Name: 结合透明和荧光显微镜，可视化基因表达的变化和对芸苔疟原虫的生理反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 了解利用振动切片和组织透明化技术对Plasmodiophora brassicae侵染的拟南芥根肿病组织进行荧光成像的方法。该技术可追踪基因表达、激素平衡及病原菌分布的动态变化。

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本研究由波兰国家科学中心 OPUS17 项目（编号 2019/33/B/NZ9/00751）资助，项目名称为&#34;根肿菌（Plasmodiophora brassicae）侵染植物中的长距离维管组织协调&#34;。我们感谢剑桥大学萨克勒研究所 Yrjö Helariutta 教授分享 proHCA2::erRFP 菌株。

1. 植物生长条件
<ol>
	<li>在短日照光照条件下培养拟南芥（Arabidopsis thaliana）植株，光照时间为9小时，温度为22 °C，黑暗时间为15小时，温度为20 °C，光照强度为120 µmol·m−2s−1（以冠层水平的光合有效辐射PAR计，参见材料表）。</li>
</ol>
2. 孢子接种物的制备
注意：详见 Fuchs 等人14。
<ol>
	<li>取两到三个来自大白菜植株（Brassica rapa var. pekinensis 栽培品种 &#34;Granaat&#34;）的冷冻瘤组织，加入含有300 mL经高压灭菌的蒸馏水的搅拌器中匀浆，然后通过四层无菌纱布过滤。</li>
	<li>将滤液在4 °C条件下以6,000 × g 离心5分钟，用刮勺机械去除孢子沉淀中的淀粉层。重复此步骤，直至大部分淀粉被去除。</li>
	<li>使用血细胞计数板13，通过计数20个不同视野区域中的孢子数量，测定孢子浓度。</li>
	<li>确保用于接种的孢子悬浮液终浓度为1 × 106 孢子·mL−1，用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）。在种子萌发后20天，每株接种2 mL校准后的孢子悬浮液。</li>
</ol>
3. 组织制备与固定
<ol>
	<li>准备植物组织。
	<ol>
		<li>小心去除根肿病感染植株和未感染植株根系上的土壤，用清水彻底清洗，并将下胚轴和根肿（长度在0.5–2 cm之间）收集至微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照以下步骤进行PFA固定（4%多聚甲醛，PFA溶于1×PBS + 0.01% Triton X-100）。
	<ol>
		<li>将4 g PFA粉末（见材料表）加入100 mL PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4，表1）中，在65 °C下搅拌溶解（勿煮沸）。逐滴加入KOH（10 M和1 M），调节至溶液澄清且pH约为11。</li>
		<li>用H2SO4调节pH至6.9，并加入0.01%（v/v）Triton X-100以增强固定效果。分装溶液后可于−20 °C保存（避免反复冻融）或置于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行组织固定。
	<ol>
		<li>将样品置于200–500 µL PFA固定液中，在室温下使用真空泵施加持续真空（700 mbar）固定1小时。确保样品完全浸没于PFA溶液中。 
		&#8203;注意：样品可在4 °C（冰箱）保存数周，后续用于切片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 组织包埋与切片
<ol>
	<li>使用4% w/v琼脂糖进行非侵染下胚轴和侵染瘤组织的琼脂糖包埋。加热煮沸溶液以溶解琼脂糖，待其冷却至仍具黏稠性时倒入模具。</li>
	<li>在纸巾上轻轻吸干物体数秒钟，以去除多余的PFA。</li>
	<li>使用牙签或镊子将植物样品小心地嵌入琼脂糖中并调整其方向。为避免切出斜切面，需确保样品方向和塑形正确，使其轴线与振动切片机刀片平面垂直（适用于径向切片）。</li>
	<li>为加速琼脂糖凝固，将&#160;在4 °C下将培养皿或多孔培养板放置10分钟。 
	&#8203;注意：如果物体过大（例如较大的虫瘿）， 拟南芥 在接种后21天（DPI），即使不使用琼脂糖包埋，该样品也可进行切片。</li>
</ol>
5. 振动切片机切片
注意：振动切片机配备有振动剃须刀片，可用于切割植物器官/组织。振动速度、振幅、刀片角度和切片厚度均为可调节的参数（参见材料表）。
<ol>
	<li>使用刀片小心地在琼脂糖块内切割并塑形目标物，并标记出切片时的优选方向。</li>
	<li>将琼脂糖块或较大的虫瘿用氰基丙烯酸酯快干胶和医用胶带固定在样品台（见材料表）上，以确保正确安装。</li>
	<li>对于Arabidopsis下胚轴及虫瘿（早期阶段），切片厚度应保持在30–40 µm，以获得高质量图像。 
