Name: 太平洋水母干细胞样细胞的荧光原位杂交和5-乙炔基-2-脱氧尿苷标记 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习使用荧光原位杂交和EdU标记技术，在太平洋水母Cladonema pacificum中可视化干细胞样细胞及其增殖状态。该方法可区分增殖与非增殖干细胞，为发育生物学和再生研究提供单细胞水平的干细胞异质性分析工具。

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本工作由日本医疗研究开发机构（AMED）资助，资助编号为JP22gm6110025（受资助人：Y.N.），以及日本学术振兴会（JSPS）科研费资助，资助编号为22H02762（受资助人：Y.N.）。

注意：有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的详细信息，请参见材料表。
1. 探针合成
<ol>
	<li>RNA 提取
	<ol>
		<li>使用剪去尖端的 3.1 mL 转移移液管，将三只在人工海水（ASW）中培养的活体 Cladonema 水母放入 1.5 mL 离心管中，并尽可能去除多余的 ASW。 
		注：ASW 是通过将矿物盐混合物溶解于添加了氯中和剂的自来水中制备而成；最终比重（S.G.）为 1.018，或千分比（ppt）约为 27。</li>
		<li>将 1.5 mL 离心管置于液氮中冷冻，以抑制 RNase 活性。加入已添加 2-巯基乙醇（每 100 µL 裂解缓冲液中加入 1 µL）的总 RNA 提取试剂盒中的裂解缓冲液 30 µL，并使用匀浆器在裂解缓冲液中充分匀浆样品。 
		注：为避免缓冲液和样品从管中溢出，建议使用少量裂解缓冲液进行匀浆。</li>
		<li>加入 570 µL 裂解缓冲液，并按照总 RNA 提取试剂盒的操作说明提取总 RNA（图 1）。</li>
		<li>使用分光光度计测定所提取 RNA 的浓度，并于 −80 °C 保存直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>cDNA 合成
	<ol>
		<li>使用试剂盒，以从水母中提取的总 RNA 为模板合成 cDNA（图 1 和 表 1）。</li>
		<li>在 65 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>迅速在冰上冷却。</li>
		<li>使用步骤 1.2.1 所得混合物进行 cDNA 合成（表 1）。通过移液充分混匀，并在 42 °C 下孵育 60 分钟。</li>
		<li>在 95 °C 下孵育 5 分钟。</li>
		<li>迅速在冰上冷却。</li>
		<li>使用分光光度计测定合成 cDNA 的浓度，并于 −20 °C 或更低温度下保存直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PCR 产物合成
	<ol>
		<li>为构建 PCR 模板，使用 Primer-BLAST 设计特异性引物。参考序列来源于 NCBI 数据库或 RNA-seq 数据。 
		注：本方案所用引物详见 材料表。</li>
		<li>为扩增目标序列，采用无需限制性内切酶的 TA 克隆法。为获得在 3' 端添加腺嘌呤的 PCR 产物，使用以下程序：98 °C 预变性 2 分钟；进行 35 个循环（98 °C 变性 10 秒，55–60 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 1 分钟）。反应中使用 Taq DNA 聚合酶（表 1）。 
		注：确定 PCR 条件时，应参考所用 DNA 聚合酶配套说明书，其中通常提供推荐的退火温度和延伸时间。</li>
		<li>将 PCR 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，切下目标条带。使用凝胶回收试剂盒从切下的凝胶中回收 PCR 产物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接
	<ol>
		<li>将带有 3' 胸腺嘧啶突出端的载体与 PCR 产物通过混合试剂（表 1）进行连接，并在 37 °C 下孵育 30 分钟（图 1）。 
		注：载体与 PCR 产物的分子比应为 1:&#62;3。pTA2 载体大小约为 3 kb。若 PCR 产物（插入片段）长度为 A（kb），浓度为 B（ng/µL），则所需插入片段体积（表 1 中的 X）可按以下公式计算：([50 ng 载体 × A kb 插入片段])/(3 kb 载体 × [1/3]) = 50·A ng 插入片段。若插入片段浓度为 B ng/µL，则取体积为 50·A/B µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转化与涂板
	<ol>
		<li>进行转化时，将感受态细胞在冰上解冻，并分装为每份 20 µL。加入含 PCR 产物的质粒 1 µL（不超过感受态细胞体积的 5%），涡旋 1 秒。冰上孵育 5 分钟，随后在 42 °C 下孵育 45 秒，再涡旋 1 秒。</li>
		<li>向感受态细胞中加入 180 µL 含分解代谢抑制的超级优化肉汤（SOC 培养基，一种营养丰富的细菌培养基），在 37 °C 下孵育 30 分钟。30 分钟后，将菌液涂布于含有氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷（X-gal）和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的琼脂平板上，在 37 °C 下孵育 12–16 小时（图 1）。 
