Name: 构建环状细胞穿透肽以增强生物屏障的穿透力 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学习利用芳香交联构建环状细胞穿透肽以增强疏水性和生物屏障穿透力的方法。该技术无需金属催化剂即可实现肽环化，为肿瘤药物递送提供了高效的新型分子转运工具。

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本工作得到国家自然科学基金（21708031）、中国博士后科学基金（BX20180264，2018M643519）以及中央高校基本科研业务费专项资金（2682021ZTPY075）的支持。

1. 仪器设备准备
注意：所有操作均应在配备适当个人防护装备的通风橱中进行。
<ol>
	<li>在通风橱中组装手动多肽合成装置（图1）。将三通旋塞阀放置（参见 材料表) 转移至真空 manifold（参见 材料表）并连接至氮气（N2）。确保封闭未使用的入口。</li>
	<li>连接一个10 mL聚丙烯柱（参见 材料表) 接到三通活塞上。使用橡胶吸头或真空装置将反应混合物或溶剂从聚丙烯柱中排出 通过 废液收集装置</li>
</ol>
2. FITC标记的线性R8肽（FITC-R8）和FITC标记的订书肽R8（FITC-sR8-4）的合成
注意：肽的合成是根据标准的Fmoc基固相肽合成（SPPS）方案25进行的。本研究全程使用4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基乙酰胺基-正亮氨酸-MBHA树脂（Rink酰胺MBHA树脂，参见材料表）。
注意：N, N-二甲基甲酰胺（DMF）、N, N-二异丙基乙胺（DIPEA）、吗啉、二氯甲烷（DCM）均为无色液体，吸入或经皮肤吸收后有害。乙醚极易燃。1,2-乙二硫醇（EDT）具有强烈异味。三氟乙酸（TFA）具有强腐蚀性，其酸性是乙酸的105倍。因此，所有试剂和化学品均应在通风橱内使用，并佩戴适当的防护装备。
<ol>
	<li>准备用于多肽合成的树脂。
	<ol>
		<li>计算合成所需树脂的质量：树脂质量（mg）= 合成规模（mmol）/ 树脂载量（mmol/g） × 1,000（mg/g） 
		注意：例如，0.2 mmol 规模下使用 Rink Amide MBHA 树脂（载量 0.572 mmol/g）所需质量 = 0.2 mmol / 0.572 mmol/g × 1,000 mg/g = 350 mg。</li>
		<li>向所需量的树脂中加入 4–5 mL DMF，并转移至 10 mL 聚丙烯柱（步骤 1.2），用温和的 N2 鼓泡处理 30 分钟以充分溶胀树脂，然后排出 DMF。</li>
		<li>向树脂中加入 4–5 mL 50% 哌嗪/DMF（v/v）溶液，用 N2 温和鼓泡处理 30 分钟，重复两次以脱除 N 端 Fmoc 保护基，然后排出混合液。随后，每次加入 4–5 mL DMF 至柱中并用 N2 鼓泡至少 1 分钟，重复洗涤 3 次。接着以相同方式用 DCM（3 次）和 DMF（3 次）依次洗涤树脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下方法进行 Fmoc 保护氨基酸的偶联。 
	注意：此处以 0.2 mmol 规模的手动合成为例，说明精氨酸的偶联过程。
	<ol>
		<li>在离心管中将 Fmoc-Arg(Pbf)-OH（5 当量，648.8 mg）和 2-(7-偶氮苯并三唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，4.9 当量，372.6 mg）溶于 5 mL DMF 中。</li>
		<li>加入 DIPEA（10 当量，348.4 µL）以活化偶联反应，然后将反应混合物转移至装有树脂的 10 mL 聚丙烯柱（步骤 2.1.3 中制备）中。随后用 N2 鼓泡温和搅拌 1–2 小时。</li>
		<li>重复一次偶联反应（步骤 2.2.1 和步骤 2.2.2）。</li>
		<li>偶联完成后，排出反应液，并依次用 DMF、DCM 和 DMF 各洗涤 3 次，每次至少 1 分钟。</li>
		<li>按顺序进行各氨基酸的偶联：向树脂中加入 4–5 mL 50% 哌嗪/DMF（v/v）溶液，用 N2 鼓泡处理 30 分钟，重复两次以脱除 Nα-Fmoc 保护基，然后按步骤 2.2.4 所示方法洗涤树脂，再进行下一个氨基酸的偶联（如步骤 2.2.1 和步骤 2.2.2 所示）。重复多个循环以完成目标多肽的合成。 
		注意：此步骤可在此暂停。用甲醇浓缩树脂，并用持续的 N2 气流干燥。盖紧聚丙烯柱后，将树脂于 4 °C 保存数天（或于 −20 °C 长期保存）。开始新一轮合成前，用 4–5 mL DMF 溶胀树脂 0.5–1 小时。若直接进行下一步，则无需浓缩树脂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下方法用异硫氰酸荧光素（FITC）对多肽进行标记。
