Name: 应用于 果蝇 微生物组的 96 孔板形式的快速菌落形成单位计数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学习使用96孔板快速菌落形成单位计数法分析果蝇肠道微生物组。该方法通过自动化成像和DIY设备，将传统CFU计数效率提高百倍，适用于无菌果蝇的微生物定量研究。

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Kerwyn Casey Huang 博士、Andrés Aranda-Díaz 博士、Ted Cooper 以及 Ludington 实验室的成员为本实验方案的开发提供了宝贵的建议。本研究获得了美国国家科学基金会（NSF）IOS 项目 2032985 号、美国国立卫生研究院（NIH）DP5OD017851 项目、加拿大卡内基机构资助项目以及卡内基科学研究所基金的支持。

1. 果蝇定殖
注意：本方法适用于通过菌落形成单位（CFU）的培养计数，对具有可培养肠道微生物组的果蝇进行定量分析。有关无菌果蝇培养的详细方案此前已有发表12。
<ol>
	<li>建立一种共生细菌物种的稳定定植。
	<ol>
		<li>制备新鲜的细菌培养物，于室温下以 400 × g 离心 3 分钟收集菌体，并用 PBS 重悬菌体沉淀至 OD600 为 1.0。在本实验方案中，Lactiplantibacillus plantarum（以前称为 Lactobacillus plantarum）在培养过夜后达到 OD600 为 2.0。</li>
		<li>用移液器将 100 µL 菌液滴加到果蝇培养管的食物表面（参见材料表）。均匀涂布，静置 15–30 分钟使液体完全吸收。</li>
		<li>使用标准的培养管翻转技术，将 20 只无菌果蝇转移至该培养管中34。每只果蝇将摄取大致相等剂量的细菌35。也可选择添加无菌卵。</li>
		<li>连续 3 天每天将果蝇转移至含新鲜无菌食物的培养管中。所有操作均应在生物安全柜中进行，并采用无菌操作技术（图 1A-1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在测定 CFU 负荷之前，将果蝇转移至含有无菌水琼脂的培养管中，静置 4 小时，以清除肠道中的短暂性细菌。水琼脂培养管可为果蝇提供水分来源，但不提供营养，因此既不能支持果蝇长期生存，也不能支持表面细菌生长。水琼脂培养管的制备方式与标准果蝇培养管相同，但仅包含去离子水和 1.5% 琼脂。</li>
</ol>
2. 在96孔PCR板中单独匀浆果蝇
<ol>
	<li>提前准备珠磨板。
	<ol>
		<li>将0.5 µm玻璃珠（参见材料表）倒入珠计量托盘中（使用补充代码文件1 S1-bead-measurer.stl文件3D打印制成）。将珠子铺在托盘上，使所有孔穴填满并保持水平，然后将多余的珠子刷入锥形管中回收。</li>
		<li>将半裙边PCR板（参见材料表）倒置放在计量托盘上，并通过嵌入托盘上的凹槽对齐孔位。然后迅速翻转，以转移珠子。</li>
		<li>清除PCR板表面多余的珠子，并用铝箔覆盖。检查PCR板，确保所有孔中均含有珠子。如有需要，可使用称量勺向单个孔中添加珠子。若因静电导致珠子粘附在板表面，可用70%乙醇擦拭或喷洒计量托盘背面及PCR板。</li>
		<li>用铝箔覆盖。可按此方法制备多个板，随后进行高压灭菌并储存以备后续使用。使用前，用96通道移液器向每孔加入100 µL PBS（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在均质化前，用70%乙醇对携带微生物的果蝇（见步骤1）进行表面灭菌。
	<ol>
		<li>用100% CO2麻醉果蝇5秒。使用小漏斗将麻醉后的果蝇从试管转移至1.5 mL微量离心管中（图1A-2）。本研究中，通常每管加入25只果蝇。</li>
		<li>立即向管内喷入约1 mL 70%乙醇，盖紧管盖，倒置混匀10秒。然后用P1000移液器吸除乙醇，注意避免吸出果蝇。重复乙醇洗涤一次，再用无菌PBS洗涤两次（图1A-3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后一次PBS洗涤后，盖上管盖，将管倒置，管盖朝下，在实验台上用力敲击数次，使果蝇进入管盖内。</li>
	<li>打开管盖，用镊子将果蝇分装至各孔中（图1A-4）。每孔放入一只果蝇（图1A-5）。加样过程中保持板置于冰上，以维持果蝇的麻醉状态。</li>
	<li>使用Thermal Bond热封铝箔密封板（参见材料表）。
	<ol>
		<li>首先，清除靠近孔周围的散落珠子，以免造成铝箔密封泄漏。确保铝箔哑光面朝下接触板面，光面朝上朝向热封仪。将热封仪（参见材料表）牢固压下5秒（图1A-6）。使用手动压合器（参见材料表）压平，以确保铝箔密封牢固。 
		注意：密封不良可能导致样品损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将板固定在板式振荡器中。均质5分钟（图1A-7）。在微型板式离心机（参见材料表）中以350 × g离心30秒，使液体从密封铝箔上脱离。</li>
	<li>取下铝箔时，用手握住板体，避免果蝇匀浆液滴从孔中溅出。</li>
</ol>
3. 果蝇匀浆液的系列稀释及点样至菌落形成单位（CFU）平板
<ol>
	<li>在生物安全柜中放置四个矩形 MRS 琼脂培养板（参见材料表），并移去盖子。本方案中使用 MRS 琼脂培养 L. plantarum。&#160;将这些平板晾干至少 10 分钟（若为新倒制或从冷藏保存中取出，则需晾干 20 分钟）。 
	注意：如果平板表面潮湿，来自 96 孔板的液滴会融合流动，导致计数失败。</li>
	<li>使用 96 通道移液器，在无菌 96 孔板的每孔中加入 100 µL PBS，制备三个稀释板。将一盒 P20 吸头装入 96 通道移液器。</li>
