Name: 改进小鼠噪声性听力损失的实验条件及听力功能和外毛细胞损伤的评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学习使用C57BL/6J小鼠建立噪声性听力损失模型，通过ABR测量和耳蜗组织学分析评估听阈变化与外毛细胞损伤。该方法为研究听力损伤机制及优化治疗策略提供可靠框架。

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感谢中国台湾科技事务主管部门（MOST）的资助（MOST 110-2314-B-715-005，MOST 111-2314-B-715-009-MY3），以及马偕医学院院内研究经费的支持（MMC-RD-110-1B-P030，MMC-RD-111-CF-G002-03）。

本研究的动物实验已获得马偕医学院动物照护委员会的批准。八周龄雄性 C57BL/6J 小鼠购自国家实验动物中心（中国台湾新北市）。所有小鼠的繁殖和饲养均依照标准动物实验规范进行。
1. 小鼠噪声性听力损失的诱导
<ol>
	<li>准备实验小鼠的笼子
	<ol>
		<li>使用尺寸为 14 cm × 17 cm × 24 cm 的大鼠捕鼠笼。将四块瓦楞塑料板裁剪成合适大小，使其能够放入笼内（尺寸分别为 13 cm × 23 cm 和 13 cm × 16 cm）。</li>
		<li>为防止小鼠脚部被网格划伤，将其中两块塑料板分别置于笼底和后侧。另将剩余两块塑料板相互垂直交错放置，将笼内空间均分为四个区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在隔音箱中进行本实验。将扬声器置于笼子前方 8.5 cm 处，并将扬声器与笼子一同放入隔音箱内。</li>
	<li>打开 CLIO 应用软件</li>
	<li>将光标移至扬声器图标，然后点击 TwoSin。将 Freq 1 的值设为 1000 Hz，Freq 2 的值设为 6000 Hz，然后点击 OK 开始播放声音。</li>
	<li>在 Leq 选项卡下，将 dBV 更改为 dBSPL。在软件界面上设置好时间后，点击绿色三角形按钮开始播放声音。</li>
	<li>在扬声器正前方 8.5 cm 处放置一个麦克风，用于校准噪声水平（参见 补充文件 1）。将噪声水平调节至 125 dB SPL-A，并持续监测不少于 3 分钟，以确保噪声水平足够稳定。使用信号发生器、分析仪和放大器来生成并控制噪声。（图 1） 
	注意：此步骤应在隔音箱内进行，以避免对操作人员听力造成损伤。</li>
	<li>将四只雄性 C57BL/6J 小鼠放入笼内（每区一只），进行噪声暴露。在噪声暴露期间，随机分配各区域中的小鼠。将一个麦克风放置于笼子顶部，用于在噪声暴露过程中监测噪声水平（图 2）。 
	注意：此步骤应在隔音箱内进行，以避免对操作人员听力造成损伤。</li>
	<li>使小鼠连续 5 天每天暴露于 1 kHz 和 6 kHz 频率的噪声中，每次持续 6 小时。</li>
	<li>在噪声暴露后第 1 天（即第 6天）通过测量听觉脑干反应（ABR）来评估小鼠的听阈。在噪声暴露后第 1 周（即第 13天）再次重复 ABR 测量。完成 ABR 测量后，处死所有参与实验的小鼠并取出其耳蜗组织（图 3）。</li>
</ol>
2. 基于听觉脑干反应（ABR）的听力阈值评估
<ol>
	<li>使用专为小型动物设计的商用 ABR 检测系统10。</li>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠替来他明与唑拉西泮混合物（40 mg/kg）和赛拉嗪（9.3 mg/kg），以实现全身麻醉。 
	注意：ABR 评估过程约需 2 小时。务必通过加热垫提供保温支持，并涂抹眼膏以防止小鼠在麻醉期间眼睛干涩。</li>
	<li>在全身麻醉状态下测量小鼠的 ABR。将皮下针电极（12 mm）置于头顶、左耳耳廓后方以及尾部附近的背部，用于测量听觉阈值。</li>
	<li>使用放置在动物左耳 1 cm 处的扬声器呈现声学刺激。</li>
	<li>使用示波器控制声学刺激。选择正弦波作为刺激信号，将窗口刻度设为10 k。调节频率旋钮，以获得所需声学刺激频率。</li>
	<li>通过调节函数发生器上的AMLP旋钮来调整刺激强度。根据校准结果计算出合适的电压值，将AMLP旋钮调节至该电压，从而获得所需的刺激强度。</li>
	<li>在一系列刺激强度下（从 10 dB SPL 到 100 dB SPL，步长为 10 dB）采集 ABR 测量数据。 
	注意：在隔声室内进行听觉阈值测量。将采集信号中可辨识出明显 V 波的最低刺激强度定义为 ABR 阈值10,11（图 4）。完成 ABR 检测后，持续监测动物直至其从麻醉中恢复（约 1 小时）。</li>
</ol>
3. 显微镜检查
<ol>
	<li>固定收获的组织
	<ol>
		<li>完成ABR测量后，通过腹腔注射替来他明和唑拉西泮混合物（100 mg/kg）以及赛拉嗪（23.25 mg/kg）处死小鼠，以进行显微镜检查。</li>
		<li>从小鼠中取出耳蜗，并立即将其浸入10%甲醛（FA）中固定（每毫升含两个耳蜗），在4 °C下固定至少8小时。</li>
		<li>固定完成后，在4 °C条件下用10%乙二胺四乙酸（EDTA）溶液替换FA溶液，脱钙处理3-4天。随后用镊子逐一检查每个耳蜗，确认耳蜗已充分软化。</li>
		<li>将耳蜗置于盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，将螺旋状的柯蒂氏器（OC）（每个脱钙耳蜗）切成三段：基底回、中回和顶端回，用于组织染色。</li>
		<li>在解剖显微镜下（放大倍数：8x–35x），去除脱钙耳蜗的骨性结构（前庭阶、鼓阶和蜗轴），获取包括柯蒂氏器在内的软组织（厚度约40 µm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>耳蜗免疫荧光染色
	<ol>