	<ol>
		<li>使用与步骤 2.2 中氨基酸偶联相同的方法，将 β-丙氨酸作为间隔臂进行偶联，用于后续 FITC 标记。</li>
		<li>向聚丙烯柱中加入 FITC（5 当量）、DIPEA（10 当量）和 DMF 的混合液，在避光条件下反应 8 小时，完成树脂上多肽的 FITC 标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于 FITC-sR8-4 的合成，按以下方法对线性多肽进行环化。
	<ol>
		<li>向聚丙烯柱中加入 TFA/三异丙基硅烷（TIS）/DCM（3/5/92，v/v/v）混合液，处理 2 分钟以选择性脱除 Cys(Trt) 保护基，然后排出混合液。重复该操作直至淡黄色溶液变为无色，以确保 Trt 保护基完全脱除。</li>
		<li>随后，用 DMF 和 DCM 对树脂依次洗涤至少 3 次。然后将 4,4'-双(溴甲基)联苯（2 当量）溶于含 DIPEA（4 当量）的 DMF 中，加入柱内，反应 4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按以下方法裂解多肽：多肽合成完成后，用 4–5 mL 甲醇洗涤树脂两次，每次 5 分钟，并用持续的 N2 气流干燥。使用适当的裂解试剂混合液处理树脂，对于一般多肽使用 TFA/TIS/H2O（95/2.5/2.5，v/v/v），对于含半胱氨酸的多肽则使用 TFA/TIS/EDT/H2O（92.5/2.5/2.5/2.5，v/v/v/v），每 100 mg 树脂使用约 1 mL 裂解液。裂解反应 2–3 小时以释放多肽，然后小心用 N2 气流除去 TFA。</li>
	<li>为获得粗品多肽，向裂解后的产物中加入 4–5 mL 乙醚以沉淀粗多肽，于 10,000 × g 离心 4 分钟。小心弃去上清液，并在通风良好的通风橱中将多肽风干 3 分钟。</li>
	<li>多肽分析：取少量粗品多肽（约从 10 mg 载肽树脂裂解所得）溶于 800 µL 乙腈（ACN）/H2O（1/1，v/v）中，然后采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析（见材料表）。</li>
	<li>采用 RP-HPLC 和 LC-MS 对多肽进行纯化。
	<ol>
		<li>将 50 mg 粗品多肽溶于 4 mL ACN/H2O（1/1，v/v）中，注入配备 C18 柱（4.6 mm × 150 mm，孔径：120 Å，粒径：4 µm；见材料表）的 RP-HPLC 系统。使用含 0.1% TFA/H2O（v/v）和 ACN 的流动相，以 10% 至 90% ACN 的梯度在 30 分钟内洗脱多肽。常规多肽在 220 nm 检测，FITC 标记多肽在 494 nm 检测。</li>
		<li>收集由质谱鉴定的主要多肽峰对应的馏分，然后冻干目标多肽馏分。将纯化后的多肽于 −20 °C 保存。 
		&#8203;注意：纯化后的 FITC-R8 实测 m/z 值如下：[M + 3 H]3+：576.63；[M + 4 H]4+：432.72；[M + 5 H]5+：346.39；[M + 6 H]6+：288.85。纯化后的 FITC-sR8-4 实测 m/z 值如下：[M + 3 H]3+：704.74；[M + 4 H]4+：528.77；[M + 5 H]5+：423.34；[M + 6 H]6+：352.91。质谱分析条件：仪器：ESI（探针偏压：+4.5 kV；检测器：1.2 kV）；雾化气体流速：1.5 L/min；弯曲去溶剂化通道（CDL）：−20 V；CDL 温度：250 °C；块体温度：400 °C；流速：0.2 mL/min；流动相：50% H2O/50% ACN。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. FITC标记肽的定量分析
<ol>
	<li>将少量纯化后的多肽溶解于DMSO中作为储备液（例如，40 µmol/mL）。</li>
	<li>使用多功能酶标仪（参见材料表），在96孔微量板（参见材料表）中测定2 µL储备液加入498 µL 10 mM磷酸盐缓冲液（1× PBS，pH 7.4）后在494 nm处的吸光度（A494）。稀释倍数为500 µL / 2 µL = 250，微量板的光程为0.5 mm。</li>
	<li>使用以下公式计算储备液的浓度： 
	浓度（mM）= A494 × 稀释倍数 / 0.05（cm）/ 77,000（cm−1·M−1）× 1,000（mM·M−1）</li>
