Name: 鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗体外和体内的制备、特性、毒性及疗效评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学习制备鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗的方法，用于评估其体外特性、体内毒性及抗肿瘤疗效。该方案为T细胞肽黏膜疫苗的开发提供技术与理论参考。

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本研究得到中国国家自然科学基金项目（编号：31670938、32070924、32000651）、重庆市自然科学基金项目（编号：2014jcyjA0107、2019jcyjA-msxmx0159）、陆军军医大学专项项目（编号：2020XBK24、2020XBK26）以及国家级大学生创新创业训练计划项目（编号：202090031021、202090031035）的资助。

动物实验按照《实验动物 动物福利伦理审查指南》（GB/T 35892-2018）进行，并经第三军医大学实验动物福利与伦理委员会批准。&#160;小鼠通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（100 mg/kg）实施安乐死。
1. I-OVA 纳米乳剂的制备
<ol>
	<li>将1 mg单磷酰脂质A（MPLA）与100 µL DMSO混合，涡旋5分钟，并在室温（RT）下静置4小时，使其完全溶解。</li>
	<li>定量加入Tween 80和I-OVA并混合。 
	注意：Tween 80与I-OVA按25:1的质量比混合19。</li>
	<li>将角鲨烯加入第1.2步制备的混合物中（Smix:角鲨烯 = 7:3）。</li>
	<li>将100 µL MPLA溶液（10 mg/mL）加入第1.3步制备的混合物中。</li>
	<li>采用低能乳化法配制纳米乳剂疫苗19：将混合溶液逐滴加入约等于总体积70%的水中，轻轻搅拌，得到透明且易于流动的混合物。 
	注意：空白乳剂（BNE）对照组采用相同方法制备，仅以水替代I-OVA。</li>
</ol>
2. 理化性质表征与稳定性
注意：在完成步骤 2.1-2.3 后，评估 I-OVA NE 疫苗的液滴粒径分布、ζ 电位及其他理化数据；在完成步骤 2.4-2.7 后，对 I-OVA NE 疫苗进行形态学表征；并在完成步骤 2.8-2.9 后，检查 I-OVA NE 疫苗的三维结构。
<ol>
	<li>将 50 mg 黏蛋白与 100 mL 注射用水混合，制备 0.05% 的黏蛋白溶液。</li>
	<li>用 0.05 mg/mL 黏蛋白溶液或去离子水将 4 mg/mL I-OVA NE 稀释 200 倍。</li>
	<li>使用纳米粒径分析仪在 25 °C 下观察颗粒大小、Zeta 电位、多分散系数（PDI）和电泳迁移率19。</li>
	<li>将 10 µL I-OVA NE 用 2 mL 去离子水稀释 200 倍。</li>
	<li>取 5 µL 预先稀释的 I-OVA NE 疫苗（步骤 2.4），滴加至碳支持的铜网上，再覆盖 10 µL 1% 磷钨酸，作用 3 分钟。</li>
	<li>用滤纸吸去多余的磷钨酸。</li>
	<li>使用透射电子显微镜（TEM）获取图像。将稀释 50 倍的 10 µL 样品滴加至 100 目碳支持铜网上，室温（RT）静置 5 分钟后，加入 10 µL 磷钨酸（1%，pH 7.4）。在 120 kV 电压下对所有样品进行 TEM 检测。</li>
	<li>采用高分辨率原子力显微镜表征 I-OVA NE 的分子形态。在以下条件下获取 I-OVA NE 的彩色图像：钨探针（力常数：0.06 N·m-1）；扫描范围：450 nm × 450 nm；轻敲模式：成像模式；扫描方式：室温下逐点扫描。</li>