		注：X-gal 和 IPTG 用于筛选蓝色和白色菌落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液体培养
	<ol>
		<li>从平板上的白色和蓝色菌落中挑选一个白色菌落，接种至含氨苄青霉素的 3–5 mL LB 培养基中，在 37 °C 下振荡培养 12–16 小时（图 1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒小提
	<ol>
		<li>使用质粒小提试剂盒从 LB 培养基中提取质粒（图 1）。</li>
		<li>使用分光光度计测定质粒浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测序
	<ol>
		<li>为读取质粒的 DNA 序列，将质粒送交进行 Sanger 测序，然后使用软件将其与基因组/转录组序列比对，以确认目标序列是否正确合成，并判断目标序列插入质粒的方向（5' 到 3' 或 3' 到 5'）。 
		注：若目标序列从靠近 3' 端的 RNA 聚合酶结合位点起以 5' 到 3' 方向插入，则可通过 体外 转录生成反义探针。若目标序列以相反的 3' 到 5' 方向插入，则可生成正义探针（阴性对照）。若使用如 pTA2 等载体，可根据实验目的选择两个不同的转录结合位点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 转录
	<ol>
		<li>通过使用位于质粒中 RNA 聚合酶结合位点外侧的引物（例如 T7/T3 结合位点）对构建好的质粒进行 PCR，制备 DNA 模板（图 1）。 
		注：可使用 M13-20 正向引物和 M13 反向引物等通用引物制备包含 RNA 聚合酶结合位点的 DNA 模板。</li>
		<li>PCR 扩增后，使用凝胶/PCR 回收试剂盒纯化模板。</li>
		<li>混合如下所示的试剂，并在 37 °C 下进行转录反应 3 小时（图 1 和 表 1）。</li>
		<li>加入 1.5 µL DNase，在 37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
		<li>加入 10 µL 无 RNase 水，使用纯化柱从转录反应液中纯化探针。</li>
		<li>取 1 µL 产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，检测合成 RNA 的大小，并使用分光光度计测定其浓度。 
		注：合成的 RNA 探针浓度应至少达到 100 ng/µL。</li>
		<li>加入 30 µL 甲酰胺，于 −20 °C 或更低温度下保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. EdU 掺入与固定
<ol>
	<li>使用 3.5 mL 移液管将 Cladonema 水母（每管 5–10 只）放入 1.5 mL 离心管中，并加入人工海水（ASW）至总体积为 500 µL。加入 7.5 µL 的 10 mM EdU 储存液，在 22 °C 下孵育 1 小时（图 2）。EdU 的终浓度为 150 µM。 
	注意：使用孵化后 5–7 天的水母以观察主触手第三分支的形成（图 3A）。水母从水螅体脱离的当天记为第 1 天，通常在第 5 天开始出现第三分支。</li>
	<li>孵育 1 小时后，尽可能吸除含有 EdU 的人工海水（ASW）。</li>
	<li>为麻醉水母，加入 H2O 配制的 7% MgCl2，孵育 5 分钟。</li>
	<li>去除 H2O 中的 7% MgCl2，在 4 °C 下用含 4% 多聚甲醛（PFA）的人工海水（ASW）过夜（O.N.）固定水母（图 2）。 
	注意：若进行 FISH 实验而不掺入 EdU，可在麻醉后（步骤 2.3–2.4）参照 EdU 处理样本的方式进行固定。</li>
</ol>
3. 荧光  原位 杂交
<ol>
	<li>蛋白酶处理与后固定
	<ol>
		<li>去除PFA，用含0.1% Tween-20的PBS（PBST）清洗样品，每次10分钟，共3次。每次使用300-500 µL PBST。 
		注意：从本步骤开始至杂交结束，实验应在无RNase的环境中进行，操作者需佩戴手套和口罩。本步骤所用的1×PBS必须使用DEPC处理过的水配制。杂交完成后，可使用未经DEPC处理的水配制1×PBS。某些原位杂交（ISH）和荧光原位杂交（FISH）方案采用甲醇梯度脱水步骤，以便将固定后的样品在−20 °C保存至后续使用。为避免不必要的操作，本方案省略了脱水步骤，因为样品在PBST中可保存数天。</li>
		<li>固定后，除抗DIG-POD抗体过夜孵育步骤（步骤3.4.2）外，将样品置于1.5 mL离心管中并在摇床上进行后续操作。清洗后，向样品中加入PBST配制的10 mg/mL蛋白酶K储存液，使终浓度为10 µg/mL，在37 °C孵育10分钟。</li>
		<li>移除蛋白酶K溶液，用PBST清洗样品2次，每次1分钟。</li>
		<li>进行后固定：加入含4% PFA的1×PBS，在37 °C孵育15分钟。</li>
		<li>移除PFA溶液，用PBST清洗样品2次，每次10分钟。 
		注意：若目标基因表达量高且背景信号低，可省略步骤3.1.2–3.1.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>杂交
	<ol>