	<li>调整至适当稀释度，使测得的A494值介于0.1至1.0之间。 
	注意：应重复测量多次，以确保测得的浓度准确。77,000 cm−1·M−1的消光系数来源于FITC基团。</li>
</ol>
4. 肽在胎牛血清（FBS）中的稳定性
<ol>
	<li>将肽溶液与250 µL的25% FBS/H2O（v/v）混合，使肽浓度为100 µM，在37 °C条件下孵育。分别在孵育0 h、1 h、2 h和4 h后，取10 µL等分试样，然后加入150 µL溶于H2O/ACN（1/3, v/v）的12%三氯乙酸，以沉淀血清蛋白。</li>
	<li>将样品在10,000 × g 条件下离心5 min，取上清液采用HPLC分析（如步骤2.8所述），以确定肽的降解程度。</li>
	<li>计算1 h、2 h和4 h时肽峰面积相对于0 h时的比值，得到相应时间点未降解肽的比例。结果为三个平行样品的平均值。</li>
</ol>
5. 肽的细胞摄取
<ol>
	<li>荧光显微成像
	<ol>
		<li>将圆形盖玻片放入12孔板中。随后，在盖玻片上均匀接种1 × 105个细胞，并加入2 mL培养基，过夜培养。弃去培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。 
		注意：本研究中，HeLa细胞和4T1细胞在含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM，参见材料表）中，于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养。</li>
		<li>在无FBS的DMEM中加入1 mL浓度为3 µM的FITC标记肽，与细胞在37 °C共孵育1小时。随后弃去含肽培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。</li>
		<li>用1 mL Hoechst 33258染色15分钟。使用荧光显微镜（参见材料表），在相同荧光强度和曝光时间条件下观察各肽的内化情况。 
		注意：荧光显微镜设置如下。物镜：Plan-Apochromat：63 ×/1.40 Oil DIC M27；通道1（FITC）：激发滤光片：450–490 nm，发射滤光片：500–550 nm，曝光时间：230 ms；通道2（Hoechst 33258）：激发滤光片：335–383 nm，发射滤光片：420–470 nm，曝光时间：27 ms。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析
	<ol>
		<li>在12孔板中均匀接种5 × 105个HeLa细胞，于37 °C在DMEM中培养24小时。随后弃去培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。</li>
		<li>在无FBS的DMEM中加入1 mL浓度为3 µM的FITC标记肽，与细胞在37 °C共孵育1小时。弃去含肽培养基，用含0.25%（w/v）胰蛋白酶和0.53 mM EDTA的PBS消化细胞5分钟，然后在306 × g离心4分钟收集细胞。用PBS洗涤细胞沉淀。</li>
		<li>用含0.05%（w/v）台盼蓝的PBS与细胞孵育3分钟，以淬灭细胞表面结合的荧光，随后使用流式细胞仪（参见材料表）对细胞内荧光进行定量分析。 
		注意：流式细胞仪设置：激发波长：488 nm，发射波长：530 nm。台盼蓝还可淬灭死细胞的荧光，有助于在分析肽摄取时区分活细胞与死细胞。</li>
		<li>对4T1细胞采用与HeLa细胞相同的流式细胞术方案进行处理和检测。每样本收集5 × 105个细胞，每组设置三个平行样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 利用Transwell模型探索肽的细胞间穿透能力
<ol>
	<li>在12孔板中加入2 mL DMEM培养基，接种1 × 105个HeLa细胞，并放入含组织培养板插件的12孔板中（见材料表），于37 °C、含5% CO2的湿化培养箱中培养24 h。随后，吸除培养基，加入1 mL不含FBS的DMEM培养基，其中含10 µM FITC-R8或FITC-sR8-4（经HPLC纯化），在孔板中与细胞共孵育1 h。</li>
	<li>移除含肽段的培养基，用1 mL PBS洗涤细胞3次。向孔板中加入1 mL新鲜的不含FBS的DMEM培养基，然后将含组织培养板插件的孔板中的HeLa细胞与底部圆形盖玻片上的HeLa细胞共同孵育2 h。</li>
	<li>用2.5%戊二醛固定盖玻片上的HeLa细胞15 min，随后用DAPI染色15 min。接着在荧光显微镜下观察盖玻片上的HeLa细胞。采用与HeLa细胞相同的实验方案处理和检测4T1细胞。</li>
</ol>