</ol>
3. 体外 和 体内 毒性检测
注意： 体外 I-OVA 纳米疫苗的毒性评估按照步骤 3.1–3.9 进行，且 体内 I-OVA 纳米乳剂疫苗的毒性评估按照步骤 3.10–3.13 进行。
<ol>
	<li>按照步骤 3.1.1–3.1.4 复苏人 BEAS-2B 上皮细胞，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下，将细胞培养于完全生长培养基中2 培养箱 
	注意：配制完全培养基时，将胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素分别加入 RPMI-1640 培养基中，终浓度分别为 10% 和 1%。
	<ol>
		<li>打开水浴锅，将温度调节至37 °C。取出保存在液氮中的细胞冻存管，在37 °C水浴中快速解冻。</li>
		<li>解冻后，迅速将细胞用移液器转移至15 mL无菌离心管中，加入2 mL完全培养基，于129 x g 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，加入2 mL完全培养基重悬细胞，于129 × g离心5 min。</li>
		<li>吸除上清液，加入6 mL完全培养基重悬细胞，将细胞转移至T25培养瓶中，在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞。2 培养箱</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当细胞密度达到80%–90%时，弃去培养基，用2 mL PBS洗涤细胞两次。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞1–2分钟。观察到细胞变圆时，立即加入4 mL完全培养基以中和胰蛋白酶。</li>
	<li>混合样本后吸取至15 mL无菌离心管中，以129 × g 5 分钟。</li>
	<li>移除上清液，将细胞重悬于 1 mL RPMI-1640 完全培养基中。取 20 µL 进行细胞计数，并将细胞稀释至 1 × 105 cells/mL</li>
	<li>以 1 × 10 的密度接种 BEAS-2B 细胞4 细胞/孔，置于96孔板中，每孔加入100 µL RPMI-1640完全培养基，于37 °C、5% CO₂条件下预培养24 h2 培养箱</li>
	<li>弃去上清液，分别加入100 µL I-OVA NE、100 µL I-OVA+BNE（物理混合）以及用完全培养基预稀释至不同终浓度（0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL、8 mg/mL）的I-OVA各100 µL，以BNE作为对照。于37 °C孵育24小时。 
	注意：向阴性对照组加入 100 µL 完全培养基，向细胞悬液组加入 100 µL 细胞悬液（1 x 105/mL）加入阳性对照组。</li>
	<li>吸除培养基，向每孔中加入90 µL完全培养基和10 µL CCK-8溶液。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育平板2小时2 培养箱</li>
	<li>使用酶标仪在450 nm处测定每孔的吸光度。</li>
	<li>按照以下公式计算 BEAS-2B 细胞的存活率： 
	(OD450 样本− OD450 阴性对照/OD450 阳性对照− OD450 阴性对照) × 100%</li>
	<li>将6周龄的C57BL/6小鼠随机分为五组（每组n = 5），使用4%异氟烷进行麻醉诱导，以2%异氟烷维持麻醉。在小鼠眼部涂抹新霉素硫酸盐软膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>使用10 µL移液器吸头，以每只小鼠每侧鼻孔10 µL的剂量，分别给予浓度均为4 mg/mL的I-OVA、I-OVA+BNE和IOVA NE进行鼻腔免疫&#160;3天。使用BNE和PBS作为实验对照。 