	注意：若需分析虫瘿发育的后期阶段，切片厚度可设为50–80 µm。</li>
	<li>避免切取过薄的切片，因为刀片运动产生的振动可能破坏虫瘿样品。</li>
	<li>根据虫瘿的厚度和大小调整切片厚度、速度及振动幅度（通常为40 µm或60 µm）。</li>
	<li>向水浴中加入蒸馏水，开始切片操作。</li>
	<li>使用镊子或刷子小心收集切片，并转移至含有1 mL 1× PBS缓冲液（pH 7.4）的微量离心管中。 
	&#8203;注意：通常情况下，振动幅度越高，切片质量越好。对于未感染的下胚轴或不含成熟休眠孢子的虫瘿，可将振动幅度设为1.2 mm，速度设为0.60 mm·s−1；而对于体积较大、部分细胞完整性已丧失且可见孢子成熟迹象的虫瘿，则应将振动幅度降低至0.55 mm，速度调整为0.45 mm·s−1。</li>
</ol>
6. 样本透明化
<ol>
	<li>从微量离心管中移除1× PBS，并加入200–500 µL透明化溶液（表1）。</li>
	<li>此后，将样品置于室温避光条件下保存。确保样品始终完全浸没在透明化溶液中。</li>
	<li>若在样品处理过程中，透明化溶液的颜色随时间发生变化，需更换为新鲜溶液。 
	&#8203;注意：由于样品处理的影响，透明化溶液可能变为淡黄色。此时建议更换溶液，以提高组织透明化效果。</li>
</ol>
7. 染色步骤
<ol>
	<li>对于细胞壁的Calcofluor White染色（用于轮廓清晰的植物细胞），在透明溶液中配制5% v/v的Calcofluor White染色液（参见材料表），在避光条件下染色至少5分钟。</li>
	<li>对于用尼罗红染色脂质（用于染色休眠孢子及感染细胞中的油滴），在透明溶液中配制1 mg/mL的母液（参见材料表），再进一步稀释至1:99。在避光条件下染色至少10分钟。</li>
	<li>对于碱性品红木质素染色，在透明溶液中配制0.2% w/v的染色液（参见材料表），在避光条件下染色至少10分钟。 
	&#8203;注意：进行双重染色时，应先用尼罗红染色10分钟，再进行Calcofluor White染色。每一步染色后需去除多余的染色液。若观察到样品染色过深，可用透明溶液洗涤去除多余染料。如需稀释染色液，应使用透明溶液。始终在Calcofluor White染色之前完成尼罗红/碱性品红染色。若先进行Calcofluor White染色，可能会影响尼罗红对孢子的正常染色效果。</li>
</ol>
8. 显微镜观察
<ol>
	<li>将透明化处理的切片置于显微镜载玻片上，并在落射荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察（参见材料表）。使用透明溶液作为封片介质，以防止样品干燥。</li>
	<li>采用多种成像采集模式，以同时获取多个荧光光谱。 
	注意：本方案中使用的激发/发射光谱如下：尼罗红为553/636 nm，木质部自发荧光为380/475 nm，碱性品红为561/650 nm，荧光增白剂Calcofluor white为405/475 nm，erRFP为585/608 nm，GFP为488/509 nm（表2）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在虫瘿的振动切片机切片上应用透明溶液，无疑增强了研究芸薹油菜菌（P. brassicae）与寄主植物之间活体营养相互作用的能力。尽管该透明方案也可用于徒手切片，但在振动切片机切片上的效果更佳。使用PFA固定剂对样品进行固定是该方案中的关键步骤，因为固定后的样品可在4 °C下保存数天后再进行切片。这为样品在有限时间内储存提供了灵活性，同时在固定过程中不会影响荧光蛋白的表达与保存。
由于尼罗红（溶于DMSO或甲醇）具有疏水性，会溶解树脂并破坏树脂包埋的切片，因此不能用于树脂切片17。因此，振动切片机切片在研究病原体在发育中虫瘿内的分布及其生命周期时具有重要作用，其中可方便地使用尼罗红染色。
本方案中使用的透明溶液具有高度通用性12，可结合多种荧光染料，以不同组合对细胞壁的各种生物分子/组分（如栓质、木质素、纤维素以及真菌互作中的几丁质）进行染色。此外，还可对表达荧光GFP标记的品系切片进行复染，从而将启动子活性或蛋白质积累模式与病原菌在虫瘿特定细胞或区域的存在情况进行关联分析。然而，即使经过透明处理，木质部及充满病原菌的巨型细胞仍会产生背景自发荧光，无法完全消除。这在虫瘿发育后期观察荧光标记时构成一定局限性，尤其是在使用落射荧光显微镜检测微弱信号时更为明显。
由于荧光信号的表达/积累水平较低，转录因子难以被检测，但利用该技术可以获得令人满意的转录因子成像结果。总体而言，将振动切片与组织透明化方法相结合，拓展了对结构复杂的虫瘿组织进行组织学观察的技术手段。本方案具有良好的灵活性，可简化组织固定流程，并缩短对新鲜组织样本进行切片和成像以观察荧光蛋白及启动子活性所需的时间。通过进一步优化，并结合针对不同生物分子的其他特异性荧光染料，该方法将在致密、不透明且组织结构复杂的组织的组织学研究和图像分析中取得更大进展。近年来，所展示的这种组织透明化方法已成为一种广受欢迎且被广泛采用的方案，可用于联合检测并同时获取多种荧光信号11,12,13。此类技术未来的进一步发展与改进将显著提高在细胞水平上观察植物-病原体互作的图像分辨率。