<ol><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-targeted+dual+site-selective+functionalized+poly%28%CE%B2-amino+esters%29+delivery+platform+for+nerve+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration.</a> Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+BBB+permeability+of+osmotically+active+poly%28mannitol-co-PEI%29+modified+with+rabies+virus+glycoprotein+via+selective+stimulation+of+caveolar+endocytosis+for+RNAi+therapeutics+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease.</a> Biomaterials. 38, 61-71 (2015).</li>
<li>Bian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell-based+intercellular+delivery+of+transcription+factor+GATA4+on+ischemic+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy.</a> Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+molecular+weight+protamine+chemical+chimera+to+enhance+monomeric+insulin+intestinal+absorption%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption.</a> Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+STAT3-binding+peptide+exerts+antiproliferative+effects+and+antitumor+activity+by+inhibiting+STAT3+phosphorylation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling.</a> Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEGylated+liposomes+with+NGR+ligand+and+heat-activable+cell-penetrating+peptide-doxorubicin+conjugate+for+tumor-specific+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy.</a> Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

通过引入构象约束来实现多肽的化学稳定化，已被证明是提高多肽稳定性和细胞通透性的有效策略26。本实验方案详细描述了含芳香族交联结构的环状穿膜肽（CPP）的合成步骤及其跨生物屏障通透性的评价方法。与亲水性的内酰胺或三唑交联结构相比22,27，本研究所采用的芳香族交联结构可提高CPP的整体疏水性，从而显著增强其细胞通透性。另一方面，多肽的环化可通过与半胱氨酸的取代反应轻松实现，无需任何金属催化剂。在本方案中，CPP的环化反应在树脂上进行；然而，由于空间位阻效应，环化效率还取决于多肽的具体序列和长度，可能导致二聚体副产物的生成28。在此情况下，使用载荷能力较低的树脂将有助于减少副反应。此外，也建议在溶液相中以稀释浓度对这类特定多肽进行环化反应29。
本实验方案中有几个关键点需要注意。首先，使用TFA/TIS/EDT/H2<...

