Name: 通过受精卵的CRISPR电穿孔对小鼠进行高效基因组编辑 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习CRISPR-EZ技术对小鼠受精卵进行高效基因组编辑的方法。该技术利用电穿孔将CRISPR核糖核蛋白复合物导入胚胎，实现接近100%的编辑效率，适用于基因功能研究和疾病模型构建。

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A.J.M. 提出了最终促成 CRISPR-EZ 开发的原始构想，并绘制了相关图示。C.K.D. 汇编并调整了本论文所用的内部及已发表的实验方案。A.J.M. 的研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R00HD096108）。

本方案中所有动物护理和使用均遵循《动物福利法》政策、ILAR《实验动物护理和使用指南》，并遵守美国兽医协会（AVMA）关于安乐死的指南以及宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南与政策。该动物护理和使用方案已通过宾夕法尼亚大学IACUC的审查和批准。出于合规性和谨慎考虑，在实施本方案前，请务必获取所有必要的授权。
1. sgRNA 和可选供体寡核苷酸的设计
<ol>
	<li>sgRNA 设计
	<ol>
		<li>从任何广泛使用的在线算法中选择候选 sgRNA，例如 Sequence Scan for CRISPR（SSC；&#160;http://crispr.dfci.harvard.edu/SSC/）28 或 CRISPick（https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public）29。由于每个平台各不相同，请仔细阅读用户说明，以设计理想的 sgRNA。对于插入/缺失（in/del）实验，建议选择两到三个 sgRNA 进行测试。对于缺失实验，建议选择位于目标区域两侧的 sgRNA，例如在目标区域上游选择两个 sgRNA，在目标区域下游选择两个 sgRNA。 
		注意：尽管各种在线 sgRNA 算法已考虑脱靶效应以避免设计缺陷的 sgRNA，但 NCBI 的 BLAST 工具在验证所选 sgRNA 序列质量方面仍具有帮助作用。</li>
		<li>将上一步（1.1.1）确定的 19–20 个核苷酸（nt）插入 sgRNA 寡核苷酸的可变区域（补充表 1），并作为定制 DNA 寡核苷酸合成并订购。 
		注意：无需进行 PAGE 纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）用于同源定向修复（HDR）介导的基因敲入的供体寡核苷酸设计。
	<ol>
		<li>根据预期的实验结果（精确点突变、loxP 插入、小标签插入等）设计合适的单链寡脱氧核苷酸（ssODN），总长度保持在 100–200 nt，中央区域两侧的同源臂长度应不少于 50 nt。</li>
		<li>为提高敲入效率，应设计 sgRNA 使其与 ssODN 互补30，并将原间隔序列邻近基序（PAM）序列替换为沉默突变，以防止 Cas9 酶重复切割。</li>
		<li>通过定制寡核苷酸选项订购 ssODN。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. sgRNA 合成
<ol>
	<li>用于模板生成的 体外 体外转录（IVT）
	<ol>
		<li>为通过PCR生成用于sgRNA体外转录（IVT）的DNA模板，准备一个无RNase的PCR条状管进行IVT反应。（参见 补充表 2).</li>
		<li>使用以下热循环仪程序条件： 
		95 °C 预变性 2 分钟；&#160;30&#160;循环次数&#160;95 °C 预变性 2 分钟，57 °C 退火 10 秒，72 °C 延伸 10 秒；随后 72 °C 最终延伸 2 分钟</li>
		<li>为验证sgRNA DNA模板PCR反应是否成功，取5 µL产物与1 µL 6x上样缓冲液混合，于2%（wt/vol）琼脂糖凝胶中进行电泳。 
		注意：预期产物大小为127 bp。剩余的PCR反应产物可在-20 °C保存长达5个月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体外 sgRNA的体外转录（IVT）
	<ol>
		<li>为生成sgRNA，在PCR管中配制反应混合物（按说明书进行T7体外转录），轻轻弹击管壁以混匀试剂。 
		注意：参见 补充表3 反应体系设置示例。体外转录（IVT）反应对RNase污染敏感，因此应尽一切努力提供无RNase的环境。</li>
		<li>为使反应启动并进行，将体外转录（IVT）反应混合物孵育一段时间 &#62;37 °C 下孵育 18 小时，可使用 PCR 仪或加热块。</li>
		<li>为了降解原始DNA模板（步骤2.1.3），加入1 µL DNase I（每反应2单位），在室温（RT）下孵育反应20分钟。</li>
		<li>为促进RNA与磁性纯化 beads 的结合，向反应体系中加入129 µL 100%乙醇，使总体积达到150 µL。</li>
		<li>为重悬在储存过程中容易沉淀的纯化珠，需将分装样品涡旋振荡至少10秒。</li>
		<li>为纯化sgRNA，将100 µL重悬的磁珠（步骤2.2.5）加入体外转录反应体系（步骤2.2.4）中，轻轻吹打10次混匀。</li>
		<li>为促进结合，将混合物在室温下静置5分钟。</li>
		<li>为分离sgRNA与未结合的反应产物，将反应液置于磁力架上，室温静置5分钟，直至形成微小沉淀。</li>
		<li>洗涤sgRNA时，首先小心弃去上清液，然后在远离沉淀的位置加入200 µL 80%乙醇。 
		注意：在80%（体积/体积）乙醇洗涤步骤中，必须避免用移液器扰动沉淀，否则会显著降低sgRNA浓度。应轻轻加入80%乙醇使沉淀完全浸没，再用移液器轻柔吸出液体。</li>
		<li>重复上一步（步骤 2.2.9），并将沉淀在空气中干燥不超过 5–6 分钟，否则 sgRNA 将永久结合到磁珠上。</li>
		<li>用20 µL无核酸酶水重悬sgRNA沉淀，吹打10次，室温孵育2分钟，然后将样品重新置于磁力架上，使磁珠与纯化后的sgRNA分离。</li>
		<li>为评估sgRNA的质量和数量，可使用分光光度计或生物分析仪等仪器。或者，取2 µL sgRNA在2%琼脂糖凝胶上电泳，操作类似于步骤2.1.3。 
		&#8203;注意：通过一条清晰的条带确认质量。剩余的sgRNA可立即使用，或保存在−80 °C条件下。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 超数排卵
<ol>
	<li>为了获得足够的胚胎以测试每种sgRNA设计，对2至3只年龄在3至5周的C57BL/6J雌性小鼠进行超数排卵，具体方法如前所述9。建议对每种sgRNA电穿孔20-30个胚胎，以获得足够数量的结果来确认其有效性。 
	注：若受精成功，每对交配小鼠可获得10-20个胚胎。</li>
	<li>为诱导排卵，请遵循以下激素注射方案：
	<ol>
		<li>第1天：使用26 G注射器，通过腹腔（IP）注射方式，向3至5周龄雌性小鼠注射5 IU孕马血清促性腺激素（PMSG）（100 µL）。</li>
		<li>第3天：在注射PMSG后46-48小时，通过腹腔（IP）注射5 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）（100 µL），以诱导排卵。</li>
		<li>为设置交配，应在注射hCG后立即以1:1的比例将雌鼠与具有可靠繁殖能力的雄鼠配对。 