	<li>通过从第 2 节制备的样品板中吸取 11.1 µL 匀浆液，进行 1:10 稀释（图 1A-8）。务必从孔的中部吸取液体，而非底部，因为果蝇匀浆液和玻璃珠会堵塞移液器吸头。玻璃珠下沉，果蝇碎片上浮，中间层相对澄清。</li>
	<li>将 11.1 µL 液体加入已预先装有 100 µL 无菌 PBS 的第一稀释板中。将稀释板置于板式摇床上，以 600 rpm 振荡 10 秒。再通过上下吹打 5 个循环进行混匀。从第一稀释板中转移 11.1 µL 至第二稀释板，并对后续两个稀释板重复相同的混匀步骤。</li>
	<li>按以下方法进行系列稀释涂布。
	<ol>
		<li>从生物安全柜中取出培养板。</li>
		<li>从最稀释的孔开始，使用 96 孔移液器将每孔中的 2 µL 液体点样至琼脂平板上（图 1A-9）。
		<ol>
			<li>缓慢将移液器头部压下至平板表面，注意不要刺入琼脂。仔细检查平板，确保所有点样已完成；如有遗漏，手动补加 2 µL 至相应位置。确认液体点迅速被琼脂吸收，且不发生融合。</li>
			<li>若点样液滴发生融合，需延长新一组新鲜琼脂平板的干燥时间并重新点样。若存在多种类型的平板（例如不同培养基或含抗生素），也应同时进行点样。将剩余溶液重新加回稀释板中，并进入下一个更高浓度的稀释步骤。 
			注意：在进行稀释点样时，应对下一个稀释度吹打混合 5 次，以确保移液器吸头内无前一稀释度残留。稀释板可在 4 °C 下保存 &#62;8 小时而不影响菌落计数35。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对剩余稀释板重复步骤 3.5 所述的涂布过程，从最稀释到最浓依次进行，直至原始匀浆液所在的平板。</li>
	<li>待所有液体完全被琼脂吸收后，将平板倒置放入培养箱中（图 1A-10）。对于来自 Drosophila 的 Lactiplantibacillus 和 Acetobacter，在 MRS 培养基上的最适培养温度为 30 °C。培养至菌落达到最佳大小：即菌落足够大以便清晰观察，但又不至于过大而相互融合或干扰生长（参见代表性结果部分对最佳大小的量化说明）。 
	注意：最佳培养条件因菌株而异，需通过实验确定。对于来自 Drosophila 的 Lactiplantibacillus，在 MRS 琼脂上最适培养时间为 26 至 30 小时；对于来自 Drosophila 的 Acetobacter，最适培养时间则为 30 至 48 小时，具体取决于菌株。</li>
	<li>培养结束后，如需等待计数，可将平板储存于 4 °C。</li>
</ol>
4. 菌落形成单位（CFU）的定量分析
<ol>
	<li>通过拍摄平板照片，然后使用自动化软件计数菌落形成单位（CFUs），具体方法如下所述。如果平板曾保存在4 °C环境中，应先使其恢复至室温，以避免平板表面产生冷凝水而造成反光。</li>
	<li>将平板按逻辑顺序排列，并在拍摄过程中保持该顺序，以便于文件命名。将所有平板的方向调整为A1位于左上角。建议在A1角标记唯一编号，以防止照片混淆。将每个稀释梯度系列按顺序叠放。</li>
	<li>取下平板盖，将平板放置在成像台上，确保A1角位于正确的位置。本实验提供了平板拍照箱的设计文件（补充文件1，补充文件2），该装置专为拍摄此类培养皿而优化，包含照明和滤光片选项，可用于荧光菌落成像。</li>
	<li>对平板进行成像。使用相机（见材料表）并设置手动模式，以确保各平板间曝光水平一致。建议采用较长焦距设置，以最小化透视畸变。使用遥控快门拍摄照片，以减少因相机抖动造成的模糊。</li>
	<li>将图像传输至计算机，并重命名文件，文件名应包含实验名称、培养基类型、稀释倍数及其他相关细节。某些操作系统（见材料表）在文件管理器中提供了批量重命名功能，可通过右键点击所选文件实现。</li>
</ol>
5. 使用 Count-On-It 套件进行自动菌落计数（补充文件 3）
<ol>
	<li>使用 ImageJ 的 Croptacular 插件（补充代码文件 2）对图像进行裁剪。该插件可将图像划分为有序的子区域阵列（例如，96 孔板为 8 × 12）。各个子区域将被单独计数。 
	注意：用于计数圆形培养皿的另一个插件 Circus 在 补充代码文件 3 Circus_.ijm 中有描述。
	<ol>
		<li>将需要进行定量分析的图像整理到一个文件夹中。选择能够区分不同培养皿的文件名，因为这些文件名将成为每组计数结果的列标题。在该文件夹内，创建名为 &#34;cropped&#34; 和 &#34;receipts&#34; 的子文件夹。</li>
		<li>启动 Croptacular，&#160;然后点击 OK 开始裁剪。 
		注意：默认设置已显示，通常已足够使用。但根据图像分辨率、光照条件、斑点大小等因素，可能需要调整基础参数。</li>
		<li>如果图像已经对齐，直接按 空格键 即可。否则，沿应变为水平的一条边缘绘制一条直线以校正图像方向。若图像仍未对齐，可多次重绘该直线直至图像对齐。</li>
		<li>接下来，绘制需要计数区域的边界框。调整其大小和比例，确保所有斑点均位于各自的孔位内。将光标拖动至边界框外可刷新网格。当网格显示合适时，按 空格键。</li>
		<li>确保下一张图像会自动旋转至与第一张相同的角度；插件假定所有照片的朝向一致。若确实如此，请按 空格键 继续。否则，需如前所述重新校正图像。网格也会沿用上一张图像的位置；必要时进行调整，然后按 空格键。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用提供的 ImageJ 插件 Count-On-It: Gridiron 对培养皿上的菌落进行计数（补充代码文件 4）。有关安装和使用该插件的详细说明包含在 补充文件 3 中。
	<ol>