过去几十年来，细胞穿透肽（CPP）在药物递送领域的研发取得了快速进展。CPP 已被广泛用作分子转运体，用于治疗多种危及生命的疾病，包括神经系统疾病1，2、心脏病3、糖尿病4、皮肤病5以及癌症6，7。尽管已有大量研究投入，癌症仍然是全球重大健康负担，伴随高发病率和高死亡率8。治疗癌症的一个严重障碍是由于生理屏障（如致密的细胞外基质（ECM）、异常的肿瘤血管系统、多重膜屏障以及高的组织间液压力（IFP））限制了治疗药物对深层肿瘤细胞的可及性9。因此，开发具有更强能力跨越生物屏障递送货物的新型 CPP 被认为是癌症治疗的关键策略10，11。
根据其理化性质，细胞穿透肽可分为阳离子型、两亲性和疏水性细胞穿透肽12其中，带正电荷的HIV-TAT肽和合成多聚精氨酸在生物医学研究中具有重要意义，已被广泛研究以促进药物的细胞内递送13Tunnemann 等人基于使用 R3 至 R12 多肽进行的细胞通透性研究报道，合成的多聚精氨酸肽要实现高效的细胞穿透，至少需要八个精氨酸残基。14然而，由于这些CPPs会迅速发生水解，通常具有较短的血浆半衰期 体内此外，关于如何优化细胞穿透肽（CPPs）的化学结构以增强其跨屏障能力，目前知之甚少，因为穿透多层细胞膜具有较大挑战性。15因此，开发能够穿透生物屏障的新型分子载体以提高药物递送效率成为迫切需求。2020年，Komin 等人16 发现了一种名为CL肽的细胞穿透肽，其包含一个螺旋模体（RLLRLLR）和一个聚精氨酸尾（R7），可穿越上皮单层。通过改变螺旋结构模式，还合成了一系列CL肽变体。该探索可为开发新型细胞穿透肽以递送货物穿越生物屏障提供重要指导。此外，Dietrich等通过增加肽的整体疏水性，优化了StAX肽的细胞通透性，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路。17.
通过环化对无规线性肽进行构象限制是提高其蛋白水解稳定性和通透性的有效方法18,19,20结构强化增强了环肽对蛋白酶的抗性，使其更加稳定 体内 与线性类似物相比，肽的环化可能通过促进分子内氢键形成，从而掩盖极性的肽骨架，提高肽的膜通透性。21在过去二十年中，化学选择性环化方法已成为构建具有不同结构的环肽的有效策略，例如全烃类、内酰胺、三唑、间二甲苯、全氟芳基及其他交联结构。22,23复杂的肿瘤微环境所形成的生物屏障可能会降低药物在实体瘤中的渗透24我们先前发现，环状穿膜肽对酶降解的抗性显著优于其线性对应物20此外，肽段的整体疏水性对其细胞通透性的增强至关重要。22根据上述研究可以推测，带正电荷的模式、整体疏水性的提高以及蛋白水解稳定性的增强，可能共同促进穿膜肽（CPPs）在生物屏障中的通透性。在最近的一项研究中，我们鉴定出两种在第 i 和 i+7 位含有芳香族交联结构的环状穿膜肽，其在肿瘤细胞和组织中的通透性优于相应的线性穿膜肽。15本文介绍了一种合成荧光标记环状细胞穿透肽（cyclic CPPs）的简明合成方案，以及研究其通透性的关键步骤。