受病原体或昆虫侵染的植物可能会产生异常结构（器官畸形或虫瘿），从而使入侵者能够吸收营养并繁殖1。本文采用一种高效的组织病理学方法，研究在原生生物Plasmodiophora brassicae侵染下植物地下部分所形成虫瘿内部发生的结构变化（图1）。该病原体带来的一个棘手问题是，P. brassicae的休眠孢子可在土壤中长期保持侵染能力。对于油菜（Brassica napus）的大规模种植而言，这是一个严重问题，因为经济因素限制了轮作制度的实施，导致土壤中休眠孢子不断积累2。油菜对P. brassicae引起的根肿病的抗性由遗传因素决定。然而，由于该病原体自身的生物学特性以及油菜起源时遗传背景狭窄，病原体常常能够突破抗性。因此，研究寄主植物在侵染后的响应机制，以及其延缓病害发展或阻止某些症状出现的能力，已成为当前的重要课题。
在根肿病中，病情严重程度通常根据根瘤的发育情况以及根系受损程度进行评估，这被称为病害指数（Disease Index-DI3）。然而，这种方法并不能全面反映植物与病原体相互作用的真实情况。特别是，它无法揭示病原体在根部内的分布情况，以及植物是否能够限制P. brassicae在其组织内的移动。此外，也难以预测P. brassicae对地下器官解剖结构重编程的程度。在模式植物Arabidopsis thaliana上的研究表明，P. brassicae感染会抑制木质部形成（包括起始和成熟阶段），同时促进根瘤中韧皮部的分化4,5。此外，在感病植株的根和下胚轴中，形成层细胞的子代细胞不会退出有丝分裂状态，其增殖时间比健康植株更长6。这一过程决定了根瘤的最终大小，并影响感病植株内病原体休眠孢子的产量。P. brassicae诱导的寄主发育、代谢和生理重编程极为复杂7；因此，应用能够观察根瘤内部变化的工具，对于准确评估这种互作至关重要。P. brassicae生命周期的进展伴随着寄主细胞代谢的重编程，这可表现为淀粉或脂质的沉积7,8。对根瘤进行显微观察的主要障碍在于其透明度较低。因此，目前大多数展示根肿病引起根瘤内部变化的组织学样本均采用固定-包埋（石蜡或树脂）技术，随后进行切片处理。这些方法已成功用于定位多个在根瘤中活跃表达基因的启动子活性4,5，或结合多种染色技术以观察P. brassicae生命周期的进程9。但需注意的是，固定和包埋步骤耗时较长，且可能导致重要生物分子（如脂质）部分或完全流失，从而显著影响某些观察结果。最近，研究人员利用荧光原位杂交技术（FISH）可视化了P. brassicae在寄主体内的生命周期进程，其中使用针对SABATH型甲基转移酶&#160;(PbBSMT)基因的特异性探针标记休眠孢子的形成10。另一种良好选择是采用其他基于荧光的方法，例如观察某些细胞组分的自发荧光、将基因5'上游调控区与荧光蛋白标记融合以检测其活性，或检测特定荧光标记蛋白的积累情况。然而，除了样本透明度低之外，这类方法的另一个主要缺点是需使用未固定的样本，这显著缩短了可获得高质量图像的时间。2015年，Kurihara等人11开发了一种透明化试剂，可在保持荧光蛋白稳定的同时提高植物组织样本的透明度，并且该试剂与多种组织学染色方法兼容。最近，该技术已被成功应用于可视化植物组织中不同的细胞壁组分12,13。本文中，该方案被用于分析根瘤发育的多个方面。整个流程包括根瘤固定、振动切片、组织透明化、染色及荧光成像。根据研究需求，所得切片可在染色前后直接使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察。该方法为研究基因表达的局部变化和生理响应（包括植物激素平衡与信号传导）提供了有效手段。通过观察休眠孢子的分布模式和成熟动态，可追踪病害发展进程。此外，该方案还可便捷地用于成像P. brassicae感染植株中的典型变化，例如木质部形成受抑，或在抗性基因型中表现为局部木质化的寄主防御反应。本方案中的示例来自对Arabidopsis thaliana模型植物的成像研究，但该方法同样适用于芸薹科（Brassicaceae）的其他作物种类。下述方法将有助于未来对P. brassicae感染植株中伴随根瘤形成的细胞结构和分子变化开展更深入的研究。
该实验方案的总体流程相当直接，所有根肿病发育阶段均可轻松成像并进行表征（图2）。由于P. brassicae是一种土传病原体，所有实验必须在基于土壤的系统中进行。该病原体偏好酸性环境，因此必须使用未经石灰处理的土壤基质。尽管P. brassicae对人类无害，但它是一种严格的植物病原菌，可通过土壤和水传播。因此，实验结束后，所有感病植株部分以及土壤均需通过高压灭菌或漂白剂处理予以彻底销毁。