		<li>移除PBST，加入杂交缓冲液（HB缓冲液，表1）。在室温（RT）下孵育15分钟。每管使用300–400 µL HB缓冲液，足以保证杂交充分进行。 
		注意：HB缓冲液、洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2均使用20× SSC母液配制。HB缓冲液应储存于−20 °C或更低温度，使用前需恢复至室温。</li>
		<li>移除HB缓冲液，加入新鲜HB缓冲液，在杂交炉中55 °C预杂交至少2小时。</li>
		<li>移除HB缓冲液，加入含有步骤1.9.7中保存探针的HB缓冲液（探针终浓度：0.5–1 ng/µL），在杂交炉中55 °C孵育18–24小时（图2）。 
		注意：FISH信号强度和特异性受目标基因表达水平、探针长度及特异性影响。为增强信号强度，可调整杂交时间（18–72小时）或温度（50–65 °C），并测试不同探针。为避免非特异性信号，可优化蛋白酶K处理的浓度和时间19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>探针去除
	<ol>
		<li>移除含探针的HB缓冲液，加入洗涤缓冲液1（表1）。在55 °C用洗涤缓冲液1清洗样品2次，每次15分钟。每次使用300–400 µL洗涤缓冲液。 
		&#8203;注意：含探针的HB缓冲液可重复使用约十次。无需丢弃，使用后应储存于−20 °C或更低温度。使用前将洗涤缓冲液1、洗涤缓冲液2、2× SSC和PBST预热至55 °C。</li>
		<li>移除洗涤缓冲液1，加入洗涤缓冲液2（表1）。在55 °C用洗涤缓冲液2清洗样品2次，每次15分钟。</li>
		<li>移除洗涤缓冲液2，加入2× SSC。在55 °C用2× SSC清洗样品2次，每次15分钟。</li>
		<li>移除2× SSC，加入预热的PBST。在室温下用PBST清洗1次，每次15分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗DIG抗体孵育
	<ol>
		<li>移除PBST，加入1%封闭缓冲液。在摇床上缓慢振荡，室温孵育至少1小时。 
		注意：通过稀释5%封闭缓冲液母液（表1）新鲜配制1%封闭缓冲液。在进行下一步抗体反应前检查样品，因振荡可能导致样品粘附于管盖背面或管壁。</li>
		<li>封闭完成后，移除1%封闭缓冲液，加入抗DIG-POD溶液（1:500，溶于1%封闭缓冲液），4 °C过夜孵育（图2）。 
		注意：孵育时间应控制在12–16小时内，以避免出现非特异性信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DIG标记探针的检测
	<ol>
		<li>移除抗DIG-POD溶液，加入Tris-NaCl-Tween缓冲液（TNT，表1）。在室温下用TNT清洗样品3次，每次10分钟。 
		注意：使用酪胺信号放大（TSA）技术可显著提高辣根过氧化物酶标记试剂（如抗DIG-POD）的成像分辨率。</li>
		<li>将荧光染料偶联的酪胺（Cy5-酪胺）母液用扩增稀释缓冲液按1:50稀释，制备活性Cy5-酪胺工作液（图2）。</li>
		<li>尽可能吸尽TNT，加入活性Cy5-酪胺溶液。避光孵育10分钟。</li>
		<li>避光条件下用PBST清洗样品3次，每次10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EdU检测 
	注意：EdU试剂盒可将掺入的EdU检测为荧光信号（图2）。
	<ol>
		<li>配制EdU检测混合液，各组分比例见表1。每个样品使用100 µL EdU检测混合液。 
		注意：将10×反应缓冲液添加剂用超纯水稀释10倍，制备1×反应缓冲液添加剂。</li>
		<li>移除PBST，加入EdU检测混合液。避光孵育30分钟。</li>
		<li>避光条件下用PBST清洗3次，每次10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA染色
	<ol>
		<li>将Hoechst 33342用PBST按1:500稀释，制备Hoechst染色液。移除PBST，加入Hoechst染色液。避光孵育30分钟（图2）。</li>
		<li>避光条件下用PBST清洗样品3–4次，每次10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>封片
	<ol>
		<li>在载玻片上制作围堰以防止样品被压碎。将乙烯基胶带贴于载玻片上，并挖去中心部分形成空腔。</li>
		<li>使用剪去枪头的3.1 mL移液器将水母转移至载玻片上的围堰内。 
		注意：避免触手相互重叠。</li>
		<li>用P200移液器吸除残留PBST，缓慢加入70%甘油作为封片介质（图2）。 
		注意：可使用抗荧光淬灭封片剂替代70%甘油，以防止荧光信号衰减.</li>
		<li>用镊子轻轻将盖玻片覆盖在样品上，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		<li>若不立即进行显微镜观察，应将载玻片置于4 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像
	<ol>
		<li>使用激光共聚焦显微镜采集图像。为获得单细胞分辨率，建议使用40倍油镜或更高倍数的物镜。</li>
		<li>图像采集后，使用ImageJ/FIJI软件打开图像，并利用多点工具对EdU+和/或 Nanos1+&#160;的细胞进行计数20.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