<table><tbody><tr><td>1,2-乙二硫醇</td><td>Aladdin</td><td>K1722093</td><td>恶臭</td></tr><tr><td>2-(7-氮杂苯并三唑基)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU）</td><td>HEOWNS</td><td>A-0443697</td><td></td></tr><tr><td>4,4'-双(溴甲基)联苯</td><td>TCI</td><td>B1921</td><td></td></tr><tr><td>4T1 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td>4T1细胞在添加10% FBS（Hyclone）的DMEM培养基中，于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。 &amp;deg;含5% CO₂的湿润培养箱&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>乙腈&amp;nbsp;</td><td>Adamas</td><td>1484971</td><td>毒性</td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>能量</td><td>W330229</td><td>皮肤有害</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Aldrich</td><td>673811</td><td>易燃的</td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Beyotime</td><td>ST038</td><td>皮肤有害</td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基）</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电喷雾离子化质谱仪</td><td>沃特斯</td><td>G2-S 期 Tof</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>BioFroxx</td><td>1340</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>CytoFLEX</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素异构体（FITC）</td><td>能量</td><td>E0801812500</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>卡尔·蔡司</td><td>Axio Observer 7</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>HEOWNS</td><td>F-81070</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>GL Biochem</td><td>GLS201115-35202</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-&amp;beta;Ala-OH</td><td>Adamas</td><td>51341C</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td>HeLa 细胞在添加了10% FBS（Hyclone）的DMEM中，于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。 &amp;deg;含5% CO₂的湿润培养箱&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>高效液相色谱法</td><td>安捷伦</td><td>安捷伦 1260</td><td></td></tr><tr><td>高效液相色谱柱</td><td>安捷伦</td><td>Poroshell EC-C18 120, 4.6 &amp;times; 150 mm（孔径 120 &amp;Aring;，粒径4 &amp;mu;m)</td><td></td></tr><tr><td>冻干机</td><td>SP Scientific</td><td>Vir Tis</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td>毒性</td></tr><tr><td>微量滴定板</td><td>赛默飞世尔科技 &amp;mu;滴板</td><td>N12391</td><td></td></tr><tr><td>吗啉</td><td>HEOWNS</td><td>M99040</td><td>刺激物</td></tr><tr><td>多功能微孔板读板机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>VARIOSKAN LUX</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二异丙基乙胺</td><td>HEOWNS</td><td>E-81416</td><td>刺激物</td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>能量</td><td>B020051</td><td>对皮肤有害</td></tr><tr><td>Poly-Prep 柱</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td>聚丙烯层析柱</td></tr><tr><td>Rink Amide MBHA 树脂（0.572 mmol/g）</td><td>GL Biochem</td><td>GLS180301-49101</td><td></td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>组织培养板插件</td><td>LABSELECT</td><td>14211</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>HEOWNS</td><td>T63278</td><td>腐蚀性</td></tr><tr><td>三异丙基硅烷</td><td>HEOWNS</td><td>T-0284475</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>BioFroxx</td><td>1004</td><td></td></tr><tr><td>真空 manifold</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr></tbody></table>

构建环状细胞穿透肽以增强穿越生物屏障的能力

Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers

癌症一直是全球健康领域的重大挑战。然而，复杂的肿瘤微环境通常限制了治疗药物对深层肿瘤细胞的渗透，从而导致肿瘤复发。为了克服生物屏障穿透能力有限的问题，研究人员发现了具有优异膜转位能力的细胞穿透肽（CPPs），并将其作为有效的分子载体用于将多种货物递送入细胞。然而，传统的线性CPPs通常表现出较差的蛋白水解稳定性，这限制了它们穿越生物屏障的能力。因此，开发能够穿透生物屏障并具有增强蛋白水解稳定性的新型分子载体，对于提高生物医学应用中的药物递送效率具有重要意义。我们此前已合成了一系列带有芳香族交联结构的短环状CPPs，其在癌细胞和组织中的渗透能力优于相应的线性肽。本文介绍了一种简明的实验方案，用于合成荧光标记的环状多聚精氨酸R8肽及其线性对应物，并概述了研究二者细胞渗透性的关键步骤。

