, J., Yater, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+the+intact+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of the intact mammalian heart.</a> Archives of Surgery. 26 (2), 219-224 (1933).</li>
<li>Neptune, W. B., Cookson, B. A., Bailey, C. P., Appler, R., Rajkowski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+homologous+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22A.M.A.+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Complete homologous heart transplantation.</a> A.M.A. Archives of Surgery. 66 (2), 174-178 (1953).</li>
<li>Downie, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotransplantation+of+the+dog+heart%5BTitle%5D)+AND+%22A.M.A.+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Homotransplantation of the dog heart.</a> A.M.A. Archives of Surgery. 66 (5), 624-636 (1953).</li>
<li>Blanco, G., Adam, A., Rodriguezperez, D., Fernandez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+homotransplantation+of+canine+heart+and+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22A.M.A.+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Complete homotransplantation of canine heart and lungs.</a> A.M.A. Archives of Surgery. 76 (1), 20-23 (1958).</li>
<li>Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+heart+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for heart transplantation in the rat.</a> Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).</li>
<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primarily+vascularized+allografts+of+hearts+in+mice.+The+role+of+H-2D%2C+H-2K%2C+and+non-H-2+antigens+in+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Primarily vascularized allografts of hearts in mice. The role of H-2D, H-2K, and non-H-2 antigens in rejection.</a> Transplantation. 16 (4), 343-350 (1973).</li>
<li>Joffre, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+acute+and+chronic+allograft+rejection+with+CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+regulatory+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevention of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T lymphocytes.</a> Nature Medicine. 14 (1), 88-92 (2008).</li>
<li>Gregori, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+induced+by+1+alpha%2C25-dihydroxyvitamin+D3+and+mycophenolate+mofetil+treatment+mediate+transplantation+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells induced by 1 alpha,25-dihydroxyvitamin D3 and mycophenolate mofetil treatment mediate transplantation tolerance.</a> The Journal of Immunology. 167 (4), 1945-1953 (2001).</li>
<li>Niimi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+technique+for+heterotopic+cardiac+transplantation+in+mice%3A+Experience+of+3000+operations+by+one+surgeon%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Heart+and+Lung+Transplantation%22%5BJournal%5D)">The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: Experience of 3000 operations by one surgeon.</a> The Journal of Heart and Lung Transplantation. 20 (10), 1123-1128 (2001).</li>
<li>Hasegawa, T., Visovatti, S. H., Hyman, M. C., Hayasaki, T., Pinsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotopic+vascularized+murine+cardiac+transplantation+to+study+graft+arteriopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Heterotopic vascularized murine cardiac transplantation to study graft arteriopathy.</a> Nature Protocols. 2 (3), 471-480 (2007).</li>
<li>Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+in+aseptic+rodent+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Techniques in aseptic rodent surgery.</a> Current Protocols in Immunology. 82, 1-14 (2008).</li>
<li>Navarro, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+anesthesia%3A+The+art+and+science%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+Journal%22%5BJournal%5D)">Mouse anesthesia: The art and science.</a> ILAR Journal. , (2021).</li>
<li>Adams, S., Pacharinsak, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+anesthesia+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Mouse+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse anesthesia and analgesia.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 5 (1), 51-63 (2015).</li>
<li>Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. NHMRC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes">https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes</a> (2013).</li>
<li>Prosser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+to+tissue-resident+immunity+after+MHC-matched+and+MHC-mismatched+solid+organ+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes to tissue-resident immunity after MHC-matched and MHC-mismatched solid organ transplantation.</a> Cell Reports. 35 (7), 109141(2021).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

小鼠原位心脏移植模型是一种可靠的临床前模型，最初主要用于研究主要组织相容性复合体（MHC）不匹配对免疫排斥反应程度和性质的影响，而近年来则进一步用于研究移植对移植物组织驻留免疫的维持作用16。尽管该模型最初严格遵循Corry等7的实验方案，但我们已对该方案进行了优化，纳入了无菌操作技术、镇痛和麻醉方面的最佳实践标准。这些新实践的更新通过额外的培训、提供无菌外科手套、手术衣和手术铺巾、增加麻醉措施以及调整镇痛药物剂量来实现。这些改进导致手术准备时间略有增加，并提高了每次手术的额外成本。
在研究人员与动物伦理委员会（AEC）之间的合同允许下，可以使用动物来解决重要的研究问题，以维持开展此类工作的社会许可。AEC的决策基于明确的伦理准则15，其核心原则是权衡动物所承受的代价与社会所获得的益处。3R原则（减少、替代和优化）在降低项目对动物造成的影响方面至关重要。
通过采用适合物种的围手术期镇痛...