		<li>启动 Count-On-It &#62; Gridiron。 使用与 Croptacular 相同的网格设置。用户可批量处理整个文件夹、分析单张图像，或从当前图像开始处理。</li>
		<li>根据像素强度的上限和下限值设置阈值。在确保所有菌落均被选中的前提下，尽可能严格地设定阈值。理想情况下，被选中的菌落之间应留有一定空间，但软件具备一定程度的斑点分割能力。当阈值设置满意后，在 &#34;Action Required&#34; 对话框中点击 OK。</li>
		<li>为检查结果，可放大图像并仔细查看菌落计数。点击取消将中止插件运行。点击 OK 继续。</li>
		<li>在第一张图像上，应提供继续或返回设置菜单的选项，例如用于更改最小菌落尺寸。若要继续批量处理，请点击 OK。然后选择一个文件夹以保存收据和结果表格。可使用 &#34;receipts&#34; 文件夹，或创建新文件夹。</li>
		<li>处理完第一张图像后，后续图像将默认采用与之前相同的阈值设置。点击 OK 使用这些设置，或进行调整。如果照片一致性良好且设置准确，请在 &#34;Action Required&#34; 对话框中点击 OK。 
		注意：当批量处理中的所有图像完成后，结果表格将自动保存在与收据相同的文件夹中。</li>
		<li>检查软件生成的计数收据，并手动修正任何计数错误。ImageJ 插件在统计上是准确的，但仍可能出现错误。需审阅收据以检查异常值并识别误计数。软件会将 CFU 数据保存为 .csv 文件，与收据位于同一文件夹中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用用户偏好的软件对数据进行分析。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文所展示的详细技术能够实现 &#62;菌落形成单位（CFU）计数实验中可评估样本数量增加100倍。该技术推动了微生物组实验现有方法的进步 果蝇12,35,36 采用96孔板形式对单只果蝇进行检测。此外，该方法应用了更为高效的点样接种技术19,31 以及结合摄影和菌落计数平台的自动化工作流程。该方法的重要性在于 黑腹果蝇 将实验标准化为96孔板格式，可实现大量生物学重复的同步处理，并通过自动化完成菌落形成单位（CFUs）的高通量定量。
96孔平台表明，增加传代频率以及 &#34;透明化&#34; 短暂性细菌的存在会导致样本间平均丰度及变异性的显著降低（图1B,C)，表明该改进后方案的严谨性。共饲养果蝇的一个局限性在于果蝇之间可能发生细菌的水平转移。一种建议的解决方案是将果蝇单独饲养于96孔板中，例如Whole Animal Feeding Flat38.
尽管用乙醇清洗果蝇时未观察到细菌载量显著减少，但这些果蝇仅在外界细菌存在条件下饲养了3天。更长时间的饲养可能使细菌载量进一步积累39。因此，仍建议使用乙醇进行清洗。
将果蝇转移至96孔板是建立实验流程的关键第一步（图1A）。果蝇清洗后，需逐个分配到各孔中。此阶段使用板图有助于记录每个孔中的实验条件，并添加备注，例如&#34;果蝇丢失&#34;。匀浆是另一个关键步骤，需注意若干重要事项。当细菌与果蝇共存时，其可在匀浆过程中存活（图1D、E），推测当细菌位于果蝇肠道内时，该原理同样适用。然而，若仅将细菌置于珠磨板中进行匀浆，细菌则会被杀死，表明在某些情况下匀浆过程可导致细菌细胞死亡；若研究中涉及对解剖所得肠道进行匀浆，则此局限性需特别关注。值得注意的是，匀浆过程中菌落形成单位（CFU）的损失程度取决于样品中CFU的数量，当每孔使用约105 CFU时，损失最小。进一步减少CFU损失的方法是在匀浆进行到一半时暂停，并将板置于冰上冷却。
根据对照实验，本方案中匀浆处理时间为5分钟，实验中将已知数量的菌落形成单位（CFUs）与无菌果蝇混合，该时间在经验上适用于果蝇细菌的处理。较短的振荡时间会导致较大的果蝇组织碎片残留，干扰移液操作；而显著延长的匀浆时间（约10分钟）则会使CFU计数的变异性增加。观察发现，由于锥形板孔体积较小且形状倾斜，与圆柱形2 mL离心管相比，其珠磨破碎效率有所降低。该通用方法存在多种可调整的参数，包括所用的细菌菌株、珠磨容器、研磨珠类型以及果蝇基因型等。不同用户需根据自身实验条件使用阳性对照来确立适宜的实验方案。
点板法以特定方式进行：将 L. plantarum WF 在 PBS 中进行 1:2 稀释后，点样至 MRS 平板上，并在 30 °C 下培养 2 天（若需获得更小的菌落大小，可采用较短的培养时间）。该方法需要前期投入一些设备，主要是珠磨机和 96 通道移液器（图 2A），这两者对于稀释系列和点板操作均是必需的。然而，也存在成本较低的替代方案，例如使用带槽针头的 96 孔板复制器。稀释系列是一个关键步骤，直接影响 CFU 计数结果的准确性。就可能的失败模式而言，移液吸头可能被果蝇残体或玻璃珠堵塞，或吸头未能与移液器正确密封，或其他原因导致失效。所有这些问题都会导致受影响孔中的菌落计数偏低，应加以监测。在稀释系列的每一步中充分混匀也至关重要。每次稀释应通过将平板置于平板振荡器上振荡，或通过上下吹打 15–20 次进行充分混匀，后者还可起到冲洗吸头的作用。通过从最稀释的平板向最浓的平板依次点样，可实现吸头在整个稀释系列中的重复使用。采用 1:2 稀释时，菌落计数在 2–25 个菌落范围内准确，覆盖一个数量级（图 2C）。因此，使用 1:10 稀释可节省时间和材料。另一个可利用的变量是培养时间，可通过调整培养时间以产生更小的菌落，从而防止相邻菌落融合，扩大可计数点的范围。