		<li>封闭液的配制：在PBS中配制含2%牛血清白蛋白（BSA）和0.2% Triton X-100的溶液。</li>
		<li>将待染色的组织从培养皿转移至微量离心管中，加入0.1 mL封闭液，在室温（RT）下孵育2小时。</li>
		<li>Myo7A一抗溶液的配制：用封闭液按1:200的体积比稀释Myo7A一抗。</li>
		<li>在微量离心管中加入100 µL Myo7A一抗溶液处理组织，在室温下孵育2小时。</li>
		<li>用PBS清洗组织三次，每次5分钟。</li>
		<li>Myo7A二抗（Myo7A-Rb-488）和鬼笔环肽抗体（phalloidin-594）溶液的配制：用封闭液分别按1:400稀释Myo7A二抗，按1:200稀释鬼笔环肽抗体。</li>
		<li>加入100 µL Myo7A二抗与鬼笔环肽抗体混合溶液处理组织，在室温下孵育2小时。</li>
		<li>抗体与鬼笔环肽抗体处理后，用PBS清洗组织三次，每次5分钟。</li>
		<li>使用剪去尖端的1 mL塑料移液枪头，将清洗后的组织从微量离心管转移至盛有PBS的培养皿中。</li>
		<li>为进行显微镜观察，将组织展开后放置于载玻片上，滴加15 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）封片荧光介质，完全覆盖组织。轻轻盖上盖玻片，于室温下静置过夜，再用指甲油封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集
	<ol>
		<li>使用正置荧光显微镜及图像采集软件获取二维图像。</li>
		<li>进行显微观察前，将组织置于视野中央，并将感光度调整为ISO 100。首先点击软件中的自动模式按钮初步设定曝光时间，然后点击调整按钮手动微调，以优化信噪比。</li>
		<li>通过旋转荧光滤块调节入射光波长，以激发不同荧光染料。采用伪彩色标记不同荧光标签的发射光（蓝光：DAPI；绿光：Myo7A；红光：鬼笔环肽）。</li>
		<li>扫描组织样本，生成并采集图像数据，保存为.tif和.jpg格式的图像文件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>World Report on Hearing. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481">https://www.who.int/publications/i/item/9789240020481</a> (2021).</li>
<li>Fernandez, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+synaptopathy+with+and+without+sensory+cell+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear synaptopathy with and without sensory cell loss.</a> Neuroscience. 427, 43-57 (2020).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+X-linked+inhibitor+of+apoptosis+protein+protects+against+noise-induced+hearing+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of X-linked inhibitor of apoptosis protein protects against noise-induced hearing loss in mice.</a> Gene Therapy. 18 (6), 560-568 (2011).</li>
<li>Takeda, S., Mannström, P., Dash-Wagh, S., Yoshida, T., Ulfendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+aging+and+noise+exposure+on+auditory+brainstem+responses+and+number+of+presynaptic+ribbons+in+inner+hair+cells+of+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Effects of aging and noise exposure on auditory brainstem responses and number of presynaptic ribbons in inner hair cells of C57BL/6J mice.</a> Neurophysiology. 49 (5), 316-326 (2017).</li>
<li>Rouse, S. L., Matthews, I. R., Li, J., Sherr, E. H., Chan, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+stress+response+inhibition+provides+sex-dependent+protection+against+noise-induced+cochlear+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated stress response inhibition provides sex-dependent protection against noise-induced cochlear synaptopathy.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18063(2020).</li>
