一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合测定，用于评估抗癌适配体的选择性和特异性
September 13th, 2022
抗癌适配体开发的必要步骤是测试其与靶标的结合。我们展示了一种基于流式细胞术的测定来研究这种结合，强调了包括阴性对照适配体和对该特定蛋白质呈阳性或阴性的癌细胞的重要性。
该协议将帮助刚接触适配体的研究人员能够在他们的项目中使用它们，并了解完成协议所需的各个小步骤。核酸适配体用途广泛，该协议证明了它们在免疫表型测定中的简单性和简单性。适配体可用于诊断和治疗应用。
该协议是为确认其特异性和敏感性而采取的第一步。虽然这种特殊的测定表明了一个细胞表面受体的染色，但核酸适配体可以很容易地用于多参数流式细胞术，提供高水平的表型知识。使用核酸适配体的重要方面是确保它们在使用前正确折叠，以及缓冲液和离子强度条件与选择时相同。
收集并丢弃烧瓶中的培养基后，加入三毫升PBS并将其铺在细胞上。向每个烧瓶中加入一毫升0.25%的胰蛋白酶-EDTA后，在37摄氏度下孵育5至10分钟，并在显微镜下观察细胞的分离。接下来，向细胞中加入一毫升完全培养基，并上下移液细胞以制成单细胞悬液。
将细胞移液到适当的管中，并以200 G离心五分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于一毫升新鲜培养基中，并通过用台盼蓝稀释一定体积的细胞悬液，使用台盼蓝染色来计数细胞。在血细胞计数器和盖玻片之间分配约15微升混合物以计数细胞。
收集所需数量的细胞，确保每个测试样品有十万个细胞。然后将细胞在37摄氏度下孵育两个小时，以使酶分离后细胞膜上感兴趣的蛋白质稳定。孵育两个小时后，将细胞以500 G离心五分钟。
弃去上清液后，将细胞重悬于500微升封闭缓冲液中。将细胞在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，间歇混合。在这30分钟的孵育过程中，通过制备手稿中描述的两倍浓度的适配体来进行适配体折叠。
然后根据所需的折叠条件将核酸适配体与热循环仪混合并孵育，同时确保保护核酸适配体免受光照。孵育30分钟后，如前所述离心细胞并除去上清液。然后加入一毫升洗涤缓冲液并再次离心细胞。
除去上清液后，将细胞重悬于适当体积的结合缓冲液中。接下来，将50微升重悬的细胞移液到冰冷的96孔黑板的每个孔中。然后将50微升适配体移液到50微升体积的细胞上，混合并在4摄氏度的黑暗中孵育30分钟。
离心并除去上清液后，小心地将沉淀重悬于洗涤缓冲液中，然后再次以500G离心五分钟。然后重悬于100微升洗涤缓冲液中进行流式细胞术分析，同时重复洗涤步骤两次。首先，打开流式细胞仪，然后打开计算机。
接下来，打开流式细胞术分析软件，登录程序，然后在细胞仪选项卡下运行流体启动。若要创建新实验，请在"实验"选项卡下，单击"新建文件夹"，然后将文件夹命名为斜杠实验。单击新文件夹以突出显示它。
然后再次在实验标签下，点击新建实验并相应地命名实验。要添加第一个示例斜杠样本，请在试验选项卡下单击新样本并相应地命名样本。要添加试管样品，请突出显示该试样，然后在实验选项卡下单击新建试管。
然后添加适当数量的管子和名称。若要准备所需的图形，请在工作表选项卡下打开一个新工作表。弹出新的工作表窗口后，准备侧向散射与前向散射的点印迹图以选择感兴趣的总体。
准备前向散射高度与前向散射区域的点印迹图，以选择单细胞群。接下来，准备针对目标荧光团的事件数的直方图。在开始流式细胞术之前，确保用于控制样品采集的采集仪表板、用于调整电压参数的检测器和细胞仪以及包含所有图表的工作表处于打开状态。
首先，运行未处理的细胞。确保指向管子的箭头是绿色的。如果此箭头不是绿色的，请单击箭头使其变为绿色。
使用移液器，将每个样品从96孔黑板转移到流式细胞术管中。在采集仪表板上，选择要记录的适当数量的事件，将流速更改为低，然后单击采集数据。调整FSC和SCC参数的电压，确保细胞群集中在点图中，并且没有细胞接触图形的任一轴，以避免丢失感兴趣的细胞。
通过在前向和侧向散射密度图中识别和选择感兴趣的种群来定义第一个门，同时排除碎片，碎片构成了具有最低前向散射信号的种群。通过排除双峰细胞群来定义第二个门，因为双峰细胞会显着影响结果和结论。将采集速度提高到中或高以更快地分析样品，但不要超过每秒 200 到 300 个事件。
然后单击"记录数据"。调整电压和门控并记录数据后，取出样品并单击下一个管。插入下一个样品并重复所有对照和测试样品的记录数据。
收集完所有数据后，通过运行三管 50% 漂白剂、FACSRinse 和超纯水来洗涤流式细胞仪，每管以高流速洗涤 5 分钟。然后从细胞仪下拉菜单中，单击流控系统关闭。将结果作为 fsc 文件导出到 USB 驱动器进行传输。
使用分析软件分析它们，方法是按新建按钮创建一个新文档和窗口来处理分析，然后将示例文件拖到新窗口中。双击以打开未染色的样品。要门控单细胞群，请选择 P1 群体并双击 P1 群体以创建 FSCH 与 FSCA 图。
双击门控单细胞以针对使用的荧光染料创建事件的直方图。在原始窗口中，选择 P1 和单个单元格并将它们拖到所有样本中，以便所有样本现在都包含相同的门控。接下来，单击布局编辑器按钮打开布局窗口，然后将两个样本相互拖动以创建叠加直方图。
在EpCAM阳性MDA-MB-231细胞中，叠加代表用TEPP和TENN处理的细胞的直方图显示TEPP处理的细胞向右移动，而TENN处理的细胞表明TEPP适配体与目标蛋白质的结合发生。在阴性对照中，覆盖TEPP和TENN直方图的HEK 293T细胞没有反映任何偏移，表明在表达EpCAM的细胞中，TEPP是附着在其受体上的EpCAM适配体。此外，在EpCAM阴性细胞中未观察到结合，这证实了开发的适体的选择性和特异性。
确保核酸适配体避光，将核酸适配体和细胞混合在平板上，并在流式细胞仪上设置正确的电压。这在很大程度上取决于核酸适配体的未来应用。例如，我们专注于药物输送。
因此，我们的下一步将是使用荧光显微镜评估适配体是否内化。该协议已经证明了核酸适配体在免疫表型测定中取代单克隆和多克隆抗体是多么容易。
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概述
本协议协助研究人员利用适配体进行免疫表型分析，突出其在诊断和治疗应用中的多功能性。它强调通过基于流式细胞术的检测来确认适配体特异性和灵敏度的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 免疫学
背景
- 适配体是能够与特定靶标结合的核酸分子。
- 它们在各种应用中使用，包括诊断和治疗。
- 理解适配体结合对于其有效使用至关重要。
- 本协议专注于适配体与癌细胞表面受体的结合。
研究目的
- 展示用于测试适配体结合的流式细胞术检测。
- 强调在实验中包含负控的必要性。
- 为适配体技术新手提供清晰的协议。