		&#8203;注：为防止激素解冻后降解失活，应在解冻后30分钟内完成注射。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 胚胎的收集与处理
<ol>
	<li>胚胎收集
	<ol>
		<li>为处死雌性小鼠并获取所需材料，如先前所述31，请务必首先根据机构政策确认合适的处死方法。例如，可采用CO2窒息、颈椎脱位和/或其它经批准的方法。 
		注意：通常情况下，经激素刺激的雌性小鼠中&#62;75%会显示交配栓，表明交配成功。</li>
		<li>为防止毛发影响组织采集，在处死后将雌性小鼠仰卧放置，并向待手术切开的腹部区域喷洒70%（体积比）乙醇。 
		注意：从此时起，建议在通风橱内进行手术操作，以维持无菌环境并降低污染风险。</li>
		<li>为打开腹腔并取出输卵管，使用手术剪剪开皮肤/毛发（皮下）层，找到卵巢（图4），卵巢位于肾脏附近，并与一段脂肪垫相连。输卵管位于卵巢近端（图4）。将两侧输卵管从雌性小鼠体内手术取出，并分别放入含有50 µL M2+BSA（4 mg/mL BSA）培养基的液滴中（图5A）。 
		注意：本步骤的详细操作说明可通过视觉参考31或按步骤指南9查阅已发表的实验方案。</li>
		<li>为释放含有卵母细胞的卵丘-卵母细胞复合体（CoCs）（图4），在体视显微镜下使用解剖镊轻轻刺破输卵管壶腹部。</li>
		<li>为减少碎片（血液、脂肪、组织）残留，使用手持移液器（设定为20–30 µL）将每个CoC转移并合并至一个50 µL的M2+BSA培养基液滴中，以避免碎片带入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除卵丘细胞
	<ol>
		<li>为开始从受精卵（图4）中去除卵丘细胞，尽可能少地带入额外培养基，将CoCs转移至100 µL M2+透明质酸酶液滴中（图5B），并通过反复吹打使CoCs轻微混合，直至受精卵明显与较小的卵丘细胞分离。务必尽量缩短M2+透明质酸酶对胚胎的暴露时间，因其可能影响胚胎活力。 
		注意：若在2分钟内胚胎仍未与卵丘细胞分离，可预先加热（37 °C）或额外添加50 µL M2+透明质酸酶。</li>
		<li>为稀释透明质酸酶并清除松散的卵丘细胞，使用口控移液器将受精卵转移至新鲜的50 µL M2+BSA液滴中。 
		注意：此后大多数步骤均需使用口控移液器，除非另有说明。尽管使用者带来的污染风险较低，但仍建议使用串联空气过滤器以维持无菌环境。有关该器械的制备与使用方法，请参见已发表的技术描述9,31。</li>
		<li>使用口控移液器将胚胎依次通过至少四至五个50 µL的M2+BSA液滴，以进一步减少残留的卵丘细胞数量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>（可选）使用酸性泰罗德液（AT）处理软化透明带
	<ol>
		<li>为腐蚀胚胎的透明带并减少试剂递送过程中的物理障碍，将胚胎转移至60 mm培养皿中预热（37 °C）的100 µL酸性泰罗德液滴中（图5C）。在体视显微镜下持续观察受精卵，直至透明带约有30%被腐蚀9。AT溶液总暴露时间必须控制在60–90秒之间。长时间暴露可能导致透明带完全溶解，从而危及胚胎活力。 
		注意：有关本步骤的详细操作说明及图像资料，请参考已发表的方法9,16。</li>
		<li>为稀释AT溶液，使用口控移液器将胚胎依次通过至少四个50 µL的M2+BSA液滴。</li>
		<li>为确认已处理足够数量的胚胎，使用体视显微镜对胚胎进行计数。根据所用雌性小鼠的数量，每只雌鼠通常可获得约10–20个可存活的受精卵。 
		&#8203;注意：此阶段胚胎应基本无碎片残留，以便准确评估其数量与质量。例如，若使用5只雌鼠，预期受精卵数量约为50–100个，此时使用机械细胞计数器有助于准确记录胚胎数量。由于未受精或排出低质量卵母细胞，通常会有约10%–20%的胚胎损失。在下一步操作前，可将胚胎短暂保存于50 µL M2+BSA培养基中，置于培养箱内不超过30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. RNP 组装与电穿孔
<ol>
	<li>RNP 复合物组装
	<ol>
		<li>为组装 RNP 复合物，请参考所附的示例表格，根据所需的编辑策略在 RNP 缓冲液（100 mM HEPES pH 7.5、750 mM KCl、5 mM MgCl2、50% 甘油和 100 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐 [TCEP] 溶于无核酸酶水中）中配制相应的反应混合物。 
		注意：TCEP 是一种方便的还原剂，但在水溶液中半衰期较短；因此，应在 RNP 复合物组装前立即加入 TCEP。
		<ol>
			<li>对于介导非同源末端连接（NHEJ）的插入缺失，请参考 补充表 4。</li>
			<li>对于介导同源定向修复（HDR）的编辑，请参考 补充表 5。</li>
			<li>对于使用成对 sgRNA 构建缺失的编辑，请参考 补充表 6。
			<ol>
				<li>无论采用何种策略，均在室温下将所需试剂加入 PCR 管中混合。</li>
				<li>为促进 RNP 复合物形成，将混合物在 37 °C 下孵育 10 分钟。 
				注意：RNP 复合物可在室温下保存最多 1 小时。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>电穿孔
	<ol>
		<li>电穿孔前为稀释 BSA，需将胚胎依次通过至少两滴各 50 µL 的低血清培养基。 
		注意：BSA 会增加电穿孔过程中的电阻，可能损伤受精卵。</li>
		<li>为准备并混合受精卵（步骤 4.3.2）与 RNP 复合物（步骤 5.1.1.2）进行电穿孔，用口控移液器将 25–30 个胚胎转移至 10 µL 低血清培养基液滴中，然后使用手持移液器加入 10 µL RNP 复合物（步骤 5.1.1.2）。</li>
		<li>为稀释 RNP 复合物中的黏稠甘油并使样品均一，使用移液器吹打 10 次，或在体视显微镜下观察直至混合物不再显示黏性（无旋涡状图案）。</li>
		<li>为准备将样品插入电穿孔仪，将这 20 µL 胚胎 + RNP 混合液小心移入 0.1 cm 电穿孔比色皿中，避免产生气泡。</li>
		<li>为将编辑试剂递送至受精卵，使用方波电穿孔程序对胚胎进行电穿孔，条件如下：30 V，4–6 次脉冲，脉冲时长 3 ms，脉冲间隔 100 ms。</li>
		<li>为从比色皿中回收受精卵，使用手动移液器将 50 µL KSOM+BSA（1 mg/mL BSA）加入比色皿顶部，以冲洗可能沉降至底部的胚胎。轻柔地将混合液吸出并转移至 60 mm 培养皿中。</li>
		<li>重复步骤 5.2.6 至少 2–3 次，并将每次冲洗液合并至同一 60 mm 培养皿中，直至回收大多数胚胎。 
		&#8203;注意：通常可回收 &#62;90% 初始加载的胚胎。为确保胚胎存活，请测试培养箱状态并检查所有试剂的有效期。胚胎对非理想的培养条件（如温度、CO2 浓度、湿度和 pH）较为敏感。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 胚胎培养与基因分型
<ol>
	<li>胚胎培养
	<ol>
		<li>为了将受精卵培养至目标阶段，使用口控移液管将20-30个受精卵转移至已预平衡培养板中的KSOM+BSA液滴中，并将胚胎移入该液滴（图5D）。在5% CO₂中孵育平板过夜2，37 °C，95% 湿度条件下。 
		注意：预平衡步骤需将已准备好的35 mm培养板置于培养箱中，可在培养前一天或至少在培养前4小时放入图5D).</li>
		<li>为促进理想的生长条件，于次日使用体视显微镜将仅含两个细胞的胚胎转移至新鲜的KSOM+BSA混合液滴中，并放回培养箱。务必保留或丢弃已死亡或未受精的胚胎。 