拍摄平板的高质量照片至关重要，因为照片将作为分析菌落形成单位（CFUs）的原始数据，并可无限期存档。FluoroBox 设计用于拍摄光照强度均匀的平板照片，从而最大限度减少琼脂表面的反光。此外，该设备可通过单色 LED 光源和彩色摄影滤光片选择性地拍摄荧光菌落图3A）。构建类似FluoroBox的装置，通过控制光照和相机设置，可显著提高菌落形成单位（CFU）图像的可重复性，这对于自动化分析至关重要。利用所拍摄的照片，可分析菌落形态、荧光强度以及时间或密度对菌落生长的影响等多种特性。若不使用荧光细菌，照片拍摄箱可省去彩色滤光片和单色光源，从而降低成本和复杂性。若实验室使用不同的荧光染料，可替换相应的激发光源和发射滤光片。通过应用程序将相机连接至平板电脑的WiFi功能，不仅可利用自动快门功能避免抖动，还便于数据传输。图像可通过无线文件传输软件先传至平板电脑，再传至笔记本电脑。具备上述功能的推荐相机已在下文列出 材料表.
Count-On-It 是一个用 ImageJ 编写的插件。该自动菌落形成单位（CFU）计数软件将平板图像分割为均匀的 96 孔网格，统计每个网格单元中的菌落，并将结果批量导出为一个简单的电子表格。由于点阵在平板上的位置以及拍摄照片时的位置总会存在差异，用户必须使用 Croptacular 插件手动调整网格以匹配照片。这也有助于排除平板边缘附近存在反光的区域。设定阈值是获得最准确 CFU 计数的关键。如果阈值设得过高，菌落会合并；如果阈值设得过低，菌落则会被排除。设定阈值后，宏程序会应用高斯模糊以柔化边缘并减少混叠，使用分水岭滤波器分离重叠的菌落，最后通过分析颗粒来计数菌落斑点。
有时，某个特定区域的菌落数量过于密集。Count-On-It 提供了一种处理方法。为了估算网格单元中部分融合菌落的菌落数量，首先计算整个平板上圆形菌落的平均面积，记为 Cavg。然后将菌落 A1 的面积除以圆形菌落的平均面积，即 A1/Cavg。 将所得数值四舍五入至最接近的整数，即为该菌落团块中所含菌落数量的估计值。这一功能是阈值会影响计数结果的原因之一：阈值对融合菌落的划分方式不同，会导致单个菌落的平均面积与融合菌落面积之间的相对比例发生变化。
所介绍的方法存在若干局限性。其中包括需要使用能够从96孔板中精确分配液体培养基的设备。此类设备（如96通道移液器或槽式复制针具）的购置成本可达数千美元。虽有较便宜的替代方案，但其准确性较低。自动计数 通过 Count-On-It 也存在一些局限性。例如，若混合菌群中的两种菌落类型仅依据大小进行区分，则斑点计数法无法将菌落正确归类。在此情况下，含有斑点的菌落需从计数中剔除。基于菌落形态进行进一步区分将是该方法有价值的扩展方向，但目前尚未实现。使用选择性培养基，包括菌株特异性营养成分和抗生素，可简化对复杂图像分析的需求。
维持果蝇培养&#160;在96孔板中进行实验可增加单次实验中可检测的样本数量和条件数量，并有助于实现高通量筛选 果蝇-细菌互作表型。我们设想，通过使用选择性培养基，该方法可进一步扩展，以区分复杂混合物中的多种细菌菌株。该方法不仅限于果蝇微生物组的研究。菌落形成单位（CFU）的定量在微生物学的许多应用中十分常见，从饮用水中大肠菌群计数到病原体鉴定均有涉及。本文所介绍的CFU平板检测系统支持高通量筛选，以及结果的自动化采集、处理、存储和输出。

肠道微生物群与其动物宿主之间的关系正日益成为生物学研究的前沿领域1，研究表明微生物组的菌株组成对宿主生理功能具有重要意义2,3,4。由于个体间天然差异较大以及定植细菌多样性较高，这些混杂因素限制了相关发现的进展5,6,7。果蝇 Drosophila melanogaster 因其天然低多样性的微生物组、易于操作以及强大的宿主遗传学工具，已成为一个极具前景的研究模型8,9,10,11。果蝇可被培育为无菌状态，并可重新定植定义明确的微生物群12，已有研究证实这些菌群会影响果蝇的生理特征13,14。其天然菌群由一组有限的、均可培养的细菌组成，这些细菌的近缘种也常见于哺乳动物肠道中，包括乳杆菌属（Lactobacilli）、变形菌门（Proteobacteria）和肠球菌属（Enterococci）15。
研究微生物组对宿主性状的影响，需要对微生物组进行定量分析，包括确定存在的物种及其绝对丰度16。分析果蝇微生物组的主要方法包括菌落形成单位（CFU）计数17、16S rRNA基因扩增子测序9以及16S rRNA基因的定量PCR（qPCR）18。CFU计数无需昂贵试剂即可获得，且能确认细菌细胞的活性19。包括qPCR在内的16S技术具有优势，可在不依赖微生物生长条件或菌落形态的情况下确定其分类学身份20。
当实验使用已知细菌组成（无菌定义菌群果蝇）的果蝇时，菌落形成单位（CFU）计数相较于测序具有明显优势21。测序成本较高，需要进行DNA提取、基于PCR的文库构建以及高通量测序才能获得相对丰度数据22。由于成本高昂，高通量测序方法通常需批量处理样本以降低单个样本的成本23。此外，还需采用qPCR等其他方法来获取绝对丰度16。相比之下，CFU计数快速、经济，并能提供可存活细胞的绝对数量。Drosophila8 和其他小型微生物组模型24，包括线虫 Caenorhabditis elegans25,26 以及无菌培养的幼年斑马鱼 Danio rerio27&#160;，其体内细菌种类有限，且这些细菌的生长特性已被充分了解28。在此类情况下，尤其是对于无菌定义菌群动物，CFU计数能够区分多物种肠道群落中的所有细菌种类21,27,29。更高通量的CFU计数方法将进一步提升微生物组组成分析的成本效益和速度，并可应用于更多其他微生物学实验。
通过在基于琼脂的培养基上对细菌悬液进行连续稀释涂布来计数菌落形成单位（CFU），是微生物学领域普遍采用的标准方法。随后，研究人员通过人工方式对平板上生长的菌落进行计数。稀释的目的是使菌落密度处于可计数范围（例如每平板约100个CFU），从而避免菌落相互重叠，能够在合理时间内完成计数。目前大多数微生物学家所使用的CFU计数方法，其基本原理仍源自140年前罗伯特·Koch实验室所建立的技术，对于许多应用而言，该方法依然足够有效。然而，当需要对大量样本进行定量分析时，该方法便暴露出局限性。单个样本通常需要涂布1至10个连续稀释梯度，以获得可计数的CFU，因此当实验样本数量超过几十个时，工作量将显著增加。为提高CFU计数效率，已发展出多种改进方法。自动化螺旋涂布技术消除了对连续稀释的需求30，仅需使用一块平板即可进行CFU计数，但增加了样品点板所需时间。单板-系列稀释点样法（SP-SDS）可实现 &#65279;每样本使用较少平板的菌落形成单位估算31这些方法虽优于传统的涂布平板法，但仍需逐一处理和接种细菌样品，因此并不适合高通量操作。将样品在96孔板中进行处理，并将这96个样品点样接种到矩形琼脂平板上，可显著提高样品的处理通量。19.
