通过受精卵的CRISPR电穿孔对小鼠进行高效基因组编辑

这种方法可以检查胚胎中的引导RNA，测试早期发育问题或创建编辑小鼠。CRISPR Cas9的任何进展都可以用这种方法使用。这种方法的主要优点是易于学习，并且使用可用于接触小鼠的实验室的试剂。

将来，该技术将有助于纠正伴侣动物或农业重要动物后代的疾病或突变。此方法最适合生成鼠标模型。在我们的实验室中，我们一直在使用这种方法的变体来研究围绕受精和早期植入前发育的事件，特别是胚胎效力中的基因调控。

最具挑战性的部分是使用玻璃针将胚胎从一个盘子移动到另一个盘子。演示这个程序的将是Chantal Diallo，我实验室的研究专家。要开始胚胎收集和处理，请将安乐死的雌性小鼠放在其背上，并在腹部喷洒70%乙醇以手术打开。

要打开腹腔并移除输卵管，请用手术剪刀切割皮肤层并找到卵巢。接下来，通过手术切除位于卵巢近端的两个输卵管，并将它们放入单个 50 微升的 M2 加 BSA 培养基液滴中。在体视显微镜下，使用解剖钳切开输卵管的壶腹以释放含有卵母细胞的卵丘-卵母细胞复合物或COC，然后为避免携带碎片，转移并将每个卵丘-卵母细胞合并为单个50微升的M2液滴加BSA，手柄移液器设置为20至30微升。

接下来，为了从受精卵中去除卵丘细胞，将带有少量额外培养基的COC转移到100微升M2加透明质酸酶的液滴中，并通过移液轻轻混合，直到胚胎明显与更小的积云细胞分离。要稀释透明质酸酶并清除松散的积云细胞，请使用口服移液管将受精卵移动到新鲜的 50 微升 M2 加 BSA 液滴中。接下来，为了侵蚀胚胎的透明带并减少试剂递送的额外物理障碍，将胚胎转移到预热的 100 微升液滴中 酸性 Tyrode 或 AT 溶液，在 60 毫米板上。

在体视显微镜下连续观察受精卵，直到30%的透明带被侵蚀，然后稀释AT，将胚胎通过四个50微升的M2加BSA液滴。接下来，通过在体视显微镜下计数来确定已处理的适当数量的胚胎。通过将胚胎通过两滴50微升还原血清培养基来稀释BSA。

接下来，将25至30个胚胎移液到10微升的还原血清培养基液滴中，然后使用手持式移液管加入10微升核糖核蛋白或RNP复合物。从RNP复合物中稀释粘性甘油，并通过移液10次或直到混合物不再显示粘度来均质化样品。接下来，将 20 微升胚胎和 RNP 混合物移液到 0.1 厘米的电穿孔比色皿中，同时避免气泡，然后将编辑试剂递送到受精卵中，使用 30 伏、4 至 6 个脉冲、3 毫秒脉冲长度和 100 个脉冲间隔的方波方案电穿孔胚胎。

接下来，将 50 微升 M2 加 BSA 加入比色皿顶部，从比色皿中冲洗胚胎，然后将该混合物轻轻移液到盘子上。对于胚胎培养，将20至30个受精卵转移到预平衡培养板中的KSOM加BSA液滴中，并将胚胎移动到液滴中。将板在 37 摄氏度下在 5% 二氧化碳和 95% 湿度中孵育过夜。

第二天，仅将双细胞胚胎转移到KSOM加BSA混合物的新鲜液滴中，并将板返回培养箱。留下或丢弃死亡或未受精的胚胎。在基因分型之前，用两滴DPBS洗涤桑葚囊胚胚胎，以稀释可能干扰PCR反应的培养基成分。

使用口移液管，将单个胚胎转移到8孔PCR条的一个孔中，并加入10微升裂解缓冲液。接下来，为了裂解胚胎，将热循环仪编程为55摄氏度4小时，然后在95摄氏度下孵育10分钟使蛋白酶K失活。在这项研究中，展示了一种靶向小鼠酪氨酸酶位点作为阳性对照的示例策略，包括寡核苷酸设计和非同源末端连接和同源定向修复的基因分型策略。

当递送单个单向导或sgRNA时，C57黑色6J和C57黑6N小鼠品系中RNP的递送率高达100%，插入缺失形成率为50%至100%，基于寡核苷酸的小替换率为17%至63%当工程基因组缺失时，编辑效果从3%到100%不等胚胎应保持在尽可能接近理想条件，以便越快协议完成了，越好。此外，尽量减少接触透明质酸酶和酸性泰罗德。该方法描述了生成编辑过的动物，测试植入或妊娠活力，或多次执行实验以在种植前开发期间收集测量值或图像以及各种指标。