		注意：受精卵期胚胎在培养72小时后通常发育为桑葚胚，84小时后发育为囊胚。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>基因分型
	<ol>
		<li>使用口吸管将桑葚胚/囊胚胚胎依次通过两滴DPBS，以洗去可能干扰PCR反应的培养基成分。</li>
		<li>单胚胎加载方法&#160;裂解，用移液器吸取1 µL，将单个胚胎转移至8孔PCR条板的其中一个孔中，然后加入10 µL裂解缓冲液（50 mM KCl，10 mM Tris-HCl pH 8.5，2.5 mM MgCl₂）2，0.1 mg/mL 明胶，0.45% Nonidet P-40，0.45% Tween 20，0.2 mg/mL 蛋白酶K，溶于无核酸酶的H2O 
		注意：在配制裂解缓冲液前立即加入蛋白酶K。</li>
		<li>为裂解胚胎，将PCR仪程序设置为55 °C孵育4小时，随后在95 °C孵育10分钟以灭活蛋白酶K。 
		注意：对于初次使用者，建议先进行一次编辑实验 Tyr 位点。该实验流程已优化，可作为阳性对照。如有必要，可在PCR分析前将胚胎裂解液在4 °C保存2-3天，或在冷冻条件下保存最多2周。避免反复冻融。</li>
		<li>为了提高基因分型分析的成功率，采用巢式PCR策略，扩增包含靶位点两侧稍长的DNA片段以及用于后续扩增更精确DNA片段的区域。遵循以下条件进行操作： 补充表7.</li>
		<li>按照以下热循环仪条件进行操作： 
		95 °C 预变性 2 分钟 
		30+&#160;循环：95 °C 2分钟，60 °C 10秒，72 °C 10秒 
		&#8203;72 °C 反应 2 分钟</li>
		<li>为准备巢式PCR策略的第二阶段，将第一轮PCR产物（步骤6.2.5）进行1:10稀释，并取2 µL该稀释产物加入下一轮PCR反应中（使用设计在前一轮扩增子内部的引物）。 
		注意：第一次PCR反应产物必须稀释，以减少在第二次PCR反应中引物的残留。按照以下步骤准备巢式PCR： 补充表8.</li>
		<li>将PCR反应置于热循环仪中，并使用以下循环条件： 
		95 °C 预变性 2 分钟 
		30个循环：95 °C 变性2 min，60 °C 退火10 s，72 °C 延伸10 s 
		72 °C 反应 2 分钟 
		注意：通常情况下， &#62;当扩增片段大小为500 bp或更短时，90%的PCR反应能够成功。</li>
		<li>（可选对照）用于非同源末端连接介导的插入/缺失突变分析 Tyr 作为阳性对照，取10 µL第6.2.7步的巢式PCR产物，加入10 U HinfI，在20 µL反应体系中37 °C孵育4 h（参见 补充表9在2%琼脂糖凝胶上电泳消化产物以评估编辑效果，并以未消化的PCR产物作为上样对照。以135 V电压电泳30分钟。 
		注意：选择 HinfI 作为合适的限制性内切酶，是由于在 sgRNA 靶向区域内存在一个位置便利的 HinfI 位点，该位点在成功发生 NHEJ 编辑后预计会消失。相关详细方法与结果此前已有描述。9,16.</li>
		<li>（可选对照）用于HDR介导的突变 Tyr 作为阳性对照，取10 µL步骤6.2.7中获得的巢式PCR产物，加入10 U EcoRI，在20 µL反应体系中37 °C孵育4 h进行消化（参见 补充表10在2%琼脂糖凝胶上电泳消化产物以评估编辑效果，并以未消化的PCR产物作为上样对照。以135 V电压电泳30分钟。 
		注意：选择 EcoRI 作为诊断性限制性内切酶，是利用了 sgRNA 靶向区域原有的序列特征。在成功发生 HDR 后，原本存在的 HinfI 位点被替换为 EcoRI 位点，同时引入移码突变，从而干扰目标基因的正常功能 Tyr 基因。对于HDR分析，应对每个样本同时进行NHEJ（步骤6.2.8）和HDR（步骤6.2.9）分析，因为两种结果均可能发生，且有助于确定嵌合性。相关详细方法和结果此前已有报道。9,16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Scientific Reports. 8, 474(2018).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y. -F., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increased+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increased the efficiency of model creation.</a> Journal of Genetics and Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
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<li>Remy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+gene-edited+rats+by+delivery+of+CRISPR%2FCas9+protein+and+donor+DNA+into+intact+zygotes+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of gene-edited rats by delivery of CRISPR/Cas9 protein and donor DNA into intact zygotes using electroporation.</a> Scientific Reports. 7, 16554(2017).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+PDX-1+mutant+porcine+blastocysts+by+introducing+CRISPR%2FCas9-system+into+porcine+zygotes+via+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Science+Journal%22%5BJournal%5D)">Generation of PDX-1 mutant porcine blastocysts by introducing CRISPR/Cas9-system into porcine zygotes via electroporation.</a> Animal Science Journal. 90 (1), 55-61 (2019).</li>
<li>Zhou, X., Guo, H., Chen, K., Cheng, H., Zhou, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+chromosomal+mapping+and+conserved+synteny+of+porcine+Argonaute+family+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetica%22%5BJournal%5D)">Identification, chromosomal mapping and conserved synteny of porcine Argonaute family of genes.</a> Genetica. 138 (7), 805-812 (2010).</li>
