高效转染 体外 使用肽-泊洛沙胺纳米颗粒在培养细胞中转录mRNA

多肽-泊洛沙胺纳米颗粒是一种潜在的肺部mRNA递送系统。我们的方案能够以更高的生产效率和效率制备多肽-泊洛沙胺纳米颗粒，有助于黏膜mRNA疫苗的开发。该技术所需材料成本较低，且可在短时间内完成操作。

多肽-泊洛沙胺纳米颗粒具有介导高效mRNA转染的能力。多肽-泊洛沙胺纳米颗粒在人支气管上皮细胞中实现了成功的mRNA转染，这意味着其在黏膜新冠疫苗、肺癌治疗以及囊性纤维化基因治疗方面具有潜在应用前景。在开始实验操作之前，我希望操作者已具备相关领域的基本知识，以及对该实验方案和大部分技术的了解。

在合成Metridia荧光素酶的开放阅读框并将其克隆至pUC57载体后，使用BamHI和KpnI在37摄氏度条件下酶切一小时，制备线性化DNA模板。根据论文所述方法，使用T7转录试剂盒和假尿苷配制20微升反应体系进行mRNA合成。充分混匀各组分，并在37摄氏度孵育三小时。

然后，将50微克未加帽的体外转录mRNA在65摄氏度加热10分钟，以去除其二级结构。使用Cap 1加帽系统对体外转录mRNA进行加帽，并通过S-腺苷甲硫氨酸和2'O-甲基转移酶在37摄氏度下反应30至60分钟，修饰7-甲基鸟苷帽结构以生成Cap 1。使用紫外-可见分光光度计测定加帽后体外转录mRNA的浓度。

使用RNA标记物，在含有18%甲醛的1%甲醛变性琼脂糖凝胶中分析加帽IVT mRNA的分子大小。通过将T704溶解于无核酸酶水中，制备10毫克/毫升的泊洛沙胺704储备液。通过将多肽溶解于无核酸酶水中，制备2毫克/毫升的多肽储备液。

将制备好的溶液在 4 摄氏度下保存。在冰上融化体外转录 mRNA。在打开管子前，于室温下以 300 × g 离心 3 秒，并用无核酸酶的水稀释体外转录 mRNA 溶液。

用无核酸酶水分别将T704溶液稀释至8微克/微升的浓度，将合成肽溶液稀释至0.555微克/微升的浓度，配制T704和合成肽混合溶液。混合后在室温孵育15分钟，再进行后续使用。将体外转录mRNA溶液吸入1毫升注射器中，注意避免注射器尖端产生气隙或气泡。

将注射器装入旋转块旁边卡匣的一侧。然后，用1毫升注射器吸取T704和合成肽混合溶液，并去除针头处的任何气泡或空气间隙。将注射器插入泵的另一个入口，并将泵的总流速设定为每分钟4至10毫升。

在混合装置的流路末端放置一个10毫升无RN酶的锥形管，用于收集混合后的IVT mRNA/PP-sNp溶液。启动泵以开始混合，并确保参数输入正确。泵运行6秒后，从锥形管中收集IVT mRNA/PP-sNp样品。

转染前24小时，在96孔板中接种人支气管上皮细胞和树突状细胞系。细胞培养于添加10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素的培养基中。移除培养基后，用每孔0.2毫升的PBS洗涤贴壁细胞。

向含有接种细胞培养物的每个孔中加入 170 微升无血清培养基。然后，将含有 0.4 微克 Metridia 荧光素酶 mRNA 的 30 微升 IVT mRNA/PP-sNp 制剂逐滴加入每个孔中。将细胞在 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的湿润环境中孵育 4 小时。

吸去转染培养基，加入 0.2 毫升新鲜培养基，培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素。将转染后的细胞按先前所示条件孵育 24 小时，收集各孔的上清液用于检测。通过向腔肠素底物中加入 PBS 配制新鲜的检测试剂溶液。

涡旋振荡10秒，充分混匀溶液。取50 µL收集的上清液加入96孔板中。设置酶标仪读数时间为1,000毫秒，并手动或通过自动进样方式向每孔加入30 µL腔肠素溶液。

加入腔肠素溶液至裂解液后，立即点击“开始”以测定发光信号。重组质粒经提取和酶切消化，制备成线性化的DNA模板。体外转录生成了未加帽和加帽的MetLuc mRNA。

与转染商业化的脂质体转染试剂、裸露的Metridia荧光素酶mRNA、PBS、T7044合成肽或其混合溶液相比，转染Metridia荧光素酶mRNA/PP-sNp的人支气管上皮细胞（16HBE）和树突状细胞系DC2.4中荧光素酶的表达水平显著更高。Metridia荧光素酶mRNA/PP-sNp的荧光素酶表达高于LP，表明PP-sNp递送系统对于保护MetLuc mRNA免于降解以及提高外源性Metridia荧光素酶mRNA的转染效率具有重要作用。请确保成功去除未加帽的Met-mRNA的合成结构。仔细计算并下载Met-mRNA T704和肽化合物，以制备和压缩泊洛沙胺纳米颗粒。

可采用透射电子显微镜观察多肽-泊洛沙胺纳米颗粒的形态。该技术有助于研究人员开发黏膜mRNA疫苗，并实现对所有相关细胞的基因治疗制剂进行高通量筛选。