增殖细胞和干细胞在形态发生、生长和再生等多种过程中是重要的细胞来源21,22。本文描述了一种在枝螅水母（Cladonema）中通过FISH对干细胞标志物Nanos1进行染色并结合EdU标记的共染方法。以往利用EdU或BrdU标记的研究表明，增殖细胞主要定位于触手 bulbs16,17，但其分子特征尚不明确。本研究实现了增殖细胞分布与Nanos1+类干细胞定位的同步检测（图4）。结果显示，部分增殖细胞表达Nanos1，而另一些细胞仅被EdU标记且不表达Nanos1，提示存在干细胞异质性，或可能存在其他类型的增殖细胞。未来进一步解析在枝螅（Cladonema）的不同生物学过程（包括触手分支、组织稳态、器官再生以及生殖细胞维...

刺胞动物门被认为是一个基底分支的多细胞动物门类，其动物具有神经和肌肉组织，这使其在理解动物发育和生理进化方面处于独特地位1,2。刺胞动物分为两大类：珊瑚虫纲（例如海葵和珊瑚）仅具有浮浪幼虫和固着生活的水螅体阶段；而水母亚门（包括水螅纲、十字水母纲、钵水母纲和立方水母纲的成员）通常具有自由游泳的水母体，即水母，同时也具有浮浪幼虫和水螅体阶段。刺胞动物通常表现出很强的再生能力，其潜在的细胞机制，特别是成体干细胞和增殖细胞的存在，已受到广泛关注3,4。最初在Hydra中发现的水螅纲干细胞位于外胚层上皮细胞之间的间隙区域，通常被称为间质细胞或i细胞3。
水螅类i-细胞具有一些共同特征，包括多能性以及广泛保守的干细胞标志物的表达（例如， Nanos、Piwi、Vasa）以及迁移潜能3,5,6,7,8作为功能性干细胞，i-细胞广泛参与水螅类动物的发育、生理活动及环境响应，这证明了其具有高度的再生能力和可塑性3尽管类似于i细胞的干细胞在水螅类以外尚未被发现，即使在已确立的模式物种中也是如此 Nematostella增殖细胞仍参与体细胞组织以及生殖系的维持与再生9由于刺胞动物的发育与再生研究主要在水螅型动物上进行，例如 水螅，绿螅 和 Nematostella水母物种中干细胞的细胞动力学及其功能在很大程度上仍未得到研究。
水螅水母 Clytia hemisphaerica 是一种世界性分布的水母物种，栖息地遍布全球，包括地中海和北美洲，已被广泛用作多个发育生物学和进化生物学研究中的实验模式动物10。由于体型小、易于操作且卵子较大，Clytia 适合实验室培养，也便于引入转基因和基因敲除等遗传操作工具——这些技术 recently 已建立11，为深入分析水母生物学背后的细胞与分子机制提供了可能。在 Clytia 水母的触手部位，间充质细胞（i-cells）定位于近端区域，称为球部（bulb）；而前体细胞（如刺丝胞母细胞，nematoblasts）则在分化为包括刺细胞（nematocytes）在内的多种细胞类型的过程中，向远端迁移12。
在水母 Clytia 口管（manubrium）再生过程中，存在于生殖腺中的 Nanos1+ 间质细胞（i-cells）会迁移至因损伤而缺失口管的区域，并参与口管的再生过程7。这些发现支持了 Clytia 中的间质细胞同样具有功能性干细胞的特性，能够参与形态发生和再生过程。然而，由于间质细胞的特性在水螅型动物（如 Hydra 和 Hydractinia）中存在差异3，水母不同物种间干细胞的特征与功能也可能具有多样性。此外，除 Clytia 外，其他水母物种的实验技术手段仍十分有限，有关增殖细胞和干细胞的详细动态尚不清楚13。
水螅水母 Cladonema pacificum 是一种新兴的模式生物，可在实验室环境中培养，且无需使用水泵或过滤系统。Cladonema 水母具有分枝的触手，这是枝螅水母科（Cladonematidae）的常见特征，其外胚层靠近球状结构处具有一种称为眼点的感光器官14。触手的分枝过程发生在触手近轴侧出现的新分枝位点处。随着时间推移，触手持续伸长并产生分枝，较老的分枝逐渐被推向触手顶端15。此外，Cladonema 的触手在截断后数天内即可再生。近期研究表明，增殖细胞和类干细胞在 Cladonema 触手的分枝与再生过程中发挥重要作用16,17。然而，尽管传统原位杂交（in situ hybridization, ISH）已被用于可视化 Cladonema 中的基因表达，但由于其分辨率较低，目前仍难以在细胞水平上详细观察干细胞的动态行为。
本文介绍了一种通过荧光原位杂交（FISH）结合EdU共染色来可视化Cladonema中类干细胞的方法，其中EdU是细胞增殖的标记物18。我们利用FISH技术可视化干细胞标志物Nanos1的表达模式5,17，从而在单细胞水平上确定类干细胞的分布。此外，Nanos1表达与EdU标记的共染色可进一步区分出处于活跃增殖状态的类干细胞。该同时监测类干细胞和增殖细胞的方法可广泛应用于Cladonema的触手分支、组织稳态及器官再生等多个研究领域，类似方法也可推广至其他水母物种。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Wako</td><td>137-06862</td><td></td></tr><tr><td>3.1 mL 移液管</td><td>Thermo Scientific</td><td>233-20S</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-4-氯-3-吲哚基-&amp;beta;-D-半乳糖吡喃糖苷（X-Gal）</td><td>Wako</td><td>029-15043</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG-POD</td><td>Roche</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Cladonema pacificum Nanos1&lt;/em&gt; 正向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGAGACACAGTCATTATCAAGC&lt;br/&gt; GA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Cladonema pacificum Nanos1&lt;/em&gt; 反向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CGACGTGTCCAATTTTACGTGCT -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Cladonema pacificum Piwi&lt;/em&gt; 正向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA&lt;br/&gt; AGGC -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Cladonema