	注意：在动物从麻醉中恢复期间，需提供保温支持。</li>
	<li>第4天，通过腹腔注射100 mg/kg的1%戊巴比妥钠处死所有小鼠。</li>
	<li>用剪刀切取约3 mm厚的鼻组织样本，并取出肺组织。</li>
	<li>将鼻部组织和整个肺组织置于4%多聚甲醛中固定24 h。通过梯度酒精和二甲苯进行组织脱水，随后包埋于石蜡中。使用石蜡切片机将制备好的石蜡块切成4 µm厚度的切片。</li>
	<li>用苏木精和伊红（H&E）对切片进行染色&amp;#38;E）。然后在显微镜下（100倍和200倍）观察鼻黏膜和肺组织中的黏膜毒性，包括充血、水肿、中性粒细胞浸润和结构损伤。7.</li>
</ol>
4. 体外 细胞摄取
<ol>
	<li>将BEAS-2B细胞以每孔5 × 105个细胞的密度接种于含盖玻片的12孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，并在37 °C、5% CO2培养箱中预培养过夜。</li>
	<li>向900 µL细胞悬液中加入100 µL FITC标记的I-OVA NE（纯度：98.3%，由公司生产，4 mg/mL）或I-OVA（4 mg/mL），于37 °C孵育90分钟。 
	注意：FITC标记的I-OVA NE的制备方法见步骤4.1。对照组加入1 mL完全培养基。</li>
	<li>处理后，用0.1 M PBS（每孔1 mL）在37 °C洗涤3次，每次30分钟。</li>
	<li>用4%多聚甲醛在避光条件下固定样本20分钟。固定后，去除多聚甲醛，并用0.1 M PBS（每孔1 mL）在37 °C洗涤3次，每次30分钟。</li>
	<li>用DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）在避光条件下预孵育样本，终浓度为10 µg/mL，孵育10分钟；处理后用0.1 M PBS（每孔1 mL）在37 °C洗涤5次，每次30分钟。</li>
	<li>使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察细胞摄取情况，参数设置如下：帧尺寸：512 px × 512 px，扫描速度：8，线步进：1，平均次数：2。</li>
</ol>
5. 在体内的 释放
<ol>
	<li>使用4%异氟烷气体麻醉裸鼠，并以2%异氟烷维持麻醉状态。通过鼻内免疫方式，每侧鼻孔给予10 µL浓度为4 mg/mL的PE标记I-OVA或PE标记I-OVA NE。</li>
	<li>在0 h、0.5 h、1.5 h、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h时间点，对所有小鼠在麻醉状态下使用IVIS系统进行成像采集。</li>
	<li>在鼻内给药前立即进行背景扫描，以获得阈值（Min = 1.06 × 106），用于校正所有时间点采集的图像。</li>
	<li>点击Living Image软件启动序列，并点击Initialize以初始化IVIS系统。</li>
	<li>系统初始化后，IVIS采集控制面板上的温度状态指示灯为红色；当温度状态指示灯变为绿色时，即可开始成像。</li>
	<li>点击Imaging Wizard，然后在弹出的对话框中选择Fluorescence（荧光）模式。</li>
	<li>调整以下参数：Exposure Time（曝光时间）：auto sec，Binning（ binning值）：8，F/Stop（光圈）：2，Field of View（视野）：D。</li>
	<li>选择620 nm激发滤光片和670 nm发射滤光片。点击Acquire Sequence以采集图像。</li>