<table><tbody><tr><td>2N 硫酸（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Roth</td><td>UN2796</td><td>pH 调节</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>PRONA</td><td>BGQT100</td><td>包埋</td></tr><tr><td>碱性品红</td><td>BIOSHOP</td><td>BSF410.5</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>Calcofluor White</td><td>Sigma Aldrich</td><td>18909-100ML-F</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>市售漂白剂</td><td>Domestos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯/瞬干胶</td><td>Kropelka</td><td></td><td>粘合剂</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>BIOSHOP</td><td>DMS555.500</td><td>溶剂</td></tr><tr><td>落射荧光显微镜</td><td>Carl Zeiss M2 自动化落射荧光显微镜，配备 Colibri LED 系统</td><td>Carl Zeiss M2</td><td>Carl Zeiss 滤光片组&lt;br/&gt; 使用滤光片组 38、43、49</td></tr><tr><td>全自动振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>照度计/光度计</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>LI-250A + LI-190R 量子传感器</td><td>用于测量&amp;nbsp;400–700 nm（光合有效辐射，PAR）波段内的光照强度</td></tr><tr><td>遮蔽胶带</td><td></td><td></td><td>用于将琼脂糖块粘附在模具上</td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog 培养基（MS 培养基）</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>MO222.0050</td><td>植物生长培养基</td></tr><tr><td>尼罗红</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N3013-100MG</td><td>荧光染料</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127-100G</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>POCH</td><td>739740114</td><td>PBS 组分</td></tr><tr><td>氢氧化钾（KOH）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1767-250G</td><td>pH 调节</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>BIOSHOP</td><td>PPM302.500</td><td>PBS 组分</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>BIOSHOP</td><td>SOD001.1</td><td>PBS 组分</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6750-25G</td><td>透明溶液</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; &amp;middot; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>POCH</td><td>799490116</td><td>PBS 组分</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSHOP</td><td>TRX506.100</td><td>固定剂</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>透明溶液</td></tr><tr><td>真空/压力泵及干燥器</td><td>Welch by Gardner Denver</td><td>2522C-02</td><td>用于真空浸润</td></tr><tr><td>木糖醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X3375-25G</td><td>透明溶液（组分）</td></tr></tbody></table>