pacificum Piwi&lt;/em&gt; 反向引物</td><td></td><td></td><td>5&amp;rsquo;- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA&lt;br/&gt; CTGGC -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Click-iT EdU 细胞增殖成像试剂盒，Alexa Fluor 488 染料</td><td>Invitrogen&amp;nbsp;</td><td>C10337</td><td>EdU 试剂盒</td></tr><tr><td>Coroline off</td><td>GEX Co. ltd</td><td>N/A</td><td>氯中和剂</td></tr><tr><td>DIG 核酸检测试剂盒封闭试剂</td><td>Roche</td><td>11175041910</td><td>封闭缓冲液&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>DIG RNA 标记混合物&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;ECOS&lt;/em&gt; 感受态细胞 DH5&amp;alpha;</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-06233</td><td>感受态细胞</td></tr><tr><td>Fast gene 凝胶/PCR 提取试剂盒</td><td>Fast gene</td><td>FG-91302</td><td>凝胶提取试剂盒</td></tr><tr><td>Fast gene 质粒小提试剂盒</td><td>Fast gene</td><td>FG-90502</td><td>质粒小量制备</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>068-00426</td><td></td></tr><tr><td>猪来源肝素钠盐</td><td>SIGMA-ALDRICH&amp;nbsp;</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D(-)-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）</td><td>Wako</td><td>096-05143</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td>琼脂平板</td></tr><tr><td>LB 肉汤基础</td><td>Invitrogen</td><td>12780-052</td><td>LB 培养基</td></tr><tr><td>马来酸</td><td>Wako</td><td>134-00495</td><td></td></tr><tr><td>mini Quick spin RNA 柱</td><td>Roche</td><td>11814427001</td><td>纯化柱</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop OneC 微量紫外-可见分光光度计（带 Wi-Fi）</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>聚氧乙烯（20）失水山梨醇单月桂酸酯（Tween-20）</td><td>Wako&amp;nbsp;</td><td>166-21115</td><td></td></tr><tr><td>PowerMasher 2</td><td>nippi&amp;nbsp;</td><td>891300</td><td>匀浆器</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Nacarai Tesque&amp;nbsp;</td><td>29442-14</td><td></td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>74004</td><td>总 RNA 提取试剂盒</td></tr><tr><td>RQ1 无 RNase 的 DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>20 倍盐溶液柠檬酸钠缓冲液粉末（20x SSC）</td><td>TaKaRa</td><td>T9172</td><td></td></tr><tr><td>SEA LIFE</td><td>Marin Tech</td><td>N/A</td><td>矿物质盐混合物</td></tr><tr><td>T3 RNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA 聚合酶&amp;nbsp;</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>TAITEC HB-100</td><td>TAITEC</td><td>0040534-000</td><td>杂交孵育器</td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq&amp;nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Taq DNA 聚合酶</td></tr><tr><td>TaKaRa PrimeScript 2 1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; 链 cDNA 合成试剂盒</td><td>TaKaRa</td><td>6210A</td><td>cDNA 合成试剂盒</td></tr><tr><td>Target Clone</td><td>TOYOBO&amp;nbsp;</td><td>TAK101</td><td>pTA2 载体</td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>TSA Plus 花青素 5</td><td>AKOYA Biosciences</td><td>NEL745001KT</td><td>酪胺信号放大（TSA）技术</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>激光共聚焦扫描显微镜</td></tr></tbody></table>