	<li>使用Living Image软件对所有小鼠的活体图像及辐射数据进行处理。
	<ol>
		<li>图像采集完成后，点击工具面板中的ROI Tools，选择圆形工具并绘制感兴趣区域（ROI）圆圈。</li>
		<li>点击Measure ROIs，获取该ROI区域的定量数值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 在体 抗肿瘤功效
<ol>
	<li>按照步骤 2.1.1–2.1.4，使用完全培养基复苏并培养源自 EL4 的小鼠淋巴瘤 E.G7-OVA 细胞。 
	注意：配制 E.G7-OVA 细胞完全培养基时，将 RPMI 1640 培养基与 2 mM L-谷氨酰胺混合，并调整至含有 1.5 g/L 碳酸氢钠、4.5 g/L 葡萄糖、10 mM HEPES 和 1.0 mM 丙酮酸钠，再补充 0.05 mM 2-巯基乙醇、0.4 mg/mL G418（终浓度 90%）和 10% 胎牛血清。</li>
	<li>当细胞密度达到 1 × 106 个细胞/mL 至 1 × 107 个细胞/mL 时，按 1:2 的比例进行传代培养。</li>
	<li>按照步骤 6.3.1–6.3.4 所述，评估疫苗对小鼠的预防保护效果。
	<ol>
		<li>将 6 周龄 C57BL/6 小鼠随机分为五组（每组 n = 8）。使用 4% 异氟烷气体麻醉裸鼠，并以 2% 异氟烷维持麻醉状态。部分剃除小鼠背部毛发，并在眼部涂抹新霉素硫酸盐软膏以防止干燥。</li>
		<li>通过鼻内途径，每侧鼻孔给予 10 µL 的 1 mg/mL I-OVA、BNE+I-OVA 或 I-OVA NE，或经 PBS 稀释 4 倍的 BNE，或 PBS 对照，每 7 天免疫一次，共免疫 3 次。</li>
		<li>在末次免疫后的第 7 天，所有小鼠于右背部皮下接种 5 × 105 个 E.G7-OVA 细胞。</li>
		<li>在末次免疫后的第 0、6、9、12、15 和 18 天，使用数显卡尺测量肿瘤两个轴向尺寸以监测肿瘤体积，并记录末次免疫后 30 天的小鼠存活情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在接种 E.G7-OVA 细胞后，按照步骤 6.4.1–6.4.3 所述评估疫苗对小鼠的治疗性保护效果。分组及小鼠处理方式参见步骤 6.3.1。
	<ol>
		<li>在第 0 天，将 E.G7-OVA 细胞（5 × 105 个/只）皮下注射至 C57BL/6 小鼠右背部。</li>
		<li>在注射后的第 0、7 和 14 天，通过鼻内途径，每侧鼻孔给予所有小鼠 10 µL 的 I-OVA、BNE+I-OVA、I-OVA NE（浓度均为 1 mg/mL）、BNE 或 PBS，每侧鼻孔共免疫 3 次。</li>
		<li>在注射后的第 0、6、9、12、15 和 18 天，监测肿瘤体积并记录注射后 30 天的小鼠存活率。 
		注意：若肿瘤体积超过 3,000 mm3，&#160;出于人道考虑应实施安乐死，该小鼠在生存曲线中视为死亡。肿瘤体积按以下公式所示的修正椭球体公式计算： 
		体积 = π/6 × L × W2 
		其中 L 表示肿瘤长度，W 表示肿瘤宽度（长度单位：mm，体积单位：mm3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 统计学分析
<ol>
	<li>使用单因素方差分析（one-way ANOVA）、Tukey 多重比较检验或 Student t 检验，结合适当的统计软件分析不同组间数据的差异。采用 Kaplan-Meier 法估计生存结果，并用 log-rank 检验进行组间比较。所有结果均以均值 ± 标准差（SD）表示。P 值的显著性水平 P &#60; 0.05、P &#60; 0.01 和 P &#60; 0.001 在图中分别用 *、** 和 *** 表示。</li>
</ol>