结合透明化技术与荧光显微镜观察基因表达变化及对plasmodiophora brassicae的生理响应

Combining Clearing and Fluorescence Microscopy for Visualising Changes in Gene Expression and Physiological Responses to Plasmodiophora brassicae

土壤原生生物Plasmodiophora brassicae侵染芸薹属作物会导致地下器官形成根瘤。根瘤的形成需要对寄主植物细胞进行重编程，并改变其代谢过程，从而建立一种以病原体为导向的生理“库”，使寄主的营养物质被重新定向输送至该部位。为了全面理解这种特殊的植物-病原体互作关系，以及寄主生长发育被干扰和重塑的机制，必须在细胞分辨率水平上追踪并观察伴随根瘤形成所发生的内部变化。目前常采用荧光染料与荧光蛋白相结合的方法来研究植物的解剖结构和生理响应。然而，根瘤体积较大且透光性差，严重阻碍了显微镜下对整体样本的观察。此外，低透明度也限制了荧光显微技术在根肿病发展过程及根瘤形成研究中的应用。本文介绍了一种优化的根瘤固定与透明化方法，以促进利用落射荧光显微镜和共聚焦显微镜对P. brassicae侵染所形成的根瘤进行观察。该方法首先采用快速光学透明化组织清除方案，随后进行振动切片，以检测解剖结构变化，并通过启动子融合及荧光蛋白标记的报告基因系实现基因表达的定位分析。该技术方法还可广泛应用于研究其他由病原体诱导产生的植物结构中的细胞与生理响应，例如线虫诱导的合胞体和根结，以及昆虫引起的叶瘤和组织畸形。

利用可染色脂质和角质的尼罗红，可以观察到含有脂质的病原菌休眠孢子（图3A、B）。因此，通过双重染色可获得清晰的图像，用于观察病原菌在虫瘿内的分布模式。使用Calcofluor White进行复染可产生对比度，并有助于同时追踪木质部发育与芸薹油菜菌（P. brassicae）成熟的过程（图3B）。
也可通过观察未染色样品中的自发荧光（图4A）或使用碱性品红等染料对木质素进行荧光成像（图4B）来检测木质部的形成与发育。
通过该方法，可追踪基因表达变化或对生长调节剂的响应。一个典型的例子是 拟南芥 携带……的植物 pHCA2:erRFP 构建体被用于可视化 高形成层活性2（HCA2） 根肿病瘤韧皮组织中的基因表达。 HCA2 基因活性先前已在分生活跃的形成层和韧皮系细胞中被发现15在此处，它在后期与韧皮部共定位 P. brassicae驱动的虫瘿发育，其活性反映了 P. brassicae 增加韧皮部复杂性（图5）。最终图像显示，在虫瘿发育的晚期阶段，当形成层发生断裂时，韧皮部出现增殖现象。 图5A 显示了虫瘿未清除的手部切片，而 图5B 经振动切片后进行组织透明化处理，可获得更为清晰且定位明确的荧光信号。样品使用Calcofluor White进行复染。 图6 比较该图像（图6B) 与经树脂包埋并用切片机切片的虫瘿中显示的相似区域图6A) 在接种后21天。通过检测感染植株与非感染植株中细胞分裂素响应差异，评估了以下基因的表达情况 TCS:GFP (双组分信号转导标记物16 在发育中的虫瘿中（图7）。在对虫瘿及具有次生增厚的组织中较弱的GFP信号进行成像时，需注意成像过程中也会捕获成熟木质部细胞自发荧光所产生的额外背景信号。
<img alt="甘蓝型油菜，拟南芥根部感染，植物响应，比较，26 天接种后结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64297/64297fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：油菜根肿病症状（B. napus）和 拟南芥 （Columbia-0）在26天接种后 Plasmodiophora brassicae 孢子 在病程过程中，整个根系会形成大型根瘤，导致根系极为脆弱。最终，病原体会向周围土壤中释放孢子，以促进后续感染。植株地上部分也表现出生长和发育不良的症状。当根系完全受损，植株无法再耐受病害时，感染植株便会因生长代谢和发育受到严重破坏而死亡。比例尺为1 cm。-INF 表示模拟接种，+INF 表示接种病原体 P. brassicae接种后的植株。此次提供油菜植株在去除土壤前的照片，以展示健康的根系。清洗后，仅收集下胚轴和根的上部。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64297/64297fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="植物组织制备过程；根部清洗、切片、显微成像工作流程示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64297/64297fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 2"> 