在本实验方案中，介绍了一种将线性多聚精氨酸R8限制为其环状形式的合成方法。固相肽合成（SPPS）通过手动操作，使用简单装置完成（图1）。SPPS的详细合成过程如 图2所示。简而言之，首先将树脂充分溶胀，随后脱除Nα-Fmoc保护基团。接着，将Nα-Fmoc保护的氨基酸偶联至树脂上，直至完成肽链的组装（图2中的步骤1-4）。然后，使用裂解混合液将粗肽从树脂上裂解下来（图2中的步骤5）。采用FITC对肽段进行标记，以合成荧光标记的环状穿膜肽（CPPs），并追踪其穿越生物屏障的通透性。随后，在树脂上选择性地脱除半胱氨酸的三苯甲基保护基，再利用4,4'-双(溴甲基)联苯作为交联剂进行肽环化反应（图3A）。FITC-R8和FITC-sR8-4的HPLC及质谱（MS）图谱如<s...

本方案描述了含芳香族交联结构的环状细胞穿透肽的合成方法，及其跨生物屏障渗透性的评价。

癌症一直是全球健康领域面临的一项重大挑战。然而，复杂的肿瘤微环境通常限制了治疗药物向肿瘤深层区域的递送……

癌症治疗面临的一个严重障碍是由于生理屏障的存在，导致治疗药物难以有效到达深层肿瘤细胞。因此，迫切需要开发新型分子载体，以克服生物屏障，提高药物递送效率。本实验的目的是合成环状细胞穿透肽，以增强细胞间的穿透能力。该方法的优点在于，无需任何金属催化剂，即可通过半胱氨酸与树脂的取代反应轻松实现肽环化。与亲水性的内酰胺或三唑交联相比，引入芳香族交联可提高肽的整体疏水性，从而增强其通透性。首先，在通风橱中组装手动肽合成装置。将三通旋塞安装到真空 manifold 上，并将其连接至氮气。确保将未使用的入口用帽盖封闭。将一个10毫升聚丙烯层析柱连接到三通旋塞上，使用橡胶吸头或通过废液捕集装置连接真空，从聚丙烯柱中排出反应混合物或溶剂。为准备用于多肽合成的树脂，向所需量的树脂中加入 4 至 5 毫升 DMF，并通过温和的氮气鼓泡将其转移至聚丙烯柱中，持续 30 分钟，以充分溶胀树脂。排尽 DMF 后，向树脂中加入 4 至 5 毫升 50%吗啉/DMF 溶液。继续用氮气温和鼓泡 30 分钟，以去除 N 端的 Fmoc 保护基，随后排尽混合液。用氮气鼓泡至少1分钟，每次向柱中加入4至5毫升DMF，彻底清洗树脂三次。同样方法，用二氯甲烷清洗树脂三次，再用DMF清洗三次。接下来，将648.8毫克Fmoc和PBF保护的精氨酸以及372.6毫克HATU溶解于5毫升DMF中，置于离心管内。加入 348.4 微升 DIPEA 以激活偶联反应，然后将反应混合物转移至装有树脂的聚丙烯柱中。用氮气鼓泡轻轻搅拌混合物 1 至 2 小时，随后重复偶联反应一次。排空反应混合物，并依次用 DMF、二氯甲烷和 DMF 再次洗涤树脂，每种溶剂各洗三次，每次至少 1 分钟。在进行下一个氨基酸偶联之前，先去除Fmoc保护基团，并按照前述步骤洗涤树脂。接着，使用与氨基酸偶联相同的方法将β-丙氨酸作为间隔臂进行偶联，然后在避光条件下向聚丙烯柱中加入FITC、DIPEA和DMF的混合液，以实现树脂上多肽的FITC标记。该反应大约需要8小时。为进行线性肽的环化，向聚丙烯柱中加入三氟乙酸、三异丙基硅烷和二氯甲烷的混合液，反应2分钟，以选择性去除半胱氨酸的三苯甲基保护基。排干混合液，并重复该步骤直至黄色溶液变为无色，以彻底去除三苯甲基保护基。随后用DMF和二氯甲烷依次洗涤树脂至少三次，并将4,4'-双溴甲基联苯溶解于含DIPEA的DMF中。将溶液加入柱中，反应4小时。用4至5毫升甲醇洗涤树脂，每次5分钟，重复两次，并用持续的氮气流干燥。