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作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

用免疫细胞膜功能化的纳米疫苗在疾病靶向治疗中具有显著优势，其独特的肿瘤趋向性、特异性靶点识别、长循环时间、增强的细胞间相互作用以及低系统毒性等特性可将副作用降至最低。这些纳米疫苗还可轻松整合其他治疗模块，实现对癌症的协同治疗16,20。通过调控纳米疫苗的尺寸、形状和电荷等理化性质，可获得理想的生物学特性。因此，纳米疫苗已在多种应用中发挥重要作用21。这些理化特性是决定纳米疫苗摄取效率与毒性的关键因素，只有通过合理设计和调控才能使其呈现无毒特性22。因此，对包括形状、尺寸和电荷在内的理化特性的研究方案至关重要。透射电子显微镜（TEM）是一种高精度仪器，已在科学界广泛应用多年23，已成为理解纳米结构材料特性并调控其行为的重要工具。此外，原子力显微镜（AFM）已成为生物样品纳米力学表征的一种强大技术24，可在原子水平上分析表面细节，同时提...

作为最重要的公共卫生创新之一，疫苗在应对全球人类疾病负担方面发挥着关键作用1。例如，目前已有超过120种针对新冠肺炎的候选疫苗正在接受测试，其中一些已在多个国家获批使用2。近期研究表明，癌症疫苗通过引导癌症患者的免疫系统将肿瘤抗原识别为外来物质，显著推动了临床癌症治疗的进展3。此外，位于肿瘤细胞内或细胞外的多种T细胞表位可用于设计多肽疫苗，由于其避免了放疗和化疗所伴随的显著毒性，因此在转移性癌症治疗中展现出优势4,5。自20世纪90年代中期以来，肿瘤治疗的临床前和临床试验主要采用抗原多肽疫苗，但极少有疫苗在癌症患者中表现出足够的治疗效果6。此外，含多肽表位的癌症疫苗免疫原性较弱且递送效率不足，这可能是由于细胞外多肽在注射部位迅速扩散并快速降解，导致免疫细胞对抗原的摄取不足所致7。因此，有必要通过疫苗递送技术来克服这些障碍。
OVA257-264 是一种以融合蛋白形式表达的 MHC I 类分子结合表位（257-264），是常用的模型表位8。此外，OVA257-264 在抗肿瘤适应性免疫应答中至关重要，该应答依赖于细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。此反应由肿瘤内抗原特异性的 CD8+ T 细胞介导，这些T细胞由 OVA257-264 肽段诱导产生。该过程的特点是颗粒酶B分泌不足，而颗粒酶B由细胞毒性T细胞释放，可导致靶细胞发生凋亡8。然而，游离的 OVA257-264 肽段给药可能仅能诱导微弱的CTL活性，因为这些抗原主要被非特异性细胞摄取，而非抗原呈递细胞（APCs）。由于缺乏适当的免疫刺激，导致CTL活性低下5。因此，有效CTL活性的诱导仍需显著改进。
由于上皮细胞形成的屏障以及黏液的持续分泌，疫苗抗原会迅速从鼻黏膜中被清除9,10。开发一种能够穿透黏膜组织的高效疫苗载体至关重要，因为抗原呈递细胞位于黏膜上皮下方9。理论上，疫苗的鼻内注射可诱导黏膜免疫以抵抗黏膜感染11。此外，由于鼻腔给药具有使用方便、避免肠道给药以及提高患者依从性等优点，是一种有效且安全的疫苗给药方式7。因此，鼻腔给药是新型肽表位纳米疫苗的一种良好给药途径。
已设计出多种合成生物材料，用于整合细胞-组织和细胞-细胞相互作用的表位。某些生物活性蛋白，如异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV），已被引入水凝胶结构中以赋予其生物活性12。该肽段可能促进细胞黏附、迁移和外向生长13，并通过结合整合素 α3β1 和 α6β1 与不同类型的癌细胞相互作用。IKVAV 是一种来源于层粘连蛋白基底膜蛋白 α1 链的细胞黏附肽，最初用于模拟神经微环境并诱导神经元分化14。因此，为这种新型疫苗寻找高效的递送载体对于疾病控制至关重要。
近期报道的乳剂系统，如 W805EC 和 MF59，已被用于鼻腔递送灭活流感疫苗或重组乙型肝炎表面抗原，并被证明可同时激发黏膜免疫和系统性免疫15。与颗粒型黏膜递送系统相比，纳米乳剂（NEs）具有给药方便且易于与有效佐剂共形成的优点16。已有研究报道，纳米乳剂疫苗能够以一种不同于传统脱敏方式的持续性机制改变过敏表型，从而产生长期抑制效应17。其他研究还表明，含有结核分枝杆菌（Mtb）特异性免疫优势抗原的纳米乳剂可诱导强烈的黏膜细胞免疫反应并提供显著保护作用18。因此，本研究设计了一种新型的鼻内自组装纳米疫苗，其包含合成肽 IKVAV-OVA257-264（I-OVA，即由 IKVAV 与 OVA257-264 连接而成的肽段）。对该新型纳米疫苗进行系统性评估具有重要意义。
本方案旨在系统评估纳米疫苗的理化特性、毒性和稳定性，利用技术手段检测抗原摄取以及保护性和治疗性效应是否增强，并阐述主要实验内容。本研究建立了一系列方案，用于研究该纳米疫苗的理化特性与稳定性，通过CCK-8法测定I-OVA NE对BEAS-2B细胞的毒性程度，利用共聚焦显微镜观察BEAS-2B细胞对疫苗的抗原呈递能力，并评估该新型纳米疫苗的释放特性 体内 和 体外并利用E.G7-OVA荷瘤小鼠模型检测该疫苗的保护性和治疗性效果。