图2：总体工作流程。 清洗后的Arabidopsis根系经过（A）解剖、（B）固定、（C）琼脂糖包埋、（D）装片，以及（E）在振动切片机上进行切片。所得样品需进行组织透明处理（室温避光条件下，耗时3天至数周，具体时间取决于组织类型和厚度）。（F）透明处理后的样品可进行染色，并在显微镜下观察。（G）工作流程总结。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64297/64297fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="使用尼罗红和卡氏白染色法对植物细胞中的芸薹油菜菌进行荧光显微观察。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64297/64297fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：利用尼罗红染色标记病原菌孢子。（A、B）尼罗红可特异性染色休眠孢子中的脂质，非常适合用于追踪P. brassicae的成熟过程。（A）被P. brassicae定殖并充满病原菌孢子的膨大细胞。（B）成熟的木质部细胞也会被尼罗红染色。该切片经卡氏白复染以显示寄主细胞的结构布局（A：物镜倍数 = 20x，切片厚度 = 60 µm；B：物镜倍数 = 5x，切片厚度 = 60 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64297/64297fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="自发荧光和染料标记的显微镜图像显示植物细胞壁，比例尺为 100 µm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64297/64297fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 4"> 
图 4：追踪木质部发育和成熟程度。 （A）木质素在紫外光激发下产生强烈的自发荧光；因此，成熟的木质部可以相对容易地被区分。（B）使用碱性品红和Calcofluor进行双重染色可获得更好的效果，因为后者可对所有细胞染色，而成熟木质部则被碱性品红单独显著染色。通过这种方法，双重染色提供了对比度更佳的图像，清晰地展示了木质化过程的明显抑制（A：物镜倍数 = 10x，切片厚度 = 60 µm；B：物镜倍数 = 10x，切片厚度 = 60 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64297/64297fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物组织荧光显微镜；手切片与振动切片机切片中 proHCA2::erRFP 的表达。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64297/64297fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：P. brassicae 感染后 21 天（DPI）的植物下胚轴中 HCA2 基因的韧皮部特异性信号。携带 proHCA2::erRFP 的转基因 Arabidopsis thaliana 的启动子活性如图（A）和（B）所示。在未透明化的手切片（图 A）中，由于细胞层的重叠和叠加，尤其是切片不平整时，erRFP 信号呈现弥散状；而在组织透明化后的振动切片（图 B）中，erRFP 信号可精确标记成熟维管束中的韧皮部细胞（物镜 = 20x，切片厚度 = 60 µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64297/64297fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="植物解剖显微切片染色与振动切片透明化显微成像对比，突出细胞结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64297/64297fig06v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：利用荧光成像对比甲苯胺蓝染色、树脂包埋及显微切片处理的虫瘿。（A）甲苯胺蓝（TB）染色、树脂包埋并经显微切片的虫瘿图像对比，以及（B）利用荧光成像获得的一个代表性样本（亦见于图5B）。木质部细胞用黄色星号标记，形成层区域用亮绿色括号标记，韧皮部用青色星号标记，被Plasmodiophora brassicae定殖的细胞用白色PB符号标记。树脂包埋切片（A）可提供良好的分辨率，适用于研究增生器官中休眠孢子的分布、病害发展程度，以及抗性植物中的局部木质化等其他过程。然而，本文所述方法（B）能够灵敏地观察基因表达或蛋白质积累，并可视化其他生理变化以及重要分子（如孢子中的脂质）。（<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64297/64297fig06largev2.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="根横切面的共聚焦显微镜图像（-INF 和 +INF），GFP 与荧光增白剂白染色。