荧光 原位 水螅水母中类干细胞的杂交与5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记 cladonema pacificum

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

刺胞动物门包括海葵、珊瑚和水母，表现出多样的形态和生活方式，体现在固着生活的水螅体和自由游动的水母体中。这一点在已建立的模式生物中尤为明显，例如 水螅 和 Nematostella，干细胞和/或增殖细胞参与刺胞动物水螅体的发育与再生。然而，大多数水母（尤其是其水母体阶段）中这些过程的潜在细胞机制仍不明确，因此，建立一种可靠的特定细胞类型鉴定方法至关重要。本文介绍了一种用于可视化水螅水母中具有干细胞特征的增殖细胞的实验方案 Cladonema pacificum. 枝螅 水母具有分枝的触手，这些触手在整个成体阶段持续生长并保持再生能力，为研究由增殖细胞和/或干细胞样细胞调控的细胞机制提供了一个独特的平台。整体荧光标记 原位 利用干细胞标记物进行荧光原位杂交（FISH），可检测类干细胞；通过5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）脉冲标记（S期标记物），可识别增殖细胞。结合FISH与EdU标记技术，我们能够在固定样本动物中检测处于活跃增殖状态的类干细胞，该方法可广泛应用于其他动物，包括非模式水母物种。

Cladonema 触手已被用作研究形态发生和再生过程中细胞活动的模型15,16,17触手结构由一个上皮管构成，其中干样细胞或称i-细胞位于近端区域，称为触手球；新的分支沿球体远端区域的近轴侧后端依次添加图3A)15先前的报道表明，通过EdU或BrdU标记，细胞增殖在触手基部和新的分枝位点均较为活跃。16,17。然而，由于分辨率的 原位 杂交，目前尚不清楚干细胞样细胞是否真正具有增殖活性。为了在细胞水平上同时可视化干细胞样细胞和增殖细胞，我们对干细胞标志物进行了荧光原位杂交（FISH）Nanos1 或 Piwi以及对同一样本中S期细胞进行EdU标记。
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在此，我们描述了一种用于可视化水母中具有干细胞特性的增殖细胞的实验方案 枝螅整体荧光标记 原位 利用干细胞标志物进行杂交可检测类干细胞，5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记则可用于鉴定增殖细胞。结合两种方法，可检测处于活跃增殖状态的类干细胞.&#160;

荧光 原位 水螅水母中类干细胞的杂交与5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记 Cladonema pacificum

刺胞动物门包括海葵、珊瑚和水母等，表现出多样的形态和生活方式，这些特征体现在固着生活的水螅体和……

通过Nanos1表达与EdU标记的共染色，可以区分出活跃增殖的干细胞样细胞。我们能够在水母Cladonema中以单细胞水平确定干细胞样细胞的分布。我们可在同一样本中同时可视化干细胞样细胞和增殖细胞，从而能够检测增殖性和非增殖性干细胞样细胞，有助于理解干细胞的异质性。利用包含干细胞的动物模型进行发育生物学和再生研究。水螅水母纲物种太平洋枝螅水母（Cladonema pacificum）是一种新兴的模式生物，可在无需特殊系统的实验室环境中长期培养。枝螅水母具有分枝的触手。分支发生在触手近轴侧的新位点上。随着时间推移，触手持续伸长并产生分支，较老的分支逐渐被推向顶端。触手在截除后数天内也可再生。体型小、易于操作，且具有成体干细胞或干细胞样细胞，这使得枝螅（Cladonema）成为研究干细胞在不同过程中作用的理想体系。