<table><tbody><tr><td>96孔板</td><td>Corning Incorporated, USA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad 6.0 微孔板读数仪</td><td>Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA</td><td>&amp;nbsp;Bio-Rad 6.0</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 试剂盒</td><td>Dojindo, Japan</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R 离心机</td><td>Eppendorf, Germany&amp;nbsp;</td><td>5811000398</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>FITC标记的I-OVA</td><td>上海博泰&lt;br/&gt; 生物科技有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HF 90/240 培养箱</td><td>Heal Force, 瑞士</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HPLC&amp;nbsp;</td><td>上海博泰生物科技有限公司</td><td>E2695</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Nikon, 日本</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>IPC-208</td><td>重庆大学，中国</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 成像系统&amp;nbsp;</td><td>Caliper Life Science Limited Company</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>JEM-1230 透射电子显微镜</td><td>日本电子株式会社</td><td>1230 TEM</td><td></td></tr><tr><td>Malvern NANO ZS 粒径分析仪</td><td>Malvern Instruments Ltd., 英国</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>MPLA</td><td>&amp;nbsp;Invivogen&lt;br/&gt; Lit. Co.</td><td>tlrl-mpla</td><td></td></tr><tr><td>硫酸新霉素软膏</td><td>上海医药集团信谊药业有限公司</td><td>H31022262</td><td></td></tr><tr><td>OVA257&amp;ndash;264</td><td>上海博泰&lt;br/&gt; 生物科技有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Hyclone (Life Technology, USA)</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>IKVAV-PA 与合成肽（I-OVA）的偶联物</td><td>上海博泰&lt;br/&gt; 生物科技有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 LSM800 激光扫描共聚焦荧光显微镜</td><td>Zeiss, 德国</td><td>Zeiss LSM800</td><td></td></tr></tbody></table>

鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

表位肽因其安全性高、特异性强和制备方便，在肿瘤疫苗领域受到广泛关注；特别是某些MHC I类限制性表位能够诱导有效的细胞毒性T淋巴细胞活性，从而清除肿瘤细胞。此外，鼻腔给药由于使用便捷且可提高患者依从性，已成为一种有效且安全的肿瘤疫苗递送方式。然而，表位肽因免疫原性较弱且递送效率不足，难以适用于鼻腔递送。纳米乳剂（NEs）是一种热力学稳定的体系，可负载抗原并直接递送至鼻黏膜表面。Ile-Lys-Val-Ala-Val（IKVAV）是层粘连蛋白的核心五肽，为人类呼吸道上皮细胞表达的整合素结合肽。本研究开发了一种含有合成肽IKVAV-OVA的鼻内自组装表位肽纳米乳剂肿瘤疫苗。257-264 (I-OVA) 通过低能乳化法制备。IKVAV 与 OVA 的组合257-264 可增强鼻黏膜上皮细胞对抗原的摄取。本文建立了一种研究其理化特性的方案，包括透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）检测；通过黏蛋白存在条件下的稳定性评估；利用BEAS-2B细胞活力及C57BL/6小鼠鼻腔和肺组织毒性检测评价其细胞毒性；通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）分析细胞摄取情况；以及通过小动物成像研究释放特性 体内；并利用E.G7荷瘤模型评估该疫苗的保护性和治疗性效果。我们预期该方案将为新型T细胞表位肽黏膜疫苗的未来研发提供技术和理论依据。

根据该方案，我们完成了制备和 体外 和 体内 鼻部肿瘤纳米疫苗递送的实验评估。透射电子显微镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）和动态光散射（DLS）是评估纳米疫苗表面zeta电位和粒径等基本特性的重要手段。图1）。BEAS-2B 上皮细胞是用于筛选的有用模型 体外 鼻用疫苗的毒性测试图 2A）。经H染色的显微照片&amp;我们证明I-OVA NE无明显黏膜毒性，包括组织损伤、出血或炎性细胞浸润（图2B）。鼻腔中 BEAS-2B 细胞对抗原的有效摄取是启动抗原提呈并引发后续免疫反应的前提条件（图3IVIS 系统有助于阐明 I-OVA 纳米乳剂的缓释效应 体外 并表明该纳米疫苗可延缓快速释放，延长在鼻腔区域的停留时间，并提高细胞对肽段的摄取效率（图4）。预防性保护模型和治疗性...