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64297/64297fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：追踪非侵染（-INF）和侵染条件下下胚轴中的细胞分裂素信号响应 P. brassicae-感染（+INF） 拟南芥 接种后16天的植物。 TCS::GFP 标记用于表征 在植株内 细胞分裂素响应。振动切片经透明处理后，使用Calcofluor white染色。根据图像显示，在16天接种后（16 DPI），感染植株的虫瘿中细胞分裂素响应明显减弱（右图），而在未感染植株中该响应仍较强，尤其是在韧皮部区域（即最终将分化形成韧皮组织的细胞）（左图）（物镜 = 5x，厚度 = 30 µm). 木质部的某些水平自发荧光也可能可见。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64297/64297fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">透明溶液（有毒）</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成分</td>
			<td>百分比 (%)</td>
			<td>每 100 mL 蒸馏水中的用量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylitol</td>
			<td>10%</td>
			<td>10g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>15%</td>
			<td>15g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>25%</td>
			<td>25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">10x PBS（磷酸盐缓冲液）</td>
			<td>1x PBS（100 mL）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>8 g</td>
			<td>10 mL 10x PBS + 90 mL 蒸馏水</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>0.2 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>0.24 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 · 2H2O</td>
			<td>1.81 g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled water</td>
			<td>100 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH</td>
			<td>用 HCl 调节 pH 至 7.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">高压灭菌后于 4 °C 保存。</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：透明溶液和磷酸盐缓冲液（PBS）的组成。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>荧光染料/标记</td>
			<td>激发/发射波长</td>
			<td>所用显微镜滤光片组</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nile Red</td>
			<td>553/636 nm</td>
			<td>filter set 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>木质部自发荧光</td>
			<td>380/475 nm</td>
			<td>filter set 49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor White</td>
			<td>405/475 nm</td>
			<td>filter set 49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>碱性品红</td>
			<td>561/650 nm</td>
			<td>filter set 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>erRFP</td>
			<td>585/608 nm</td>