我们对免疫学和移植学的许多认识都源于基于动物实验模型的实体器官移植研究。自首次描述哺乳动物血管化心脏移植以来1，此类模型已在多个领域贡献了重要知识，包括低温疗法的治疗应用2、使用特殊缝合线的优势3，以及全肺和心脏同种移植的技术探索4。大鼠心脏移植模型的建立5,6，由于存在多种可选的育种品系，为免疫学实验提供了更广泛的研究空间。而近交系和突变小鼠品系的种类更为丰富，促使Corry等人7开发出小鼠异位心脏移植技术，以充分利用这些品系为移植研究带来的显著优势。该模型已被广泛应用，并促进了对移植物排斥反应8及治疗策略9的深入理解。然而，自该技术首次被描述以来，除了一些细微的技术调整（如吻合部位位置的优化）10,11，其基本操作流程基本保持不变。
自从将 Corry 等人7的技术整合到我们的实验中以来，我们发现了若干有望改进该实验方案的方面，主要包括无菌技术、麻醉和镇痛。在这些方面的改进预期将对实验结果产生积极影响，并提升实验动物的福利。此前已有研究表明，在小型动物手术中采用无菌技术有助于减少术后感染12，这不仅影响动物的发病率和死亡率，还可能干扰旨在评估移植手术后免疫反应的实验。从麻醉与镇痛的角度来看，采用优化的麻醉和镇痛方案有助于降低对动物的伤害，通过减轻实验动物的疼痛与痛苦，从而平衡该手术模型的伦理争议。此外，恰当的麻醉与镇痛可限制与疼痛相关的应激反应，提高术后恢复质量，并最终提升手术成功率13。
为了改善动物福利并提高实验结果的可靠性，本研究制定了一项经过调整的实验方案，以弥补现有不足。该方案借鉴了 Corry 等人最初描述的方法7，并在兽医麻醉师的指导下，充分考虑了麻醉与镇痛方案中所用药物干预措施的作用及其持续时间。该方法基于平衡麻醉和多模式镇痛的原则，以确保围手术期的适当护理14。除应用无菌技术外，预先给予阿片类药物布托啡诺和局部麻醉药布比卡因。全身麻醉采用吸入性麻醉剂异氟烷进行。

<table><tbody><tr><td>2030 Rycroft 灌注套管针 30 G</td><td>McFarlane</td><td>56005HU</td><td></td></tr><tr><td>编织外科丝线 7-0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯型动脉夹 - 35 mm&amp;nbsp;</td><td>Roboz</td><td>RS-7441-5</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 布比卡因&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 弯头持针器 -&amp;nbsp; 145 mm</td><td>Haag-Streit</td><td>11.62.15</td><td></td></tr><tr><td>5% 氯己定溶液</td><td>Ebos</td><td>JJ61371</td><td></td></tr><tr><td>棉签 - 7.5 cm</td><td>Dove</td><td>SN109510</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇溶液</td><td>Ebos</td><td>WH130192EE</td><td></td></tr><tr><td>白色纱布 5 x 5 cm</td><td>Aero</td><td>AGS50</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam 80 mm x 125 mm&amp;nbsp;</td><td>Pfizer</td><td>7481D</td><td></td></tr><tr><td>毛发剪刀</td><td>Wahl</td><td>9860L</td><td></td></tr><tr><td>肝素 1,000 IU/1 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris SuperCut 直剪 - 11.5 cm&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Inka Surgical&amp;nbsp;</td><td>11550.11</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷挥发器</td><td>Darvall</td><td>9176</td><td></td></tr><tr><td>微型动脉夹 - 3.7 cm</td><td>Greman</td><td>14119-G</td><td></td></tr><tr><td>弯头显微剪刀 105 mm&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropore 平纹纸质手术胶带 - 宽 2.5 cm</td><td>Ebos</td><td>7810L</td><td></td></tr><tr><td>显微外科剪刀 - 弯头尖端</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>单丝聚丙烯缝线 - 5/0</td><td>Surgipro</td><td>P-205-X</td><td></td></tr><tr><td>Myweigh i101 精密天平 100 g × 0.005 g</td><td>Myweigh</td><td>Kit00053</td><td></td></tr><tr><td>针头 - 30 G × 0.5 英寸</td><td>BD</td><td>BD304000</td><td></td></tr><tr><td>持针器 15 cm 弯型 &quot;超细&quot;</td><td>Surgical Specialists</td><td>ST-B-15-8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nylene 10/0 × 15 cm，配 3.8 mm 3/8 圆弧形锥形针（直径 0.07 mm）CV300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>弯型圆体缝线镊 0.3 mm × 120 mm</td><td>B. Braun</td><td>FD281R</td><td></td></tr><tr><td>直型圆体缝线镊 0.3 mm × 120 mm</td><td>B. Braun</td><td>FD280R</td><td></td></tr><tr><td>圆柄 Vannas 弹簧剪 - 直型/12.5 cm</td><td></td><td>15400-12</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪 - 小弯刃</td><td></td><td>15001-08</td><td></td></tr><tr><td>Stevens 剪刀 钝头直型 110 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>外科背板</td><td></td><td></td><td>刚性层压纸板，15 × 15 cm</td></tr><tr><td>手术单</td><td></td><td></td><td>裁成两种尺寸：25 cm × 25 cm 和 25 cm × 40 cm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>手术显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器 - 1 mL</td><td>BD</td><td>592696</td><td></td></tr><tr><td>注射器 - 3 mL</td><td>Leica</td><td>M651</td><td></td></tr><tr><td>有齿镊</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>威斯康星大学溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td></td><td></td><td>远红外加热垫 20 × 25 cm</td></tr><tr><td>Westcott 弹簧剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yasargil 钛夹施夹器（刺刀式）</td><td>Aesculap</td><td>FE582K</td><td></td></tr><tr><td>Yasargil 钛夹 永久型 6.6 mm</td><td>Aesculap</td><td>A19FT222T</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;小鼠使用&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;品系/性别/体重&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;供体&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;受体&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c，雌性，19–23 g</td><td>7</td><td>21</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6，雌性，17–20 g</td><td>7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD45.1 BALB/c，雌性，17–21 g</td><td>5</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种改良的小鼠异位心脏移植方案，符合当代无菌技术、麻醉与镇痛标准