微生物组通常由多种菌株和物种组成。尽管物种通常可以通过菌落形态或培养基来区分，但荧光技术可用于进一步区分不同类型的细菌及其生长特性32。例如，同一物种的不同基因型可通过不同的遗传编码荧光蛋白进行标记。结合荧光的平板成像方法使研究人员能够在基于菌落形成单位（CFU）的检测中利用这些遗传技术32。将荧光技术整合到高通量CFU计数方法中，将进一步提升其应用价值。
当样本数量较多时，手动计数菌落形成单位（CFU）会变得繁琐。可通过拍摄平板照片并使用专业软件处理图像来实现CFU的自动计数33。Sieuwerts 等人将点样接种法提高的接种效率与常规数码摄影及 ImageJ 软件相结合，实现了菌落的自动计数19。
一种高通量筛选特定微生物与宿主关联表型的方法，将有助于研究微生物组群落的组装过程及其对宿主健康与适应性的影响。针对黑腹果蝇（Drosophila）微生物组的研究，一个高通量微生物学平台应具备以下功能：以96孔板格式处理果蝇样本、在不破坏细菌的前提下裂解果蝇组织、高效进行点样涂布、能够使用荧光标记并区分多种荧光染料、提供受控的光照环境以实现菌落形成单位（CFU）平板的可重复成像，以及配备可靠的自动化菌落计数软件。本文介绍了一种专为无菌果蝇中CFU检测而优化的方法，具有操作简便、快速且自动化的特点。本方案概述了一种新颖的工作流程，整合了先前已发表方法中的各项优势，并针对黑腹果蝇（Drosophila）肠道微生物组的研究进行了优化。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;珠磨破碎与点种平板&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td>杰内西</td><td>32-121</td><td>可高压灭菌的</td></tr><tr><td>果蝇培养瓶塞</td><td>杰内西</td><td>59-201</td><td>可高压灭菌的</td></tr><tr><td>手持涂抹器</td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>热封机</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater 玻璃珠，0.5 mm</td><td>BioSpec&amp;nbsp;</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>MPS 1000 微型PCR板离心机</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 半自动移液器</td><td>Mettler Toledo</td><td>30296705</td><td>可选用成本较低的替代方案，包括 VP Scientific 公司的带槽 96 孔针工具</td></tr><tr><td>TempPlate 半裙边 96 孔 PCR 板，直边，本色</td><td>美国科学</td><td>1402-9220</td><td>必须使用聚丙烯材质以适用于热封仪</td></tr><tr><td>热封压合箔</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>托盘板，128 × 85 mm，聚苯乙烯，无菌</td><td>SPL Life Sciences</td><td>31001</td><td>用于制备矩形琼脂平板</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;光盒构建&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;frac14;&amp;rdquo;-20 × &amp;frac12;&amp;rdquo; 螺栓（X2）</td><td>亚马逊</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>安装相机支架，品牌不限，任何1/4&quot;-20 1/2&quot; 螺栓起作用了。</td></tr><tr><td>&amp;frac14;&amp;rdquo;-20 × &amp;frac12;&amp;rdquo; 连接器螺母&amp;nbsp;</td><td>亚马逊</td><td>UPC：799862376780</td><td>又称帽形螺母或连接螺栓。用于将橡皮筋固定在板架上。品牌不限。</td></tr><tr><td>&amp;frac14;&amp;rdquo;-20 × &amp;frac34;&amp;rdquo; 螺栓（X3）</td><td>亚马逊</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>对于培养皿架，品牌不重要。</td></tr><tr><td>1/8&amp;rdquo; x &amp;frac12;&amp;rdquo; 洗板机</td><td>亚马逊</td><td>UPC: 611982484599</td><td>用于固定盒体外部盖螺母的垫圈。品牌不限。安装前喷涂黑色油漆，以与亚克力材料协调一致。