<li>Amanipour, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+mice%3A+Effects+of+high+and+low+levels+of+noise+trauma+in+CBA+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+International+Conference+of+the+IEEE+Engineering+in+Medicine+and+Biology+Society%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in mice: Effects of high and low levels of noise trauma in CBA mice.</a> Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2018, 1210-1213 (2018).</li>
<li>Edderkaoui, B., Sargsyan, L., Hetrick, A., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+duffy+antigen+receptor+for+chemokines+ameliorated+cochlear+damage+from+noise+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deficiency of duffy antigen receptor for chemokines ameliorated cochlear damage from noise exposure.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 173(2018).</li>
<li>Hultcrantz, M., Simonoska, R., Stenberg, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+hearing%3A+a+summary+of+recent+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oto-laryngologica%22%5BJournal%5D)">Estrogen and hearing: a summary of recent investigations.</a> Acta Oto-laryngologica. 126 (1), 10-14 (2006).</li>
<li>Tsai, S. C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intravenous+administration+of+skin-derived+mesenchymal+stem+cells+ameliorates+hearing+loss+and+preserves+cochlear+hair+cells+in+cisplatin-injected+mice%3A+SMSCs+ameliorate+hearing+loss+and+preserve+outer+hair+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The intravenous administration of skin-derived mesenchymal stem cells ameliorates hearing loss and preserves cochlear hair cells in cisplatin-injected mice: SMSCs ameliorate hearing loss and preserve outer hair cells in mice.</a> Hearing Research. 413, 108254(2022).</li>
<li>Choi, M. Y., Yeo, S. W., Park, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+restoration+in+a+deaf+animal+model+with+intravenous+transplantation+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+human+umbilical+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Hearing restoration in a deaf animal model with intravenous transplantation of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 427 (3), 629-636 (2012).</li>
<li>Yu, S. -K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+evaluation+of+ribbon+synapses+at+specific+frequency+regions+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional evaluation of ribbon synapses at specific frequency regions of the mouse cochlea.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59189(2019).</li>
</ol>