对于含有半胱氨酸的肽，用有效的裂解混合液处理树脂，裂解液为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水，或三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和水。将结合肽的树脂处理2至3小时以裂解肽，然后用氮气流小心除去三氟乙酸。为获得粗肽，向裂解后的肽样品中加入4至5毫升乙醚以沉淀粗肽，并在10,000 × g离心4分钟。小心弃去上清液，并在高效通风橱中将肽干燥3分钟。将小规模粗提肽溶解于800微升乙腈中，然后使用反相高效液相色谱和液相色谱-质谱联用技术进行分析。在12孔板的组织培养板插件中，接种100,000个HeLa细胞于2毫升DMEM培养基中，并在含5%二氧化碳的37摄氏度湿化培养箱中孵育24小时。移除培养基，将细胞在含有1毫升无血清DMEM的10微摩尔FITC-R8或FITC-sR8-4中于培养孔中继续孵育1小时。随后，移除含有肽段的培养基，并用 1 毫升 PBS 洗涤细胞三次。向培养小室中加入 1 毫升新鲜的不含 FBS 的 DMEM 培养基，然后将带有 HeLa 细胞的培养小室与组织培养板插入物共同孵育，使位于底部圆形盖玻片上的 HeLa 细胞孵育 2 小时。用 2.5% 戊二醛固定圆形盖玻片上的 HeLa 细胞 15 分钟，然后用 DAPI 染色 15 分钟。最后，在荧光显微镜下观察盖玻片上的HeLa细胞。此处展示了FITC标记的线性R8肽和FITC标记的订书钉式R8肽的合成示意图。该图显示了线性R8肽和订书钉式R8肽的HPLC和质谱图谱。固定化多肽的保留时间明显长于线性类似物，表明在使用疏水性交联剂进行环化后，该多肽的整体疏水性增强。该图示表示线性多肽与固定化多肽在含25%胎牛血清（FBS）条件下的稳定性。环化R8在与FBS孵育4小时后仍保持77.3%完整，而其线性对应物则大部分被降解，提示环化R8多肽的蛋白水解稳定性增强。孵育1小时后，用3微摩尔FITC标记的线性R8肽和FITC标记的订书针式R8肽处理的HeLa细胞和4T1细胞的活细胞荧光显微镜图像如图所示。可以看出，经含芳香族交联的环状R8处理的细胞其胞内荧光强度高于经线性R8处理的细胞。流式细胞术分析也获得了类似结果。为了进一步研究环状R8是否具有增强的细胞间穿透能力，采用Transwell模型来模拟肽从一个细胞层到另一个细胞层的屏障通透性。与线性R8肽相比，环状R8表现出更显著的跨屏障穿透能力，这通过细胞内荧光的显著增强得以证实。半胱氨酸的三苯甲基保护基及树脂的完全脱保护对于后续的环化步骤至关重要。此外，由于空间位阻效应，环化效率还取决于肽链的特定序列和长度。在此情况下，使用负载量较低的树脂，或在溶液相中以较低浓度进行肽链环化，将有助于提高效率。与线性对应物相比，这些环状肽表现出更强的细胞间通透性。我们认为它们在克服生物屏障方面具有巨大前景，并将在药物递送领域用于分子层面的进一步应用。

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可穿透细胞的蛋白质的构建

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利用超短自组装肽基质从SW1222细胞系构建和表征结直肠癌类器官

关键词：类器官，结直肠癌，SW1222细胞系，自组装肽，三维细胞培养，肿瘤模型，细胞外基质，癌症研究

学习利用芳香交联构建环状细胞穿透肽以增强疏水性和生物屏障穿透力的方法。该技术无需金属催化剂即可实现肽环化，为肿瘤药物递送提供了高效的新型分子转运工具。

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