A Modified Murine Heterotopic Heart Transplant Protocol Matching Contemporary Standards of Aseptic Technique, Anesthesia, and Analgesia

动物心脏移植实验模型的建立推动了免疫学和实体器官移植领域的诸多进展。尽管异位血管化小鼠心脏移植模型最初主要用于研究不同近交系小鼠组合间的移植排斥反应，但随着基因工程小鼠品系和治疗手段的可及性提高，该模型可提供强有力的新型临床前研究视角。从根本上说，该技术的外科手术方法自建立以来并未发生改变，尤其是在无菌操作、麻醉和镇痛等对术后发病率和死亡率具有显著影响的重要因素方面。此外，围手术期管理水平的提升有望同时改善动物福利和实验结果。本文报告了一项与兽医麻醉领域专家合作开发的实验方案，重点描述了该手术技术在围手术期管理方面的细节。同时，我们还讨论了这些优化措施的意义，并详细介绍了该手术关键步骤的故障排除方法。

为了评估手术技术在促进伤口愈合和小鼠恢复方面效果的有效性，实验室早期实验确定了具有不同免疫原性的多种心脏移植物的存活特征。这些移植物包括同源近交系（n = 5）和同系（n = 5）移植物，它们与受体具有相同的主要组织相容性复合体（MHC）标志物；以及主要错配移植物（n = 9），其移植物与受体具有不同的MHC标志物。我们通过直接触诊异位腹腔心脏搏动来评估移植物的持续功能和存活状态，该指标可作为排斥反应与耐受性的替代标志。
在两个对照组中，所有移植物在100天的实验终点时均存活（平均值未定义）。错配组的平均存活时间为9天。图1展示了Kaplan-Meier生存曲线，显示了错配移植物与对照组心脏移植物在存活率上的显著差异16。这些数据提示，该技术足以在手术后促进适当的愈合反应。然而，在存在病理性炎症的情况下（本实验中表现为错配条件下移植物的排斥反应），组织破坏将导致功能迅速丧失。
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本文介绍了一种改良的异位血管化心脏移植技术，并更新了无菌操作、镇痛和麻醉方法。