无利益冲突需披露。

噪声性听力损失可分为两种类型：暂时性噪声性听力损失，表现为听阈的一过性偏移；以及永久性噪声性听力损失，其特征是听阈发生永久性偏移。我们在第6天观察到的听力损失th 天（噪声暴露后1天）被认为由这两种类型共同构成。在此情况下，由于听力损失的时间相关成分，听力阈值会随时间推移逐渐恢复。在我们前期的实验研究中，采用相同实验装置和动物所获得的结果显示，由2天噪声暴露引起的听力损失在2周内完全恢复，表明并未产生永久性噪声性听力损失（NIHL）。相反，本研究中由5天噪声暴露引起的听力损失被认为包含永久性成分，因为在第13天时，其听力阈值仍显著高于对照组水平th 天（噪声暴露后1周）。
当前方案的一个局限性在于，我们使用在12 kHz处检测到的听力阈值来代表小鼠的低频听力阈值，该频率对应于耳蜗的顶端回。严格来说，耳蜗顶端回对4 kHz至8 kHz的声刺激更为敏感12。然而，这一局限性几乎不会降低本研究及该方案的价值，因为所提供的方案详细描述了所有操作步骤，并列出了建模过程中所涉及的设备。文中提供的大多数参...

全球约有13亿人因噪声暴露而遭受听力损失1。本研究旨在建立一套清晰、逐步的操作流程，用于诱导并确认噪声性听力损失（NIHL）。NIHL 是由于毛细胞（HCs）和螺旋神经节神经元（SGNs）的退化或破坏、毛细胞静纤毛的损伤，和/或耳蜗内毛细胞与螺旋神经节神经元之间突触的丧失所导致。此类异常除了引起噪声性听力损失外，还可能导致耳鸣以及言语感知能力下降（尤其是在复杂的声学环境中）。这些生理缺陷可能相继影响个体的社会功能、心理状态和认知功能2,3,4,5,6。
在基于小鼠的噪声性听力损失（NIHL）相关临床前研究中，最常用的小鼠品系为 CBA/CaJ2,3,6,7 和 C57BL/64,5,8。此外，雄性3,4,7 小鼠的使用频率高于雌性小鼠，因为雌激素对听力具有保护作用。因此，本研究中仅使用雄性小鼠9。在参考相关文献后，我们选择 1 kHz 和 6 kHz 作为施加噪声的频率。施加噪声的强度为 115 dB SPL-A（笼子周围）至 125 dB SPL-A（笼子中心）。将实验小鼠连续 5 天、每天持续暴露于噪声中 6 小时后，听阈出现理想程度的升高，表明实验小鼠已成功建立理想程度的噪声性听力损失（NIHL）模型。有关动物操作、实验装置搭建以及噪声暴露的全部步骤，均在所提供的实验方案中进行了清晰的逐步描述。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;1/4&quot; CCP 自由场标准麦克风套装</td><td>GRAS</td><td>428158</td><td>用于噪声暴露</td></tr><tr><td>放大器输入模块 AMI100D</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>生物放大器 BIO100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>SIGMA</td><td>A9647</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>Cellsens 软件</td><td>Olympus life science</td><td></td><td>图像采集</td></tr><tr><td>波纹塑料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI 荧光封片剂</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>SIGMA</td><td>E5134</td><td>脱钙</td></tr><tr><td>诱发电位放大器 ERS100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>APLHA</td><td>F030410</td><td>耳蜗固定</td></tr><tr><td>高性能数据采集系统 MP160</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>模块化扩展电缆 MEC110C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>Myo7A 一抗</td><td>Proteus</td><td>25-6790</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>Myo7A 二抗</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>针状电极，单极 12 mmTp，EL452</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>鬼笔环肽抗体</td><td>Alexa Fluor</td><td>A12381</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>SIGMA</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>鼠笼式捕鼠笼</td><td></td><td></td><td>14 cm × 17 cm × 24 cm</td></tr><tr><td>ROMPUN-赛拉嗪注射液&amp;nbsp;</td><td>Bayer HealthCare, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>声音放大器 MT-1000</td><td>unika</td><td></td><td>用于噪声暴露</td></tr><tr><td>声学信号发生器/分析仪/杂项 FW-02</td><td>CLIO</td><td>620300719</td><td>用于噪声暴露</td></tr><tr><td>隔音室</td><td>IEA Electro-Acoustic Technology</td><td></td><td>用于噪声暴露和听觉脑干反应</td></tr><tr><td>扬声器&amp;nbsp;</td><td>IEA Electro-Acoustic Technology</td><td></td><td>用于噪声暴露</td></tr><tr><td>刺激模块 STM100C</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>耳管耳机套装 OUT101</td><td>BIOPAC</td><td></td><td>用于听觉脑干反应</td></tr><tr><td>正置显微镜 BX53</td><td>Olympus</td><td></td><td>图像采集</td></tr><tr><td>赛拉嗪（Zoletil）</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估

