构建环状细胞穿透肽以增强穿越生物屏障的能力

癌症治疗面临的一个严重障碍是由于生理屏障的存在，导致治疗药物难以有效到达深层肿瘤细胞。因此，迫切需要开发新型分子载体，以克服生物屏障，提高药物递送效率。本实验的目的是合成环状细胞穿透肽，以增强细胞间的穿透能力。

该方法的优点在于，无需任何金属催化剂，即可通过半胱氨酸与树脂的取代反应轻松实现肽环化。与亲水性的内酰胺或三唑交联相比，引入芳香族交联可提高肽的整体疏水性，从而增强其通透性。首先，在通风橱中组装手动肽合成装置。

将三通旋塞安装到真空 manifold 上，并将其连接至氮气。确保将未使用的入口用帽盖封闭。将一个10毫升聚丙烯层析柱连接到三通旋塞上，使用橡胶吸头或通过废液捕集装置连接真空，从聚丙烯柱中排出反应混合物或溶剂。

为准备用于多肽合成的树脂，向所需量的树脂中加入 4 至 5 毫升 DMF，并通过温和的氮气鼓泡将其转移至聚丙烯柱中，持续 30 分钟，以充分溶胀树脂。排尽 DMF 后，向树脂中加入 4 至 5 毫升 50%吗啉/DMF 溶液。继续用氮气温和鼓泡 30 分钟，以去除 N 端的 Fmoc 保护基，随后排尽混合液。

用氮气鼓泡至少1分钟，每次向柱中加入4至5毫升DMF，彻底清洗树脂三次。同样方法，用二氯甲烷清洗树脂三次，再用DMF清洗三次。接下来，将648.8毫克Fmoc和PBF保护的精氨酸以及372.6毫克HATU溶解于5毫升DMF中，置于离心管内。

加入 348.4 微升 DIPEA 以激活偶联反应，然后将反应混合物转移至装有树脂的聚丙烯柱中。用氮气鼓泡轻轻搅拌混合物 1 至 2 小时，随后重复偶联反应一次。排空反应混合物，并依次用 DMF、二氯甲烷和 DMF 再次洗涤树脂，每种溶剂各洗三次，每次至少 1 分钟。

在进行下一个氨基酸偶联之前，先去除Fmoc保护基团，并按照前述步骤洗涤树脂。接着，使用与氨基酸偶联相同的方法将β-丙氨酸作为间隔臂进行偶联，然后在避光条件下向聚丙烯柱中加入FITC、DIPEA和DMF的混合液，以实现树脂上多肽的FITC标记。该反应大约需要8小时。

为进行线性肽的环化，向聚丙烯柱中加入三氟乙酸、三异丙基硅烷和二氯甲烷的混合液，反应2分钟，以选择性去除半胱氨酸的三苯甲基保护基。排干混合液，并重复该步骤直至黄色溶液变为无色，以彻底去除三苯甲基保护基。随后用DMF和二氯甲烷依次洗涤树脂至少三次，并将4,4'-双溴甲基联苯溶解于含DIPEA的DMF中。

将溶液加入柱中，反应4小时。用4至5毫升甲醇洗涤树脂，每次5分钟，重复两次，并用持续的氮气流干燥。对于含有半胱氨酸的肽，用有效的裂解混合液处理树脂，裂解液为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水，或三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和水。

将结合肽的树脂处理2至3小时以裂解肽，然后用氮气流小心除去三氟乙酸。为获得粗肽，向裂解后的肽样品中加入4至5毫升乙醚以沉淀粗肽，并在10,000 × g离心4分钟。小心弃去上清液，并在高效通风橱中将肽干燥3分钟。

将小规模粗提肽溶解于800微升乙腈中，然后使用反相高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术进行分析。在12孔板的组织培养板插件中，接种100,000个HeLa细胞于2毫升DMEM培养基中，并在含5%二氧化碳的37摄氏度湿化培养箱中孵育24小时。移除培养基，将细胞在含有1毫升无血清DMEM的10微摩尔FITC-R8或FITC-sR8-4中于培养孔中继续孵育1小时。

随后，移除含有肽段的培养基，并用 1 毫升 PBS 洗涤细胞三次。向培养小室中加入 1 毫升新鲜的不含 FBS 的 DMEM 培养基，然后将带有 HeLa 细胞的培养小室与组织培养板插入物共同孵育，使位于底部圆形盖玻片上的 HeLa 细胞孵育 2 小时。用 2.5% 戊二醛固定圆形盖玻片上的 HeLa 细胞 15 分钟，然后用 DAPI 染色 15 分钟。

最后，在荧光显微镜下观察盖玻片上的HeLa细胞。此处展示了FITC标记的线性R8肽和FITC标记的订书钉式R8肽的合成示意图。该图显示了线性R8肽和订书钉式R8肽的HPLC和质谱图谱。

固定化多肽的保留时间明显长于线性类似物，表明在使用疏水性交联剂进行环化后，该多肽的整体疏水性增强。该图示表示线性多肽与固定化多肽在含25%胎牛血清（FBS）条件下的稳定性。环化R8在与FBS孵育4小时后仍保持77.3%完整，而其线性对应物则大部分被降解，提示环化R8多肽的蛋白水解稳定性增强。

孵育1小时后，用3微摩尔FITC标记的线性R8肽和FITC标记的订书针式R8肽处理的HeLa细胞和4T1细胞的活细胞荧光显微镜图像如图所示。可以看出，经含芳香族交联的环状R8处理的细胞其胞内荧光强度高于经线性R8处理的细胞。流式细胞术分析也获得了类似结果。

为了进一步研究环状R8是否具有增强的细胞间穿透能力，采用Transwell模型来模拟肽从一个细胞层到另一个细胞层的屏障通透性。与线性R8肽相比，环状R8表现出更显著的跨屏障穿透能力，这通过细胞内荧光的显著增强得以证实。半胱氨酸的三苯甲基保护基及树脂的完全脱保护对于后续的环化步骤至关重要。

此外，由于空间位阻效应，环化效率还取决于肽链的特定序列和长度。在此情况下，使用负载量较低的树脂，或在溶液相中以较低浓度进行肽链环化，将有助于提高效率。与线性对应物相比，这些环状肽表现出更强的细胞间通透性。

我们认为它们在克服生物屏障方面具有巨大前景，并将在药物递送领域用于分子层面的进一步应用。