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<li>Escoffre, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+%28still+not%29+known+of+the+mechanism+by+which+electroporation+mediates+gene+transfer+and+expression+in+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">What is (still not) known of the mechanism by which electroporation mediates gene transfer and expression in cells and tissues.</a> Molecular Biotechnology. 41 (3), 286-295 (2009).</li>
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<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+determinants+of+improved+CRISPR+sgRNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design.</a> Genome Research. 25 (8), 1147-1157 (2015).</li>
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<li>Okamoto, S., Amaishi, Y., Maki, I., Enoki, T., Mineno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+genome+editing+for+single-base+substitutions+using+optimized+ssODNs+with+Cas9-RNPs%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient genome editing for single-base substitutions using optimized ssODNs with Cas9-RNPs.</a> Scientific Reports. 9, 14811(2019).</li>
<li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieval+of+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retrieval of mouse oocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (3), e185(2007).</li>
<li>Takahashi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GONAD%3A+Genome-editing+via+oviductal+nucleic+acids+delivery+system%3A+A+novel+microinjection+independent+genome+engineering+method+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">GONAD: Genome-editing via oviductal nucleic acids delivery system: A novel microinjection independent genome engineering method in mice.</a> Scientific Reports. 5, 11406(2015).</li>
<li>Tu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+Cas9+degradation+reduces+mosaic+mutations+in+non-human+primate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Promoting Cas9 degradation reduces mosaic mutations in non-human primate embryos.</a> Scientific Reports. 7, 42081(2017).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16 (1), 87(2015).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+exon-intron+architecture+variation+of+genes+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Patterns of exon-intron architecture variation of genes in eukaryotic genomes.</a> BMC Genomics. 10, 47(2009).</li>
<li>Quadros, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR%3A+a+robust+method+for+one-step+generation+of+mice+carrying+conditional+and+insertion+alleles+using+long+ssDNA+donors+and+CRISPR+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins.</a> Genome Biology. 18, 92(2017).</li>
<li>Gurumurthy, C. B., Saunders, T. L., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+and+generating+a+mouse+model%3A+frequently+asked+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Designing and generating a mouse model: frequently asked questions.</a> Journal of Biomedical Research. 35 (2), 76-90 (2021).</li>
<li>Nakajima, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+in+the+knockin+mice+generated+using+the+CRISPR%2F+Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing in the knockin mice generated using the CRISPR/ Cas system.</a> Scientific Reports. 6, 34703(2016).</li>
<li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nature Methods. 12 (6), 479(2015).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
</ol>