Modified Experimental Conditions for Noise-Induced Hearing Loss in Mice and Assessment of Hearing Function and Outer Hair Cell Damage

噪声性听力损失（NIHL）的动物模型对于病理学家、治疗师、药理学家以及听力研究人员深入理解NIHL的发病机制，并进一步优化相应的治疗策略具有重要意义。本研究旨在建立一种改进的小鼠NIHL模型构建方案。实验采用雄性C57BL/6J小鼠，在未麻醉状态下连续5天、每天6小时暴露于高强度噪声（1 kHz和6 kHz纯音同时呈现，声压级为115–125 dB SPL-A）。在噪声暴露后1天和1周，通过听觉脑干反应（ABR）评估小鼠的听觉功能。ABR检测完成后，处死小鼠并取其耳蜗柯蒂氏器进行免疫荧光染色。ABR检测结果显示，噪声暴露1天后小鼠出现显著的听力损失。暴露1周后，实验组小鼠的听阈下降至约80 dB SPL，仍显著高于对照组小鼠（约40 dB SPL）。免疫荧光成像结果表明，外毛细胞（OHCs）出现损伤。综上所述，我们成功利用雄性C57BL/6J小鼠建立了NIHL模型，并研制并应用了一种新型且简单的纯音噪声发生与传递装置。通过听阈的定量测定以及外毛细胞损伤的形态学验证，均表明所施加的噪声成功诱导了预期的听力损失。

听觉脑干反应（ABR）听力阈值的变化 
小鼠在噪声暴露后1天或1周时，采用短音听性脑干反应（tone-burst ABR）检测其听觉阈值。噪声暴露后1天，在所测试的三个频率下均观察到听觉阈值显著升高（12 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL；24 kHz：91.43 ± 0.92 dB SPL；32 kHz：98.57 ± 1.43 dB SPL）（即第6组）th 天）。噪声暴露后1周出现部分听力恢复（即第13th 天），但与对照组相比，所有频率的听阈仍升高超过30 dB（12 kHz：72.86 ± 2.86 dB SPL；24 kHz：84.29 ± 2.77 dB SPL；32 kHz：87.14 ± 4.21 dB SPL）（对照组：12 kHz：41 ± 0 dB SPL；24 kHz：51 ± 0 dB SPL；32 kHz：51 ± 0 dB SPL）。本研究中，高频听力损伤更为严重（图5采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计分析，组间比较采用Bonf...

