一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合检测方法用于评估抗癌适配体的选择性与特异性

本方案将帮助初次接触适配体的研究人员在项目中使用适配体，并理解完成该方案所需的各个具体步骤。适配体具有高度多功能性，本方案展示了其在免疫表型分析实验中的简便性和易用性。适配体可用于诊断和治疗应用。

本方案是验证其特异性和灵敏度的初步步骤。尽管本实验具体展示了对一种细胞表面受体的染色，适配体可非常容易地用于多参数流式细胞术，从而提供高水平的表型信息。使用适配体时的关键环节包括：确保其在使用前正确折叠，以及缓冲液和离子强度条件应与筛选时保持一致。

收集并弃去培养瓶中的培养基后，加入三毫升磷酸盐缓冲液（PBS），使其覆盖细胞。每瓶加入一毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度孵育5至10分钟，并在显微镜下观察细胞脱落情况。随后，向细胞中加入一毫升完全培养基，吹打细胞上下混匀，制成单细胞悬液。

将细胞移入适当的离心管中，在200 G条件下离心5分钟。弃去上清液后，用1毫升新鲜培养基重悬细胞，并通过台盼蓝染色法计数细胞：取一定体积的细胞悬液与台盼蓝混合稀释。取约15微升混合液滴加至血细胞计数板与盖玻片之间，进行细胞计数。

收集所需数量的细胞，确保每个测试样品含有十万个细胞。随后将细胞在37摄氏度下孵育两小时，以使酶解脱离后目标蛋白在细胞膜上的稳定性得以恢复。孵育两小时后，在500 ×g 下离心五分钟。

弃去上清液后，将细胞重悬于500微升封闭缓冲液中。将细胞在4摄氏度孵育30分钟，期间进行间歇性混匀。在30分钟孵育过程中，通过制备比文中所述浓度高一倍的适配体来进行适配体折叠。

然后根据所需的折叠条件，将适配体与PCR仪混合并孵育，同时确保避免适配体暴露于光照。孵育30分钟后，按照之前的方法离心细胞并弃去上清液。随后加入1毫升洗涤缓冲液，再次离心细胞。

去除上清液后，将细胞重悬于适量的结合缓冲液中。接着，用移液器将50微升重悬细胞加入预冷的96孔黑色板的每个孔中。然后，向每50微升细胞悬液中加入50微升适配体溶液，混匀后于4°C避光孵育30分钟。

离心并去除上清液后，用洗涤缓冲液小心重悬沉淀，再以500 ×g离心5分钟。随后在100 µL洗涤缓冲液中重悬，用于流式细胞术分析，并重复洗涤步骤两次。首先打开流式细胞仪，然后启动计算机。

接下来，打开流式细胞仪分析软件，登录程序，然后在细胞仪选项卡下运行流体启动。要创建新实验，请在实验选项卡下点击新建文件夹，并将文件夹或实验正确命名。单击新文件夹以将其选中。

然后再次在“实验”选项卡下，点击“新建实验”，并为实验命名。要添加第一个样本/标本，请在“实验”选项卡下点击“新建标本”，并为标本正确命名。要添加管状样本，请先选中该标本，然后在“实验”选项卡下点击“新建管”。

然后加入相应数量的试管并命名。为准备所需的图表，在工作表标签下打开一个新的工作表。新工作表窗口弹出后，绘制侧向散射（side scatter）对前向散射（forward scatter）的点印迹图，以选择目标细胞群。

制备前向散射高度与前向散射面积的点印迹图，以选择单细胞群体。接着，绘制事件数量相对于目标荧光染料的直方图。在开始流式细胞术之前，确保已打开用于控制样本采集的采集仪表板、检查器和细胞仪，以调整电压参数，并确保包含所有图表的工作表已打开。

首先，运行未经处理的细胞。确保指向试管的箭头为绿色。如果该箭头不是绿色，请点击箭头使其变为绿色。

使用移液器将每个样品从96孔黑色板转移至流式细胞术管中。在采集仪表板上，选择要记录的适当事件数，将流速调至低速，然后点击“采集数据”。调节FSC和SSC参数的电压，确保细胞群集中在点图中央，并且无细胞接触图形的任一轴线，以避免丢失目标细胞。

通过在前向散射和侧向散射密度图中识别并选择目标细胞群来定义第一个门，同时排除碎片，碎片通常表现为前向散射信号最低的群体。通过排除双联细胞群体来定义第二个门，因为双联细胞会显著影响实验结果与结论。将采集速度提高至中速或高速，以加快样本分析速度，但每秒采集事件数不应超过200至300个。

然后点击记录数据。在调节电压、设置门控并记录数据后，取出样本，点击下一个样本管。插入下一个样本，并对所有对照样本和测试样本重复记录数据的操作。

所有数据收集完毕后，使用流式细胞仪依次运行三管50%次氯酸钠溶液、FACSRinse和超纯水进行清洗，每种溶液均以高流速运行五分钟。然后从细胞仪的下拉菜单中点击“流路关闭”。将结果导出为fsc文件至U盘以进行传输。

使用分析软件进行分析：按下新建按钮以创建新的文档和窗口来处理分析，然后将样本文件拖入新窗口中。双击打开未染色样本。为圈选单细胞群体，选择P1群体并双击P1群体以生成FSC-H versus FSC-A图。

双击已圈选的单细胞，以生成针对所用荧光染料的事件直方图。在原始窗口中选择 P1 和单细胞，并将其拖拽至所有样本中，使所有样本均包含相同的圈选设置。接下来，单击布局编辑器按钮以打开布局窗口，并将两个样本相互叠加，以创建叠加直方图。

在EpCAM阳性的MDA-MB-231细胞中，叠加代表经TEPP和TENN处理的细胞的直方图显示，与TENN处理的细胞相比，TEPP处理的细胞向右偏移，表明TEPP适配体与目标蛋白发生了结合。在阴性对照实验中，HEK 293T细胞的TEPP与TENN处理组直方图叠加后未显示任何偏移，说明在表达EpCAM的细胞中，TEPP是与受体结合的EpCAM适配体。此外，在EpCAM阴性细胞中未观察到结合信号，进一步证实了所开发适配体的选择性和特异性。

确保适配体避光保存，将适配体与细胞在培养板中混合，并在流式细胞仪上设置正确的电压。这在很大程度上取决于适配体的后续应用。例如，我们的研究重点是药物递送。

因此，我们的下一步将是利用荧光显微镜评估适配体是否被细胞内化。本实验方案展示了适配体在免疫表型分析实验中替代单克隆和多克隆抗体的简便性。