首先，使用3.5毫升移液管将枝螅水母放入1.5毫升离心管中，并加入人工海水（ASW），使总体积达到500微升。加入7.5微升10毫摩尔/升的EdU储备液，在22摄氏度条件下孵育1小时。等待一小时，并尽可能移除含有 EdU 的人工海水。将水母麻醉后，孵育五分钟。使用含 4% 多聚甲醛的人工海水在 4 摄氏度下固定水母过夜。进行蛋白酶处理和后固定时，去除多聚甲醛，用含有0.1% Tween 20的PBS溶液洗涤样品，每次10分钟，共洗涤三次。去除PBST，加入杂交缓冲液。将样品在杂交缓冲液中于室温孵育15分钟。移除杂交缓冲液，加入新鲜的杂交缓冲液。在杂交孵育器中于55摄氏度预杂交至少两小时。移除杂交缓冲液，加入含有探针的杂交缓冲液进行孵育。在杂交孵育箱中于 55 摄氏度下杂交 18 至 24 小时。随后，进行探针去除步骤。首先移除含有探针的杂交缓冲液，然后加入洗涤缓冲液一。用洗涤缓冲液在 55 摄氏度下洗涤样品两次，每次 15 分钟。移除洗涤缓冲液一，加入洗涤缓冲液二。用洗涤缓冲液二在 55 摄氏度下洗涤样品两次，每次 15 分钟。移除洗涤缓冲液二，然后加入2X SSC。在55摄氏度下，用2X SSC洗涤样本两次，每次15分钟。移除2X SSC，然后加入预热的PBST。在室温下用PBST清洗样品15分钟。进行抗DIG抗体孵育时，先移除PBST，然后加入1%封闭缓冲液。在室温下缓慢振荡孵育样品至少一小时。封闭后，移除1%封闭缓冲液。加入抗DIG-POD溶液，并在4摄氏度下孵育样品过夜。为检测DIG标记的探针，移除抗DIG-POD溶液，加入Tris-氯化钠-Tween缓冲液。用三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-Tween缓冲液在室温下洗涤样品，每次10分钟，共洗涤三次。将荧光染料偶联的酪胺储备液用扩增稀释缓冲液稀释，配制活性Cy5酪胺溶液。尽可能去除三羟甲基氨基甲烷-氯化钠-Tween缓冲液，然后加入活性Cy5酪胺溶液。将样品在避光条件下孵育10分钟。在避光条件下用PBST洗涤样品，每次10分钟，共洗涤三次。为配制EdU检测混合液，混合各组分。移除 PBST，然后加入 EdU 检测混合液。将样品在避光条件下孵育 30 分钟。在避光条件下用 PBST 洗涤三次，每次 10 分钟。进行DNA染色时，将Hoechst用PBST稀释以配制Hoechst溶液。移除PBST，然后加入Hoechst溶液。将样品在避光条件下孵育30分钟。在避光条件下用 PBST 洗涤样品 3 至 4 次，每次 10 分钟。接下来进行封片：用剪去尖端的移液器将水母转移至载玻片上的凹槽中。用镊子轻轻将盖玻片盖在水母上，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。Nanos1 表达与 EdU 阳性细胞的共标记揭示了触手部位类干细胞和增殖细胞的空间分布模式。EdU 阳性细胞在触手球部更广泛分布，而 Nanos1 阳性细胞则在触手球部及新生分支位点局部富集，表明类干细胞与增殖细胞的不同分布取决于发育时期和不同阶段。EdU 与 Nanos1 的共标记在 19.79% 的细胞中被观察到，提示这些细胞是一个活跃增殖的干细胞群体。有趣的是，在球茎中部和新分支位点处，有14.46%的细胞表现为EdU阳性而Nanos1阴性，提示存在非干细胞样但具有增殖活性的细胞。相比之下，在球茎基部和新分支位点处，有26.32%的细胞表现为EdU阴性而Nanos1阳性，表明存在一类增殖缓慢或处于静息状态的干细胞群体，这类细胞无法通过EdU脉冲标记检测到。短时间孵育的EdU脉冲标记仅能检测干细胞样细胞和非干细胞样细胞中的增殖细胞。通过改变 EdU 的孵育时间并结合长时间追踪实验，可以标记出慢周期干细胞或其他细胞类型，包括子代细胞和分化细胞。