			<td>filter set 43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>488/509 nm</td>
			<td>filter set 38</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：本研究选用的激发/发射光谱。

本实验方案描述了一种用于组织学观察由植瘿昆虫诱导产生的虫瘿的优化方法 芸薹根肿菌 下胚轴的振动切片在荧光成像前进行透明化处理，以研究转录因子和植物激素在病程进展中的作用。该方案克服了树脂包埋的局限性，能够实现 在植株内 荧光蛋白的可视化

结合透明化技术与荧光显微镜观察基因表达变化及对Plasmodiophora brassicae的生理响应

芸苔属作物被土传原生生物芸苔根肿菌（Plasmodiophora brassicae）侵染后，会导致地下器官形成根瘤。根瘤的形成……

芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）是一种土传的专性活体营养型病原菌，可侵染十字花科（Brassicaceae）植物。侵染后，该病原菌会诱导植物地下部分形成根瘤，因此该病害被称为根肿病。根瘤的形成伴随着极为复杂的重编程过程。因此，在疾病发生过程中追踪内部变化的可能性，对于理解这种植物-病原体互作至关重要。我们的实验方案改进了对结构复杂、组织较厚以及虫瘿的成像效果，便于观察基因表达变化、生理响应、植物激素平衡、病害发展进程、孢子分布以及局部木质化等现象。该方案可保护样品中的荧光蛋白，实现对样本的长期保存和处理。同时，它还能够追踪伴随疾病进展发生的生化和结构变化。本次实验操作将由本课题组的博士后研究员 Sara Blicharz、本实验室的博士研究生 Deeksha Singh，以及来自亚当·密茨凯维奇大学 Agnieszka Bagniewska-Zadworna 教授课题组的博士研究生 Kornel Michalak 演示。首先准备植物组织。小心去除根肿病感染植株和未感染植株根系上的土壤，用清水彻底清洗，并将下胚轴和根瘤收集到微量离心管中。使用真空泵施加 700 毫巴的恒定真空，在室温下用 200 至 500 微升多聚甲醛固定液固定样品 1 小时。确保样品完全浸没在多聚甲醛溶液中。使用 4% 琼脂糖包埋未感染的下胚轴和感染的根瘤。将溶液煮沸以溶解琼脂糖，待其冷却但仍保持黏稠时倒入。将样品在纸巾上轻轻干燥数秒，以去除多余的多聚甲醛。使用牙签或镊子小心地将植物样品包埋并调整其在琼脂糖中的方向。为防止产生斜切面，应确保样品方向正确并包埋妥当，使其轴线与振动切片机刀片平面垂直。为加速琼脂糖凝固，可将培养皿或多孔板置于4°C环境中10分钟。使用刀片在琼脂糖块内小心切割并塑形样品，注意标记切片时的优选方向。使用氰基丙烯酸酯胶水或快干胶以及医用胶带，将琼脂糖块或较大的虫瘿牢固地粘附在样品台上。根据虫瘿的厚度和大小，调整切片厚度、切片速度和振动幅度。向水浴中加入蒸馏水，开始切片。 使用镊子或毛刷小心收集组织切片，并将其转移至含有1毫升1×PBS缓冲液的微量离心管中。移除微量离心管中的1×PBS，加入200至500微升透明化溶液。在样品处理过程中，若透明化溶液颜色随时间发生变化，需更换为新的透明化溶液。通过在透明溶液中配制5%的Calcofluor White染液，对植物外层细胞的细胞壁进行染色。然后在避光条件下染色至少五分钟。按照文本稿件中的描述，用尼罗红染脂质，用碱性品红染木质素，并将透明处理后的切片置于显微镜载玻片上观察。然后在落射荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察细胞。采用多种采集模式，以同时成像多个荧光光谱。通过尼罗红染色后，可追踪被芸薹根肿菌（Plasmodiophora brassicae）定殖的根瘤中的疾病动态及病原体积累情况，并观察到含有P. brassicae休眠孢子的大型细胞。利用碱性品红染色法观察了根肿菌（P.brassicae）侵染后木质部分化的变化。使用携带pHCA2:erRFP构建体的拟南芥植株，以观察根肿瘤中韧皮部组织内HCA2基因的表达。在根肿菌诱导的瘤状结构发育的后期阶段，HCA2与韧皮部共定位，其基因活性反映了根肿菌增加韧皮部复杂性的分子机制。接种后16天，通过检测发育中虫瘿中TCS:GFP标记的表达情况，评估了感病植株与非感病植株之间细胞分裂素响应的差异。在感病虫瘿中，细胞分裂素响应明显减弱，而在非感病植株中则保持较强，尤其在韧皮部区域更为显著。最关键的步骤包括PFA固定、包埋和切片。进行振动切片时，需要优化并仔细调整速度、振幅和厚度参数，以获得高质量的切片。振动切片与组织透明技术为增强显微分析植物-微生物互作过程中的生理响应以及具有次生生长和复杂细胞结构的组织提供了重要途径。

combining-clearing-fluorescence-microscopy-for-visualising-changes

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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