本文介绍了一种噪声性听力损失（NIHL）小鼠模型的实验方案。为诱导NIHL，我们设计了一种新型且简便的装置，该装置由波纹塑料、大鼠捕鼠笼和扬声器组成。采用听觉脑干反应和免疫荧光成像分别评估听力功能和外毛细胞损伤情况。

噪声性听力损失（NIHL）的动物模型对于病理学家、治疗师、药理学家和听力研究人员而言具有重要意义，可用于深入研究……

尽管已有针对噪声性听力损失的研究，但尚无研究以如此详尽的方式记录实验方法，因此本方法具有重要意义。该方法可有效在小鼠中诱导噪声性听力损失，并通过听性脑干反应（ABR）观察听力阈值的实际变化。噪声性听力损失动物模型有助于科学家深入理解噪声性听力损失的机制，进而优化相应的治疗策略。演示该实验操作的是我实验室一位非常优秀的学生 Dian-Shiue Lee。准备实验小鼠用的笼子时，使用大鼠捕获笼，并将四块瓦楞塑料板裁剪成合适尺寸，使其能够适配于笼内。为防止小鼠脚部被网格划伤，分别将其中两块塑料板置于笼子底部和背侧。将另外两个部件相互垂直交错放置，以将笼内空间均分为四等份。打开 CLIO 应用软件，将光标移至扬声器图标，点击 TwoSin。输入并修改频率 1 的值为 1,000 hertz，频率 2 的值为 6,000 hertz，然后点击“确定”开始播放声音。在 Leq 选项卡下，将 dBV 更改为 dBSPL。在软件界面设置时间后，单击绿色三角形按钮播放声音。将麦克风置于扬声器前方 8.5 厘米处，以校准噪声水平。将噪声水平调整至125分贝SPL-A，并持续监测至少三分钟，以确保噪声水平充分稳定。使用信号发生器、分析仪和放大器来产生和控制噪声。将四只雄性C57 black 6J小鼠放入笼中，每只小鼠位于笼子的一个象限，进行噪声暴露。在噪声暴露期间，将小鼠随机分配到每个象限。在笼子顶部放置一个麦克风，以监测噪声暴露期间的噪声水平。将笼子放置在隔音箱内扬声器前方，确保扬声器与笼子之间的距离为8.5厘米。将小鼠连续5天、每天6小时暴露于1千赫兹和6千赫兹频率的噪声中。在第6天和第13天通过测量听觉脑干反应（ABR）来评估小鼠的听阈。使用专为小型动物ABR测量设计的商用ABR检测系统，并在全身麻醉状态下维持动物。将12毫米皮下针电极置于左耳耳廓后方的头顶位置以及靠近尾部的背部位置，以测量听觉阈值。将扬声器放置在动物左耳1厘米处后，通过扬声器给予声学刺激。刺激类型选择正弦波，窗口尺度选择10 k。转动频率旋钮以获得所需声学刺激的频率。通过调节函数发生器上的AMLP旋钮来调整刺激强度。根据校准结果计算出合适的电压，再调节AMLP旋钮，以获得所需的刺激强度。在10至100分贝声压级（SPL）的一系列刺激强度下采集ABR测量数据，步长为10分贝。将能够引出可识别V波的最低刺激强度水平标记为ABR阈值。在完成ABR测量后处死小鼠，并从已安乐死的小鼠中取出耳蜗组织。在收获组织后，立即将其浸入10%甲醛中固定，并在4°C下静置至少八小时。按照文中所述，使用EDTA进行脱钙。将耳蜗置于盛有PBS的培养皿中。进行组织染色时，将螺旋状的耳蜗柯蒂氏器（OC）切成三段：基底回、中回和顶端回。在解剖显微镜下以8倍至35倍放大倍数，去除脱钙耳蜗中包括前庭阶、鼓阶和蜗轴在内的骨性结构，获取包括柯蒂氏器在内的软组织。噪声暴露后一天，在12千赫兹、24千赫兹和32千赫兹频率下均观察到听阈显著升高。噪声暴露一周后出现部分听力恢复，但与对照组相比，所有频率下的听阈仍升高超过30分贝。本研究中，高频听力受损更为严重。在第6天和第13天，实验组与对照组在12千赫兹和32千赫兹的听阈之间均观察到显著差异。与对照组小鼠相比，NIHL小鼠的显微图像中 consistently 观察到外毛细胞的丢失。尽管所有图像中的内毛细胞均保持完整，但耳蜗（OC）的基底转和中回的外毛细胞严重受损。相比之下，耳蜗顶回的外毛细胞几乎完好无损。本方案中最重要的步骤包括噪声暴露、听性脑干反应（ABI）测量以及耳蜗的取材。该方法可用于通过使用不同类型的声波，研究在不同频率下噪声暴露对听力损失的影响。