fluorescent-situ-hybridization-5-ethynyl-2-deoxyuridine-labeling-for

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

太平洋水母干细胞样细胞的荧光原位杂交和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记

整体原位杂交是发育生物学中最常用的技术之一。本文中，我们介绍一种高分辨率的双荧光原位杂交实验方案，用于分析单个基因的精确表达模式，并确定两个基因表达区域的重叠情况。我们同时包含碘化丙啶核复染步骤，以突出显示组织结构。...

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通过向未受精卵母细胞注射 mRNA 在文昌鱼（Branchiostoma lanceolatum）中表达荧光蛋白

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多靶标显色整体原位杂交 原位 杂交法用于比较基因表达区域 果蝇 胚胎

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活体或固定染色样本的光片荧光显微镜成像 赤拟谷盗 胚胎

本文描述了一种利用荧光标记的DNA探针对单个信使RNA（mRNA）转录本进行标记的方法，用于大肠杆菌（E.

单个细胞中转录本标记方法 大肠杆菌 用于单分子荧光的细胞 原位 杂交实验

本实验方案的目的是对已包埋于石蜡中并切片至载玻片上的成年珊瑚样品进行原位杂交。这是一种定性方法，用于在石蜡包埋的组织中可视化RNA反义探针的空间表达情况。...

原位杂交技术用于石蜡包埋的成年珊瑚样品

我们提出了一项分为两个部分的实验方案，该方案结合了荧光钙成像与原位杂交技术，使实验人员能够在单细胞水平上将钙活动模式与基因表达谱相关联。...

荧光钙成像与后续原位杂交用于神经前体细胞表征 Xenopus laevis

学习使用荧光原位杂交和EdU标记技术，在太平洋水母Cladonema pacificum中可视化干细胞样细胞及其增殖状态。该方法可区分增殖与非增殖干细胞，为发育生物学和再生研究提供单细胞水平的干细胞异质性分析工具。

荧光原位水螅水母中类干细胞的杂交与5-乙炔基-2'-脱氧尿苷标记 Cladonema pacificum

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