作者无相关财务声明。

本文介绍了一种简单且高效的鼠类基因组编辑技术。通过电穿孔法可在1-2周内生成经修饰的胚胎（图1），并在6周内获得基因编辑小鼠9。与同期开发的基于电穿孔递送核糖核蛋白复合物（RNPs）的技术相比7,10,11,12,13,14,15,17,32，本文所述方法在概念上相似，效率水平相当，仅在试剂开发和实验参数方面存在细微差异。因此，我们建...

自CRISPR基因编辑技术出现以来，活体小鼠的基因组编辑已大大简化，变得更加易于获取且成本更低1,2,3。早期的动物基因编辑尝试采用显微注射技术，将CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA导入原核期胚胎4,5,6。尽管显微注射效率较高，但其操作需要大量练习才能完全掌握，可能不适合受训人员和学生，同时也需要资金有限的实验室难以负担的昂贵设备。显微注射通常由转基因核心设施的专业技术人员完成，其排期和服务费用往往成为许多研究人员的限制因素。一种更易获取的方法是电穿孔法，已有研究证明该方法在将CRISPR Cas9 mRNA/sgRNA递送至原核期胚胎方面具有较高效率7。CRISPR基因组编辑及递送策略的进一步改进表明，预先组装并与sgRNA结合的核糖核蛋白复合物（RNP）可能是降低嵌合体比例的有效手段8。
开发和使用本实验方案的目的是为了规避与显微注射相关联的诸多局限性和障碍。顾名思义，一种简便、可自主实施且成本效益高的方法，能够快速判断未经测试的sgRNA设计是否值得在显微注射实验中使用，将是一种极为便捷的初步质量控制步骤。图1）。虽然该方法无法替代显微注射在更复杂策略中的应用，例如引入长片段供体DNA以实现基于重组的编辑结果，但它非常适合小片段缺失、插入或基因标记等较简单的编辑策略。该方法适用于具备基本胚胎操作技能的研究人员，尤其适合编辑需求较为简单、希望在胚胎着床前发育阶段内验证假设，或希望在预约显微注射专家前于胚胎中先行测试sgRNA有效性的研究场景。在此方法中，编辑试剂以Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物（RNPs）的形式瞬时递送至原核期胚胎中 通过 电穿孔（一系列电脉冲）以在降低嵌合性的同时提高效率8. 采用胚胎基因分型方法，约1周内可获得编辑结果9从而显著降低成本，减少对多种显微注射应用的需求。
该方法在原核期胚胎阶段效果最佳，此时胚胎的母源和父源原核尚未融合，也未进入S期（图2）。通过超数排卵可最大化获得受精卵数量，但此过程会同时产生原核期受精卵和未受精卵。在电穿孔前还可预先筛选健康的受精卵，以提高整体效率。由于已有其他电穿孔方案在无需类似步骤的情况下高效实现了对受精卵的基因编辑7,10,11,12,13,14,15，因此本方案中对透明带（ZP）进行轻微蚀刻为可选步骤。透明带是一种糖蛋白层，有助于精子结合、顶体反应以及围绕原核期胚胎的受精过程。根据我们的经验，采用温和的酸性处理对透明带进行轻微蚀刻，可在对胚胎活力影响极小的前提下，实现Cas9核糖核蛋白（RNP）电穿孔递送的可靠性。
我们观察到核糖核蛋白的递送效率高达100% 通过 在C57BL/6J和C57BL/6N等常用于研究的小鼠品系中进行电穿孔9,16不同的研究团队还开发了基于电穿孔的技术，其效率达到或超过显微注射。11,12,13,14,15,17，电穿孔方案在大鼠中效果良好18,19，猪20,21,22 和牛23因此，我们建议读者比较不同实验方案，以确定最符合其实验条件和设备需求的操作步骤。本文所述系统采用常规材料和设备，仅需具备基本的胚胎操作技能。该技术适用于多种基因编辑策略，因而可广泛应用于科研领域。
设计理想的单链向导RNA（sgRNA）对于实现高效编辑至关重要。我们建议针对每个靶位点，在小鼠胚胎中直接筛选两到三种sgRNA策略，尤其是在需要建立小鼠品系的情况下。设计完成后，推荐采用无需克隆的方法，例如体外转录（in vitro transcription, IVT），以制备高质量的sgRNA3。将核糖核蛋白复合物（RNP）和sgRNA与30–50枚处于原核期的胚胎混合，并施加一系列电脉冲，首先短暂通透化透明带（ZP）和细胞膜，随后的脉冲则维持孔道开放，并通过电穿孔将RNP导入合子中24。经过优化，我们发现对于大批量胚胎（约50枚），施加6次、每次3 ms、电压30 V的电脉冲，在编辑效率和胚胎存活率方面均达到最佳效果，可实现高效的Cas9/sgRNA RNP递送9,16,25。个体小鼠桑葚胚中的编辑事件可通过多种CRISPR编辑常用的验证策略进行确认，例如限制性片段长度多态性分析（RFLP）、T7核酸内切酶消化以及目标区域的Sanger测序26。
目前的方法最适合简单的编辑方案（图3），例如插入/缺失（indels）、大小在500-2000 bp范围内的外显子级别缺失，以及点突变和小片段插入（如C端或N端标签，例如FLAG、HA或V5）的递送9,16,27。对于复杂的基因组编辑（如荧光标签的大片段插入或条件性等位基因的构建），其可行性尚不明确，目前正作为未来改进工作的重点方向。
该方法易于掌握，可在1周内利用培养的小鼠胚胎快速测试sgRNA9（图1）。本文介绍了一个六步实验方案，包括：1）sgRNA设计；2）sgRNA合成；3）超数排卵与交配；4）胚胎培养、收集与处理；5）RNP组装与电穿孔；6）胚胎培养与基因分型。文中提供了所用全部材料的信息（材料表）。作为阳性对照，补充表1中包含了编辑Tyrosinase (Tyr)基因座的试剂9,16。

