鼻用自组装纳米乳肿瘤疫苗的制备、特性、毒性及有效性评价 体外 和 体内

新型纳米乳剂疫苗在疾病治疗策略中具有显著优势。这些优势得益于其独特的肿瘤趋向性、对特定靶点的识别能力以及低系统性毒性等特性。我们预期该方案将为新型T细胞表型肽黏膜疫苗的未来发展提供技术和理论依据。

首先将一毫克单磷酸化脂质A与100微升DMSO混合。涡旋振荡五分钟，并在室温下静置四小时使其充分溶解。定量加入TWEEN 80和I-OVA。

混合各组分并加入角鲨烯。随后，向已制备的混合物中加入100微升MPLA溶液。为制备纳米乳剂疫苗，将混合溶液逐滴加入约占总体积70%的水相中，轻轻搅拌，直至形成透明且易于流动的混合物。

进行体外实验时，首先复苏BEAS2B上皮细胞。打开水浴锅并将温度调节至37摄氏度。将冻存的细胞冻存管在37摄氏度的水浴中快速解冻。

解冻后，迅速将细胞用移液器转移至一个15毫升无菌离心管中，并加入2毫升完全培养基。在129 ×g 条件下离心5分钟。弃去上清液，用2毫升完全培养基重悬细胞。

再次离心细胞后，弃去上清液，加入6 mL完全培养基重悬细胞。随后将细胞转移至T25培养瓶中，在37°C、5% CO₂培养箱中孵育。当细胞密度达到80%至90%时，弃去培养基，用2 mL PBS洗涤细胞两次。

加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞1至2分钟。当观察到细胞变圆时，立即加入4 mL完全培养基以中和胰蛋白酶。混匀后将样品转移至15 mL无菌离心管中。

将样品在129 ×g 条件下离心五分钟。弃去上清液，并将细胞重悬于1毫升完全RPMI 1640培养基中。取20微升细胞悬液进行细胞计数，并将细胞稀释至每毫升1×10⁵个细胞。

随后，将BEAS2B细胞以每孔1 × 10⁴个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100 µL RPMI 1640完全培养基，并按照先前所述方法预培养24小时。培养结束后，弃去上清液，向96孔板的每孔中加入100 µL RPMI 1640培养基。随后，分别向各孔加入100 µL I-OVA纳米乳剂、I-OVA与BNE的混合物，以及用完全生长培养基预稀释至不同终浓度的I-OVA，以含BNE的组作为对照，于37°C孵育24小时。

孵育完成后，移除培养基，将培养板转移至避光处。向每孔中加入90微升完全培养基和10微升CCK8溶液。在37°C和5%二氧化碳条件下孵育2小时。

使用酶标仪在450纳米处测定每孔的吸光度。使用10微升移液器吸头，对小鼠进行连续三天的鼻腔免疫，分别给予I-OVA、I-OVA联合BNE以及I-OVA NE。以BNE和PBA作为实验对照。

随后，用剪刀切取约三毫米厚的鼻腔组织样本，并将其置于4%多聚甲醛中。取出肺组织，将鼻腔组织和完整肺组织在4%多聚甲醛中固定24小时。采用透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）对纳米疫苗的表面ζ电位和粒径等基本特性进行评估。

显示了I-OVA纳米乳剂在黏液稳定性分析中的粒径、多分散系数、泽塔电位和电泳迁移率。BEAS2B细胞在暴露于不同浓度的I-OVA、BNE+I-OVA和I-OVA纳米乳剂24小时后，相对存活率均超过80%。I-OVA纳米乳剂组未见明显黏膜毒性、组织损伤、出血或炎性细胞浸润。

上皮 BEAS2B 细胞摄取的 FITC 标记的 I-OVA 纳米乳剂（NE）多于其水溶液。使用 IV-IS 系统分析了 I-OVA 纳米乳剂（NE）在体外的缓释效应。与 I-OVA 水溶液相比，I-OVA 纳米乳剂（NE）疫苗具有缓释效果。

在I-OVA NE组中，生存时间百分比高于其他各组，且肿瘤体积显著更小，表明其预防保护效果优于其他各组。在治疗模型中，不同组之间的中位生存时间存在显著差异。I-OVA NE组的肿瘤体积显著小于I-OVA组。

在此步骤中，充分搅拌混合物非常重要，否则会降低纳米疫苗的效率。