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Neuroscience

神经科学

改进小鼠噪声性听力损失的实验条件及听力功能和外毛细胞损伤的评估

本文描述了一种快速且低成本的行为学方法，用于测定听觉参数，如听阈、听力损伤或幻觉感知（主观性耳鸣）。该方法利用声学惊吓反应的前脉冲抑制，可借助可编程的模数/数模转换器和压电传感器，在个人计算机上轻松实现。...

一种用于啮齿类动物行为听觉测量的低成本装置

本视频展示了一种用于评估小鼠耳蜗特定区域带状突触的方法。该方法利用免疫染色和共聚焦成像技术，识别每圈耳蜗不同频率区域中的功能性突触。...

小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的评估

来源：Lee, D. et. al., 小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估。J. Vis. Exp.

通过长时间高音量声音暴露诱导小鼠听力损失

来源：Lee, D., 等．小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估．J. Vis.

测量小鼠的听觉脑干反应

所述的耳后手术入路可实现快速、直接地将药物递送至小鼠耳蜗的鼓阶，同时最大限度减少出血量和动物死亡率。该方法可通过圆窗膜向新生后小鼠递送分子、药物及病毒，用于耳蜗治疗。...

通过圆窗膜进行病毒介导的基因递送至小鼠内耳的手术方法

存在多种将耳毒性物质导入动物模型耳蜗的方法。本文介绍了一种通过圆窗龛递送耳毒性物质的手术方案。该方法具有良好的可靠性，可产生靶向的耳蜗内损伤，同时避免对微细结构造成机械性损伤。此外，可进一步用于研究耳蜗的自我修复与再生能力。...

小鼠圆窗给药法用于耳毒性药物递送：一种诱导耳蜗细胞退变的快速可靠技术

本文描述了两种用于向内耳局部给药的显微外科手术方法，并在听力参数、耳蜗细胞结构以及炎症标志物表达方面对二者进行了比较。...

靶向小鼠内耳给药方法的比较研究：鼓泡术 与 经鼓室注射

耳蜗植入物的动物模型有助于增进对利用电刺激治疗永久性感音神经性听力损失的技术基础的认识。本研究介绍了一种在小鼠中进行急性致聋和耳蜗植入电极阵列的手术方案，以及通过听觉脑干反应进行功能评估的方法。...

C57BL/6小鼠的耳蜗植入手术及电诱发听觉脑干反应记录

本文描述了一种用于评估正常小鼠带状突触形态特征和功能状态的实验方案。该模型同样适用于噪声诱导和年龄相关性耳蜗突触病变受限模型。文中还讨论了以往小鼠研究的相关结果。...

小鼠耳蜗特定频率区域带状突触的形态学与功能评估

脑干诱发电位测听是临床神经生理学中的重要工具。如今，脑干诱发电位测听也广泛应用于基础科学研究和涉及药理学及遗传学动物模型的临床前研究中。本文详细描述了如何在小鼠中成功记录和分析听觉脑干反应。...

小鼠脑干诱发电位听觉测试中的数据采集与分析

本文介绍了一种改良的耳蜗表面制备方法，该方法需要进行脱钙处理，并使用细胞与组织粘附剂将耳蜗上皮组织片段粘附于10...

成年小鼠耳蜗表面制备

学习使用C57BL/6J小鼠建立噪声性听力损失模型，通过ABR测量和耳蜗组织学分析评估听阈变化与外毛细胞损伤。该方法为研究听力损伤机制及优化治疗策略提供可靠框架。

小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估

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