动物心脏移植实验模型的建立推动了免疫学和实体器官移植领域的诸多进展……

这是一种经济且可重复的心脏移植模型。该模型既可用于提高显微外科手术技能，也可允许使用基因修饰小鼠品系作为供体或受体。该技术广泛涵盖了常规人类手术中的所有疼痛管理和麻醉复杂性，以限制术后并发症的发生。该模型对于研究手术诱导的免疫反应、错配对移植排斥的影响以及移植器官的长期存活至关重要。该模型的常规外科手术方法可经适当修改后应用于其他小鼠实体器官移植。由于操作在显微尺度下进行，且存在相应的时间限制，因此容错空间很小。成功的关键在于在专业监督下进行定期练习，并针对难点提供具体的反馈。本次操作演示由本实验室研究助理刘 Liu 女士进行。手术操作的协助人员包括黄 Wen Hua 博士、Jas Kaur 女士和张 Xiao 女士。将小鼠麻醉并从诱导室中取出后，使用剃毛器紧贴皮肤剃除腹部腹侧的毛发。对于供体小鼠，剃毛区域应从外生殖器延伸至腹侧胸部上缘。确保剃毛区域向外侧延伸至腋中线。通过将清洁并涂有润滑剂的直肠探头插入动物直肠内，并使用微孔胶带将其固定在手术板上，以监测体温。通过观察足爪或尾部对有创镊子施加压力的反应、眼睑反射以及肌张力来评估麻醉深度。观察胸壁运动以测量呼吸频率，同时观察呼吸用力情况以评估潮气量，然后按照文稿中所述方法计算呼吸频率。使用无菌棉签对手术部位进行消毒后，以手术部位中心为起点，向边缘环形涂抹氯己定三次，随后以相同方式涂抹氯己定与乙醇的混合液。通过在手术板两侧放置无菌手术单，准备无菌手术区域，用于摆放无菌器械。在手术单上剪开一个较小的椭圆形开口后，将带窗手术单置于预定切口部位。 按照之前演示的方法准备动物后，涂抹眼用润滑剂。沿预定切口位置，使用29号胰岛素注射器在腹侧腹部皮下注射按体重计算剂量的布比卡因，并观察是否形成一条覆盖整个预定切口范围的可见线状隆起。随后，在8倍放大条件下，使用无菌手术刀片沿腹正中线做皮肤切口。确保剖腹切口从下腹部延伸至肋缘。插入拉钩以充分暴露手术视野。用预热的0.9%氯化钠溶液浸湿无菌纱布条，置于手术区域上方。现在，使用湿润的无菌棉签轻轻去除肠管内容物。将肠管置于纱布上方，并用纱布包裹该器官。结合使用棉签和圆头缝合镊，采用钝性分离技术，游离并松解腹主动脉和下腔静脉周围的组织。确保分离区域位于肾下血管段与腹主动脉分叉之间。确定腹后部血管后，使用镊子将腹主动脉轻轻牵拉，使其远离脊柱方向。用弯镊在这些血管两侧沿头尾方向分离，从腹主动脉后方通过，建立通道。使用10-0尼龙线将计划吻合区域中已识别并游离的每条血管进行结扎，用器械打成外科结并多绕一个结。通过在腹侧血管的头端和尾端放置血管夹，将吻合部位与血液循环隔离。确保血管夹交叉夹闭两条血管足够长度，以实现完全阻断。用非优势手持镊子固定主动脉。使用30号针头在主动脉前壁做主动脉切开。用直头显微外科剪刀延长主动脉切口。进行静脉切开术时，使用直血管钳对下腔静脉施加轻柔的前向牵引，牵引点应与主动脉切口的中点对齐。使用弯显微外科剪刀，凹面朝向前方，切除与主动脉切口等长的一段下腔静脉。用肝素化氯化钠溶液冲洗开放血管内的残留血液。将供体心脏置于腹腔内，确保升主动脉紧邻腹主动脉切口，并旋转心脏，使肺动脉能够被牵拉至合适位置以进行第二次吻合。使用10-0尼龙线，在主动脉切口的12:00位置与升主动脉管腔相应末端之间缝合一针固定线。使用直头镊子夹持显微外科持针器，以三重结打结（外科结），然后剪断线尾，保留约两毫米长的缝线。在主动脉切口的6:00位置与升主动脉相应部位之间放置第二根固定缝线。由于该缝线还将作为后续连续缝合的基线，因此需留出至少10毫米的线尾以备最终打结。使用10-0尼龙线连续缝合，自下而上缝合主动脉切口的解剖学右缘与升主动脉相应的游离缘。仔细进行此操作，该缝合线约打四个结。在缝合第二针连续缝合线至解剖左侧之前，先将缝线的自由端绕过远端的固定缝线，以使主动脉切口剩余的游离边缘对合。最后用外科结打结，再加两个结，将缝线与线尾结扎固定。在下腔静脉、静脉切口的12:00位置与肺动脉管腔的相应末端之间放置一根固定缝线。从此锚定点开始，精细地在肺动脉的解剖学左侧边缘与静脉切口的对应边缘之间进行连续走行缝合。将缝针穿过静脉切口的6:00位置以及肺动脉管腔的相应末端。以递进方式，将针穿过肺动脉剩余的游离边缘及切口解剖右侧。此缝线通常打四个结，然后将肺动脉和切口的最终游离边缘拉拢。将缝线的游离端与锚定端打结，并使用器械打一个外科结，再加两个结，最后剪除多余的线头。检查血管有无扭曲，以免影响血流。将明胶海绵置于缝合线处。在周围放置两块约两毫米的明胶海绵，并塑形，确保覆盖所有可见的缝合线。从肾动脉钳开始，随后松开头侧钳，逐步释放血管夹。由于预计会有少量出血，应提前将棉签置于吻合口处以提供压迫。在处理完可见的渗漏后，检查心脏是否有搏动。若发现缺失，应检查心脏血管是否发生扭曲，然后将肠管重新放置于心脏上方及周围；若腹膜腔显得干燥，可用预热的氯化钠溶液润湿。采用连续不间断缝合技术，先缝合肌肉层，再缝合皮肤，使用不可吸收的6-0聚丙烯单丝线关闭腹腔。待受体动物从手术板上移下并脱离麻醉后，皮下注射1毫升温热的生理盐水，并将其置于已准备好的饲养笼中，给予保温，按照术后恢复规程进行观察。在同系和同源异位小鼠心脏移植中，术后100天内观察到完全恢复和接受。然而，在主要不匹配的异位小鼠心脏移植中，术后7天即观察到快速排斥反应。进行吻合时，必须始终注意缝线在手术区域内的位置。若不这样做，可能导致结构严重受损或缝线缠绕。这些显微外科分离与吻合技术也广泛适用于其他小型哺乳动物手术模型，包括异位肾移植和原位肝移植，使研究人员能够研究移植物排斥反应。