<table><tbody><tr><td>0.1 cm间隙电穿孔比色皿</td><td>Bio-Rad</td><td>货号：1652089</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>26G，1/2英寸针头</td><td>BD</td><td>货号：305111</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>3&amp;ndash;8月龄雄性小鼠和3至5周龄雌性小鼠</td><td>JAX</td><td>货号：000664</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>35 mm组织培养皿</td><td>Greiner Bio-One,</td><td>货号：627-160</td><td>胚胎培养</td></tr><tr><td>60 mm组织培养皿</td><td>Greiner Bio-One,</td><td>货号：628-160</td><td>胚胎处理</td></tr><tr><td>6×上样染料</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>货号：R0611</td><td>sgRNA合成与基因分型</td></tr><tr><td>酸性Tyrode's溶液（AT），胚胎培养级</td><td>Sigma-Aldrich,</td><td>货号：T1788</td><td>胚胎处理</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），胚胎培养级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：A3311</td><td>胚胎处理与培养</td></tr><tr><td>Cas9蛋白</td><td>Alt-R S.p. Cas9核酸酶 3NLS</td><td>货号：1074181</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>DNase I，无RNase</td><td>New England BioLabs,</td><td>货号：M0303</td><td>sgRNA合成</td></tr><tr><td>DPBS（无钙镁）</td><td>Gibco</td><td>货号：14190-144</td><td>胚胎处理</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>NEB</td><td>货号：R3101S</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>EDTA，无水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：EDS-100G</td><td>RNP缓冲液</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Koptec</td><td>货号：V1016</td><td>sgRNA合成</td></tr><tr><td>明胶（粉末），B型，实验室级</td><td>Fisher,</td><td>货号：G7-500</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>甘油，&amp;nbsp;分子生物学级</td><td>Fisher</td><td>货号：BP229</td><td>RNP缓冲液</td></tr><tr><td>Taq DNA聚合酶</td><td>Promega</td><td>货号：M712</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>HEPES，细胞培养级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：H4034</td><td>RNP缓冲液</td></tr><tr><td>HinfI（10,000 U/mL）</td><td>NEB</td><td>货号：R0155S</td><td>基因分型</td></tr><tr><td>HiScribe T7高产量RNA合成试剂盒</td><td>New England BioLabs,</td><td>货号：E2040</td><td>sgRNA合成</td></tr><tr><td>人绒毛膜促性腺激素，冻干粉&amp;nbsp;（hCG）</td><td>Millipore</td><td>货号：230734</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>透明质酸酶/M2</td><td>Millipore</td><td>货号：MR-051-F</td><td>胚胎处理</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve培养基（含钾简单优化培养基加氨基酸）</td><td>Zenith Biotech</td><td>货号：ZEKS-050</td><td>胚胎培养</td></tr><tr><td>LE琼脂糖，分析级</td><td>BioExpress</td><td>货号：E-3120-500</td><td>sgRNA合成与基因分型</td></tr><tr><td>M2培养基</td><td>Zenith Biotech</td><td>货号：ZFM2-050</td><td>胚胎处理</td></tr><tr><td>氯化镁，无水（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：M8266</td><td>RNP与裂解缓冲液</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Millipore</td><td>货号：ES-005C</td><td>胚胎培养</td></tr><tr><td>Nonidet P-40替代物（NP-40）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：74385</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>无核酸酶水，分子生物学级</td><td>Ambion</td><td>货号：AM9937</td><td>sgRNA合成与基因分型</td></tr><tr><td>用于sgRNA合成、供体质粒寡核苷酸及基因分型PCR引物的寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制订单</td><td>sgRNA设计</td></tr><tr><td>低血清培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>货号：31985062</td><td>胚胎培养</td></tr><tr><td>高保真DNA聚合酶</td><td>New England BioLabs,</td><td>货号：M0530</td><td>sgRNA合成</td></tr><tr><td>氯化钾，分子生物学级（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：P9333</td><td>RNP与裂解缓冲液</td></tr><tr><td>孕马血清促性腺激素，冻干粉（PMSG）</td><td>ProspecBio</td><td>货号：HOR-272</td><td>超数排卵</td></tr><tr><td>蛋白酶K，分子生物学级</td><td>Fisher</td><td>货号：BP1700-100</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>无RNase 1.5 mL微量离心管</td><td>VWR</td><td>货号：20170-333</td><td>sgRNA合成与基因分型</td></tr><tr><td>无RNase八联PCR管条</td><td>VWR</td><td>货号：82006-606</td><td>sgRNA合成与基因分型</td></tr><tr><td>磁珠纯化珠</td><td>GE Healthcare</td><td>货号：65152105050250</td><td>sgRNA合成</td></tr><tr><td>三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：C4706</td><td>RNP缓冲液</td></tr><tr><td>Tris-HCl溶液，pH 8.5，分子生物学级</td><td>Teknova</td><td>货号：T1085</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Tween 20，分子生物学级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>货号：P7949-500</td><td>裂解缓冲液</td></tr></tbody></table>