本文详细介绍了鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备与评价方法 体外 和 体内

表位肽因其安全性高、特异性强和制备方便，在肿瘤疫苗领域受到广泛关注；……

新型纳米乳剂疫苗在疾病治疗策略中具有显著优势。这些优势得益于其独特的肿瘤趋向性、对特定靶点的识别能力以及低系统性毒性等特性。我们预期该方案将为新型T细胞表型肽黏膜疫苗的未来发展提供技术和理论依据。首先将一毫克单磷酸化脂质A与100微升DMSO混合。涡旋振荡五分钟，并在室温下静置四小时使其充分溶解。定量加入TWEEN 80和I-OVA。混合各组分并加入角鲨烯。随后，向已制备的混合物中加入100微升MPLA溶液。为制备纳米乳剂疫苗，将混合溶液逐滴加入约占总体积70%的水相中，轻轻搅拌，直至形成透明且易于流动的混合物。进行体外实验时，首先复苏BEAS2B上皮细胞。打开水浴锅并将温度调节至37摄氏度。将冻存的细胞冻存管在37摄氏度的水浴中快速解冻。解冻后，迅速将细胞用移液器转移至一个15毫升无菌离心管中，并加入2毫升完全培养基。在129 ×g 条件下离心5分钟。弃去上清液，用2毫升完全培养基重悬细胞。再次离心细胞后，弃去上清液，加入6 mL完全培养基重悬细胞。随后将细胞转移至T25培养瓶中，在37°C、5% CO₂培养箱中孵育。当细胞密度达到80%至90%时，弃去培养基，用2 mL PBS洗涤细胞两次。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞1至2分钟。当观察到细胞变圆时，立即加入4 mL完全培养基以中和胰蛋白酶。混匀后将样品转移至15 mL无菌离心管中。 将样品在129 ×g 条件下离心五分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升完全RPMI 1640培养基中。取20微升细胞悬液进行细胞计数，并将细胞稀释至每毫升1×10⁵个细胞。随后，将BEAS2B细胞以每孔1 × 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100 µL RPMI 1640完全培养基，并按照先前所述方法预培养24小时。培养结束后，弃去上清液，向96孔板的每孔中加入100 µL RPMI 1640培养基。随后，分别向各孔加入100 µL I-OVA纳米乳剂、I-OVA与BNE的混合物，以及用完全生长培养基预稀释至不同终浓度的I-OVA，以含BNE的组作为对照，于37°C孵育24小时。孵育完成后，移除培养基，将培养板转移至避光处。向每孔中加入90微升完全培养基和10微升CCK8溶液。在37°C和5%二氧化碳条件下孵育2小时。使用酶标仪在450纳米处测定每孔的吸光度。使用10微升移液器吸头，对小鼠进行连续三天的鼻腔免疫，分别给予I-OVA、I-OVA联合BNE以及I-OVA NE。以BNE和PBA作为实验对照。随后，用剪刀切取约三毫米厚的鼻腔组织样本，并将其置于4%多聚甲醛中。取出肺组织，将鼻腔组织和完整肺组织在4%多聚甲醛中固定24小时。采用透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）对纳米疫苗的表面ζ电位和粒径等基本特性进行评估。显示了I-OVA纳米乳剂在黏液稳定性分析中的粒径、多分散系数、泽塔电位和电泳迁移率。BEAS2B细胞在暴露于不同浓度的I-OVA、BNE+I-OVA和I-OVA纳米乳剂24小时后，相对存活率均超过80%。I-OVA纳米乳剂组未见明显黏膜毒性、组织损伤、出血或炎性细胞浸润。上皮 BEAS2B 细胞摄取的 FITC 标记的 I-OVA 纳米乳剂（NE）多于其水溶液。使用 IV-IS 系统分析了 I-OVA 纳米乳剂（NE）在体外的缓释效应。与 I-OVA 水溶液相比，I-OVA 纳米乳剂（NE）疫苗具有缓释效果。在I-OVA NE组中，生存时间百分比高于其他各组，且肿瘤体积显著更小，表明其预防保护效果优于其他各组。在治疗模型中，不同组之间的中位生存时间存在显著差异。I-OVA NE组的肿瘤体积显著小于I-OVA组。在此步骤中，充分搅拌混合物非常重要，否则会降低纳米疫苗的效率。

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科研

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Immunology and Infection

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本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内...

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阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

学习制备鼻自组装纳米乳肿瘤疫苗的方法，用于评估其体外特性、体内毒性及抗肿瘤疗效。该方案为T细胞肽黏膜疫苗的开发提供技术与理论参考。

鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价体外和体内

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