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;18号导线&lt;/strong&gt; 双导体电源线 &lt;强&gt;18号规格电源线 &amp;ndash; 10英尺&lt;/strong&gt;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG 红色接线帽 - WN-R2210 &amp;ndash; &lt;强&gt;数量 4&lt;/strong&gt;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16英寸公制雌型快速连接端子 - 22-18 AWG &amp;ndash; &lt;强&gt;数量 3&lt;/strong&gt;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>4&quot; 免焊接夹式跳线连接器 - 8毫米单色LED灯带 &lt;强&gt;数量 3&lt;/strong&gt;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>4&quot; 免焊接夹式尾线适配器 - 8毫米单色LED灯带 &amp;ndash; &lt;强&gt;数量 3&lt;/strong&gt;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6&amp;rdquo; 抽屉把手</td><td>亚马逊</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>任何抽屉把手均可使用。</td></tr><tr><td>6&amp;rdquo; 抽屉滑轨</td><td>Btibpse</td><td>UPC：712243424979</td><td>修剪抽屉滑轨上的软闭合橡胶塞。</td></tr><tr><td>8-32 × &amp;frac12;&amp;rdquo; 顶盖螺母（x4）</td><td>亚马逊</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>在盒子外侧安装抽屉滑轨螺栓。品牌不限。使用尼龙材质以避免划伤亚克力。安装前喷涂黑色漆，使其与亚克力颜色协调。</td></tr><tr><td>8-32 × &amp;frac12;&amp;rdquo; 尼龙螺栓（x4）</td><td>亚马逊</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>用于安装抽屉滑轨。品牌不限，任何符合规格的螺栓或机螺钉均可使用。尼龙材质不会损伤亚克力板，并可将螺栓切割至与螺母齐平。安装前喷涂黑色油漆，以与亚克力板颜色协调。</td></tr><tr><td>丙烯酸胶水</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean: 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On #4 粘合剂（品脱装）及带针头的 Weld-On 涂布瓶</td></tr><tr><td>黑色扎带 - 10 个装 - 4 英寸长&amp;nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>相机L型支架</td><td>WLPREOE，Vikerer，无品牌</td><td>ASIN: B09X46YKQZ</td><td>支架应 &quot;反转的&quot; 从其预定构型偏移，使相机位于 &quot;外部&quot; L 的。有些托槽分为两个部件并允许这种交替配置，而有些则不允许，因此您需要选择可以翻转的托槽。此外，还应具备 1/4&quot; 用于固定的孔。WLPREOE、Vikerer、无品牌。亚马逊序列识别号仅作示例。</td></tr><tr><td>佳能 T 系列相机，用于有线连接选项 OR</td><td>佳能、松下、索尼、尼康等</td><td>1894C002</td><td>佳能Ti系列相机是一个不错的选择，可连接电脑使用。建议搭配18-55mm标准套机镜头。推荐选择佳能T5至T7（当前型号）的二手相机。</td></tr><tr><td>定制长度单色LED灯带 - Eco系列灯带 - 24V - IP20 - 250 流明/英尺 - 蓝色 - 2米</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>定制长度单色LED灯带 - Eco系列灯带 - 24V - IP20 - 250 流明/英尺 - 绿色 &amp;ndash; 2米</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>定制长度单色LED灯带 - Eco系列灯带 - 24V - IP20 - 250 流明/英尺 - 自然白光 4000K &amp;ndash; 2米&amp;nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>钻具 &amp;frac14;&amp;rdquo;, 1/8&amp;rdquo; 钻头</td><td>黑色 &amp;amp; Decker</td><td>&amp;lrm;BDCDD12PK</td><td>品牌不重要。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>哑光黑色喷漆，&amp;nbsp; 2X 超哑光</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>将所有内部表面涂成哑光黑色。品牌不限。