通过crispr显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

Efficient Genome Editing of Mice by CRISPR Electroporation of Zygotes

凭借卓越的效率、准确性和操作简便性，CRISPR/Cas9 系统显著提升了细胞培养和实验动物研究中的基因组编辑水平。在构建动物模型时，受精卵电穿孔技术相较于传统的显微注射这一金标准方法，在效率、操作简便性、成本和通量方面均具有优势。电穿孔对细胞更为温和，具有更高的存活率，并能高效地将 Cas9/单链向导 RNA（sgRNA）核糖核蛋白复合物（RNPs）递送至常用实验小鼠品系（如 C57BL/6J 和 C57BL/6N）的受精卵中，递送效率接近 100%。该技术可实现插入/缺失（indels）突变、点突变、整段基因或外显子的删除，以及插入 100–200 bp 范围内的小片段序列，例如 LoxP 位点或 FLAG、HA、V5 等短标签。尽管该技术仍在持续优化中，本文仍以实验方案形式呈现当前 CRISPR-EZ 技术的最新状态，包括通过体外转录制备 sgRNA 的完整流程 体外 转录、胚胎处理、RNP组装、电穿孔以及植入前胚胎的基因分型。一名仅具备基础胚胎操作经验的研究生，使用本方案可在不到一周的时间内获得基因编辑胚胎。本文提供了一种简单、低成本、高效且高通量的方法，适用于小鼠胚胎。

该方法可生成超过100 µg的sgRNA（20 µL，浓度&gt;6,000 ng/L），适用于高效的Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物组装。本文所述的常规超数排卵方法通常每只交配后发现阴栓的雌鼠可获得10–20枚可存活胚胎。由于操作误差及胚胎操作过程中常见的损失，电穿孔后约有80%的胚胎预期为受精成功、具有活力且状态良好。为帮助研究人员成功开展实验，我们提供了一个以小鼠Tyr基因座为阳性对照的示例策略（图6），包括寡核苷酸设计（图6A、补充表1）以及针对NHEJ和HDR事件的基因型鉴定策略（图6B）（步骤6.2）。有关实验成功案例及结果的详细示例可参见文献9,16。
在之前的一项研究中，为了将该方案与显微注射法进行比较，七个...

本文介绍一种简单的方法，旨在高效产生名为“CRISPR RNP 透明带电穿孔法”（CRISPR-EZ）的基因编辑小鼠。该方法通过电穿孔将编辑试剂导入胚胎，编辑效率接近100%。本方案适用于哺乳动物胚胎中的点突变、小片段基因组插入和缺失。

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

凭借卓越的效率、准确性和操作简便性，CRISPR/Cas9 系统已显著提升了细胞培养和实验动物中的基因组编辑水平。

该方法可用于在胚胎中检测向导RNA，探究早期发育相关问题，或制备基因编辑小鼠。CRISPR Cas9领域的任何进展均可与该方法结合使用。该方法的主要优势在于易于掌握，且所用试剂在具备小鼠资源的实验室中均容易获得。未来，该技术可用于矫正伴侣动物或重要农业动物后代的疾病或基因突变。该方法最适合用于构建小鼠模型。在本实验室中，我们一直采用该方法的多种改良形式，研究受精过程及早期着床前发育的相关事件，特别是胚胎发育潜能中的基因调控机制。最具挑战性的步骤是使用玻璃针将胚胎从一个培养皿转移到另一个培养皿。本操作将由我实验室的研究专家 Chantal Diallo 演示。开始胚胎收集与处理时，将安乐死后的雌性小鼠仰卧放置，并在其腹部喷洒70%乙醇，以便进行手术暴露。为打开腹腔并取出输卵管，使用手术剪剪开皮肤层，找到卵巢。随后，手术切除位于卵巢近端的双侧输卵管，并将其放入分别含有50微升M2加BSA培养基的液滴中。在体视显微镜下，使用解剖镊轻轻刺破输卵管的壶腹部，以释放包含卵母细胞的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），然后为避免碎片残留，使用手柄式移液器（设定为20至30微升）将每个卵丘-卵母细胞复合体转移并合并至一个单独的含50微升M2加BSA培养基的液滴中。接下来，为了去除受精卵中的卵丘细胞，将卵丘复合体（COCs）连同少量培养基转移至含有100 µL M2培养基和透明质酸酶的液滴中，通过移液枪轻轻吹打，直至胚胎与体积小得多的卵丘细胞明显分离。为稀释透明质酸酶并清除松散的卵丘细胞，使用口控移液装置将受精卵转移至新鲜的50 µL含BSA的M2培养基液滴中。随后，为消化胚胎的透明带并减少试剂递送过程中的额外物理障碍，将胚胎转移至60 mm培养皿中预热的100 µL酸性泰罗德液（AT溶液）液滴中。在体视显微镜下持续观察受精卵，直至透明带被腐蚀约30%，然后通过将胚胎依次穿过4滴50微升含BSA的M2培养液来稀释酸性泰罗德液（AT）。接着，在体视显微镜下计数，确定已处理的胚胎数量。通过将胚胎依次穿过2滴50微升低血清培养基，进一步稀释BSA。接下来，用口吸管将25至30个胚胎转移至含有10微升低血清培养基的液滴中，然后使用手持移液器加入10微升核糖核蛋白（RNP）复合物。通过反复吹打10次或直至混合物不再呈现黏稠状态，以稀释RNP复合物中的甘油并使样品均匀混合。随后，将20微升胚胎与RNP混合液转移至0.1厘米的电穿孔比色皿中，注意避免产生气泡。为将编辑试剂导入受精卵，采用方波电穿孔程序：30伏电压，4至6次脉冲，每次脉冲持续3毫秒，脉冲间隔100毫秒。 接下来，向比色杯顶部加入 50 微升 M2 加 BSA，以冲洗出比色杯中的胚胎，并轻轻吹打将此混合液转移至培养皿中。进行胚胎培养时，将 20 至 30 个受精卵转移至已预平衡的培养皿中含 KSOM 加 BSA 的液滴内，并将胚胎