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Research

科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

符合当代无菌技术、麻醉和镇痛标准的改良小鼠异位心脏移植方案

小鼠异位心脏移植模型已被众多研究者证实为研究排斥反应和免疫应答机制的重要方法。然而，相关技术操作仍具挑战性。通过改进标准技术，我们已成功完成超过1000例移植手术。...

小鼠异位心脏移植

小鼠颈部心脏移植模型非常适合用于免疫学以及缺血再灌注损伤的研究。我们采用了一种无缝线套管技术对该手术方法进行了改良，并利用该技术成功完成了1000多例移植手术。<br...

采用改良套管技术的小鼠颈部心脏移植模型

本文演示了一种小鼠心脏异位移植的显微外科技术，包括简化的供体心脏获取和受体血管吻合方法。...

一种改良的小鼠异位心脏移植方法

该论文描述了在小鼠中进行异位心脏移植所需的步骤。...

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套管技术通过避免对小血管进行技术难度较高的缝合吻合，从而缩短并简化了小鼠异位颈部心脏移植模型的建立过程。本视频论文中展示的技术细节应有助于研究人员在其实验室中成功建立该模型。...

小鼠异位颈部心脏移植

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小鼠心脏移植袖套法的技术优化

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在本实验方案中，采用小鼠心脏移植模型来研究心脏同种异体移植物排斥反应的机制。在此异位心脏移植模型中，通过改良的套管技术进行颈部端对端吻合式心脏移植，可提高手术效率，并确保心脏移植物的存活。...

一种改良的套管法小鼠颈部异位心脏移植模型

小鼠心脏移植模型是研究移植免疫学的重要研究工具。本方案详细介绍了小鼠异位颈部心脏移植技术，该技术涉及在受体的颈总动脉和供体的肺动脉干上放置套管，以实现层流血流。...

利用血管套环的小鼠异位颈部心脏移植

本方案介绍了一种简化的、端对侧缝合吻合技术，用于小鼠颈部心脏移植，为研究移植免疫学提供了一个稳定且可重复的模型。...

采用端侧吻合技术进行颈部异位小鼠心脏移植以研究移植免疫学

学习改良小鼠异位心脏移植技术，结合现代无菌操作、麻醉与镇痛标准，用于提升显微外科技能并研究移植免疫学。该模型经济可重复，适用于基因修饰小鼠品系，为心脏移植排斥反应和移植物存活机制研究提供可靠平台。

一种改良的小鼠异位心脏移植方案，符合当代无菌技术、麻醉与镇痛标准

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