</td></tr><tr><td>激光切割亚克力墙</td><td>Big Blue Saw</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>使用附带的 PDF 文件，删除顶板上除相机所需孔洞外的所有镂空部分&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mean Well LED开关电源 - LPV系列 20-100W单路输出LED电源 - 24V直流 - 20瓦&amp;nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100，用于连接手机、平板电脑或计算机的 Wi-Fi 功能</td><td>佳能、松下、索尼、尼康等</td><td>DMC-ZS100K</td><td>松下相机可通过无线方式连接至计算机，以实现数据传输和远程快门控制。二手设备亦可良好使用。</td></tr><tr><td>快速释放板</td><td>Neewer 铝合金 50 毫米快速释放板 QR 夹具，带 3/8 英寸和 1/4 英寸螺纹</td><td>ASIN: B07417F21D</td><td>将此添加到支架上，以便于拆卸相机以更换彩色滤光片。亚马逊序列识别号仅作示例。</td></tr><tr><td>橡皮筋，各种尺寸</td><td>BAZIC 产品</td><td>Alliance Rubber 26649</td><td>橡皮筋套在培养皿架上。品牌不限。</td></tr><tr><td>螺钉/粘合式扎带安装底座 - 3/4 英寸底座 &amp;ndash; &lt;强&gt;数量 4&lt;/strong&gt;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST 圆形摇杆开关 - 无LED &amp;ndash; &lt;强&gt;数量 3&lt;/strong&gt;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 滤光片（红色）72 毫米&amp;nbsp;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 58 滤光片（绿色）72 毫米</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>N/A</td><td>免费。引用即可：Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &amp;hellip; 卡多纳，A.（2012）。Fiji：一个用于生物图像分析的开源平台。《自然方法》，9(7)，676&amp;ndash;682. doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>苹果</td><td>N/A</td><td>在 Finder 中具有实用的批量重命名功能，可对一组照片进行重命名，以便在 Count-on-it 中进行组织和分析。</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>64 位</td></tr><tr><td>Windows</td><td>微软</td><td>N/A</td><td>64 位</td></tr></tbody></table>

96孔板格式下的快速菌落形成单位计数应用于 黑腹果蝇 微生物组

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

动物的肠道被共生微生物定植，这些微生物影响宿主的发育、健康和行为。精确量化定植情况对于研究宿主与微生物之间的复杂相互作用至关重要，既可用于验证微生物组成，也可用于研究其效应。Drosophila melanogaster&#160;因其原生微生物多样性较低，且易于以明确的微生物组分进行培养，已成为研究肠道微生物组的模式生物。分析单个生物体的微生物组需要鉴定存在的微生物种类，并量化其绝对丰度。本文介绍了一种用于分析大量个体果蝇微生物组的方法。果蝇在96孔板中进行处理，可实现对大量样本的同步操作。通过将多达96个完整果蝇匀浆液以点样方式接种于单个琼脂平板的不同位点，随后计数各点生长的菌落形成单位（CFUs），从而量化微生物丰度。该接种系统结合了一个自动化的CFU定量平台，该平台包括平板摄影、荧光菌落的区分，以及利用ImageJ插件对菌落进行自动计数。该方法的优势在于：（i）灵敏度足够高，可检测不同处理之间的差异；（ii）点样接种法的准确性与传统平板接种法相当；（iii）自动计数过程比人工计数更准确且更快速。本文所述的工作流程可实现对大量重复样本中CFUs的高通量定量，且可应用于其他微生物学研究系统，包括体外（in vitro）实验及其他小型动物模型。

本方法采用96孔板形式对菌落形成单位（CFUs）进行接种，通过定量微生物丰度应用于整个果蝇匀浆样品中的Drosophila 微生物组。CFUs的计数使用此处提供的自动化图像分析软件完成。

动物肠道内定植有共生微生物，这些微生物影响宿主的发育、健康和行为。定植水平的精确定量……

计数菌落形成单位（CFUs）是微生物学中的一种标准技术，但该方法耗时较长，且需要大量琼脂平板。我们的技术在时间和琼脂平板使用量方面，比传统的CFU计数方法具有百倍的优势。我们已将该方法应用于小型动物模型（尤其是果蝇）肠道微生物组的测定。本方案是一种简单、快速且自动化的无菌果蝇中菌落形成单位（CFU）定量方法。该方案提供了一套工作流程，使用自行组装的仪器拍摄CFU图像，并通过定制软件实现自动计数。该方案可应用于任何需要更高效平板培养和CFU计数方法的微生物学实验中。高效地处理果蝇并准确识别培养皿需要熟练的手工技巧，因此应进行练习。使用自动计数软件时需对阈值进行判断，因此应将软件计数结果与人工计数结果进行比较，以确定适用于您实验的最佳参数。本实验操作将由我实验室的研究人员 Ren Dodge 演示，该技术由其开发。首先，将0.5微米的玻璃珠倒入珠子测量托盘中。将珠子均匀铺在托盘上，使所有孔均被填满并保持水平。然后，将多余的珠子刷入锥形管中。接着，将半裙边PCR板倒置放在测量托盘上，并将其嵌入测量托盘的凹槽中，与各孔对齐。然后迅速翻转以转移磁珠。去除PCR板表面多余的磁珠。确保所有孔中均含有磁珠。