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

通过受精卵的CRISPR电穿孔对小鼠进行高效基因组编辑

锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）等设计核酸酶可通过激活非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR）通路，对小鼠着床前胚胎的基因组进行修饰。这些技术进步使得能够快速生成具有精确遗传修饰的小鼠。...

利用设计核酸酶进行小鼠基因组编辑

小鼠卵母细胞的显微注射通常用于经典的转基因技术（即外源基因的随机整合）以及CRISPR介导的基因靶向。本实验方案综述了显微注射技术的最新进展，特别强调质量控制和基因分型策略。...

通过卵母细胞显微注射制备转基因小鼠

关键词：转基因小鼠，卵母细胞，显微注射，基因修饰，胚胎操作

成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR 相关蛋白 9（CRISPR/Cas9）系统为基因工程提供了有力工具，并实现了外源基因的靶向整合。本文描述了一种基于同源介导的末端连接（HMEJ）的高效DNA靶向整合策略 体内...

CRISPR/Cas9介导的靶向整合 体内 使用基于同源介导末端连接的策略

传统的利用基因敲除动物进行的基因功能缺失研究通常成本高昂且耗时。基于电穿孔的CRISPR介导体细胞突变技术是研究基因功能的强大工具。...

使用CRISPR介导的功能缺失分析研究小脑颗粒细胞 子宫内 基于电穿孔的基因转移

本文介绍了一种改良的一细胞胚胎冷冻保存方法，以及一种将冻融胚胎与电穿孔技术相结合的方案，用于高效制备基因修饰小鼠。...

利用冻融胚胎高效制备基因修饰小鼠

本实验方案描述了通过向受精卵显微注射CRISPR-Cas9系统和供体DNA，高效制备基因盒敲入和条件性敲除（floxed）小鼠的方法。...

通过受精卵显微注射在小鼠中构建基因盒敲入和Flox等位基因

本文介绍了一种利用胚胎干细胞构建基因修饰小鼠模型的实验方案，尤其适用于大片段DNA的基因敲入（KI）。该方案结合CRISPR/Cas9基因组编辑技术进行优化，与传统的依赖同源重组的线性化DNA靶向方法相比，显著提高了基因敲入效率。...

利用CRISPR/Cas9在胚胎干细胞中实现高效基因靶向以构建基因编辑小鼠模型

本方案描述了显微注射及 体内...

利用体细胞基因组编辑小鼠模型 体内 显微注射与电穿孔

本方案介绍了一种优化的遗传修饰大鼠模型制备方法。利用腺相关病毒（AAV）递送DNA修复模板，并通过电穿孔技术将CRISPR-Cas9试剂递送至2细胞期胚胎，以完成基因组编辑过程。...

利用腺相关病毒（AAV）和2细胞胚胎电穿孔技术对大鼠胚胎进行CRISPR-Cas9基因组编辑

基因组编辑改进效率 通过 输卵管核酸递送（I-GONAD）方法与传统显微注射技术相当，后者需要从供体雌性动物中收集受精卵，并将其移植到假孕雌性动物体内。本方案通过引入CRISPR/Cas9诱导的突变，证明了该方法的有效性 ROSA26...

基因组编辑技术的改进 通过 基于输卵管核酸递送的 在体 内 电穿孔技术用于基因敲除小鼠的制备

以RNA形式递送基因组编辑器是修饰原代哺乳动物细胞和细胞系基因组的一种特别有效的方法。本方案的目标是将基因组编辑器以mRNA形式递送至原代哺乳动物细胞和细胞系中，随后通过靶向Illumina测序与分析，定量编辑结果。...

通过电穿孔递送编辑器RNA在原代哺乳动物细胞中进行基因组编辑

学习CRISPR-EZ技术对小鼠受精卵进行高效基因组编辑的方法。该技术利用电穿孔将CRISPR核糖核蛋白复合物导入胚胎，实现接近100%的编辑效率，适用于基因功能研究和疾病模型构建。

通过CRISPR显微注射对小鼠受精卵进行高效基因组编辑

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