如有需要，可使用药勺将珠子加入单个孔中。然后用铝箔覆盖板子并进行高压灭菌。在使用板子前，需在加入果蝇前立即使用96通道移液器向每个孔中加入100 µL PBS。为对麻醉后的果蝇进行表面灭菌，使用小漏斗将果蝇从试管转移至1.5毫升微量离心管中。立即向管中加入1毫升70%乙醇，盖紧管盖，颠倒混匀10秒。随后用P-1000移液器吸除乙醇，注意避免吸走任何果蝇。最后一次 PBS 洗涤后，盖上管盖，将管子开口朝下在实验台上用力敲击数次，使果蝇进入管盖内。打开管子后，用镊子将果蝇分装至各孔中，每孔放置一只果蝇。加样过程中将培养板置于冰上，以保持果蝇处于麻醉状态。移除靠近孔附近的散落珠子，因为这些珠子可能会刺破封板膜导致泄漏。确保封板膜的哑光面朝下贴合在板上，而光亮面朝上朝向热封仪。用力按压热封仪5秒钟，并用手动压辊压平以固定封板膜。将果蝇匀浆5分钟，确保果蝇完全匀浆，溶液变为有色。为去除密封箔上的液体，将珠板在微型板旋转器中以350 ×g离心30秒。取下箔膜时应握住板子，避免果蝇匀浆液滴飞溅。在生物安全柜中放置三个矩形MRS琼脂培养板，打开盖子至少干燥10分钟。使用96通道移液器，向无菌96孔板的每个孔中加入100 µL PBS，制备两个稀释板。将一排P-20吸头架装入96通道移液器中。从样品板中吸取 11.1 微升匀浆液，加入到每孔含有 100 微升无菌 PBS 的第一稀释板中，制成 1:10 的稀释液。将稀释板置于板式振荡器上，以 600 转/分钟振荡 10 秒。用移液器上下吹打至少10次，再次混匀。从第一块稀释板中转移11.1 µL至第二块稀释板，并对后续所有稀释步骤重复上述混匀操作。对于点样板，从每个孔中吸取2 µL加入96通道移液器中。将移液器枪头缓慢放入培养板中，避免刺入琼脂，确保所有点样均已分配完毕。然后检查液体斑点是否迅速渗入琼脂，且未发生扩散融合。按照文中的描述，对剩余的稀释培养板重复上述涂布操作。待液体完全被琼脂吸收后，将平板倒置并培养至菌落达到最佳大小。拍照时需对平板进行合理排列，并保持特定顺序。所有平板均应调整方向，使 A1 位于左上角。移去培养皿盖后，将培养皿放置在载物台上，确保A1孔位于正确的角落。对培养皿进行成像。将图像转移至计算机，并重命名文件，文件名应包含实验名称、培养基类型、稀释倍数及其他相关细节。将待进行定量分析的图像整理到一个文件夹中。用于区分不同培养板的文件名将成为输出电子表格中每组计数的列标题。在该文件夹中创建名为 Cropped 和 Receipts 的子文件夹。这些文件夹将用于存放输出文件。现在从 ImageJ 中启动 Croptacular 插件，然后单击“确定”以开始裁剪。此时将弹出一个对话框，用于选择源文件夹。单击“确定”。选择源文件夹，然后单击“打开”。接着，在选择目标目录的对话框中单击“确定”。选择目标文件夹，然后按“打开”。如果图像已平直，直接按空格键即可。否则，请沿应变为水平的一条边缘画一条线以校正图像。若图像看起来仍不平直，可重复绘制该线直至图像校正。接下来，为计数区域绘制一个边界框，并调整其大小和比例，直到所有斑点均位于各自的细胞内。将光标拖动到边界框外以刷新网格。当网格显示合适后，按下空格键。由于插件假定所有照片的对齐方式完全相同，请确保下一张图像自动旋转至与第一张相同的角度。如果角度正确，请按空格键继续；否则，请像之前一样校正图像。网格还会显示上一张图像中的相同位置。如有必要，进行调整，然后按空格键。启动 Count-On-It 并选择 Gridiron。根据像素强度的上限值和下限值设定菌落强度的阈值。在确保选中所有菌落的前提下，尽可能严格地设定阈值。当阈值设置满意后，点击“操作提示”对话框中的“确定”，然后点击“确定”继续。在第一张图像中，可选择继续操作或返回设置菜单。要继续批量处理，请点击“确定”。然后，选择一个文件夹以保存收据和结果表格。使用之前创建的“收据”文件夹。第一张图像之后，后续图像将默认采用与之前设置相同的阈值。单击“确定”以使用这些设置，或根据需要调整设置。仔细检查软件生成的计数结果，并手动修正任何计数错误。ImageJ 插件具有统计学准确性，但偶尔也会出现错误。需核对结果图像以检查异常值并识别计数错误。该软件会将菌落形成单位（CFU）数据保存为与结果图像相同文件夹中的 CSV 文件。对于定植了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）的果蝇，与接种后从未转移至无菌食物的果蝇相比，每日转移至无菌食物、每日转移、分析前4小时保持在无菌食物上，或每日转移并在分析前4小时保持在无菌琼脂上的果蝇，其细菌数量均显著减少。在饲喂印度乙酸杆菌（Acetobacter indonesiensis）的果蝇中也观察到类似结果，转移、转移后及清除处理的果蝇均表现出CFU的显著降低，但清洗处理未产生可测量的影响，表明CFU的减少是由于肠道内细菌被清除，而非体表细菌的去除。每点含有2至25个菌落的菌落形成单位（CFU）计数结果与传统方法相比无显著差异。平均含有35个菌落的菌斑区域的菌落形成单位（CFUs）低于对照组涂布平板。这种减少可能是由于密集菌斑中菌落相互重叠所致。在平板照片中，菌落的强度比背景高300%。植物乳杆菌 mCherry 阳性菌落的红色荧光强度比 mCherry 阴性菌落高 1,000%。印度乙酸杆菌 GFP 阳性菌落的绿色荧光强度比 GFP 阴性菌落高 200%。ImageJ 的 Count-On-It 插件可自动从平板照片中进行菌落形成单位（CFU）计数。菌落可被准确检测，计数结果与人工计数相当。可通过计数报告识别计数错误。调整大小阈值和荧光波长可分别对不同形态的菌落进行计数。在进行珠磨之前，必须确保板子密封良好。设计阳性对照以校准测量结果也非常重要。我们还使用该技术在96孔板中研究体外细菌群体，这使我们能够研究混合的细菌群落。该技术可实现高通量筛选，用于检测肠道定植情况以及定植过程中的生物学差异。

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