使用的方法
- 流式细胞术评估适配体与目标蛋白的结合。
- 包含负控适配体。
- 使用表达或不表达目标蛋白的癌细胞。
- 在特定缓冲液和离子强度条件下制备适配体。
主要结果
- 该检测有效展示了适配体与癌细胞受体的结合。
- 包含控制对于准确解释结果至关重要。
- 适配体可以适用于多参数流式细胞术。
- 适配体的正确折叠和准备对于成功的检测至关重要。
结论
- 本协议为在研究中使用适配体提供了基础方法。
- 它强调了适配体应用中特异性和灵敏度的重要性。
- 未来的研究可以扩展这一方法用于更广泛的免疫表型分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficiently confirming the selectivity and specificity of anticancer aptamers is critical for early-stage target validation and de-risking in oncology drug discovery. Flow cytometry-based binding assays provide quantitative, reproducible evidence of aptamer-target interactions, supporting confident advancement decisions. This workflow enables rapid triage of aptamer candidates and informs portfolio prioritization for targeted drug delivery strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of aptamer binding to disease-relevant cell surface proteins.
- Supports functional validation of target engagement in live cell systems.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific from non-specific interactions.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions for lead advancement.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible binding readouts suitable for high-throughput workflows.
- Establishes robust negative and positive controls for assay reliability.
- Enables rapid comparison of multiple aptamer candidates under identical conditions.
- Supports platform scalability for broader immunophenotyping applications.
Translational & Preclinical Research
- Aligns aptamer binding profiles with disease-relevant cell models expressing target proteins.
- Provides continuity from in vitro binding validation to downstream functional studies.
- Reduces translational risk by confirming specificity prior to in vivo evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This flow cytometry-based assay fits at the interface of target validation and lead identification, bridging SELEX-derived aptamer selection with preclinical candidate triage.
- Discovery Biology: Confirms target engagement and specificity in live cell systems.
- Screening: Provides quantitative, reproducible binding data for candidate ranking.
- Analytics: Generates overlay histograms and gating strategies to compare binding across cell types and controls.
- Translational Research: Aligns in vitro binding with disease-relevant expression patterns for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other aptamer-target pairs, supporting platform expansion.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in aptamer-target specificity and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes binding assessment for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions, optimizing resource allocation and reducing late-stage risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of aptamer candidates for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry operation and data analysis.
- Demands access to calibrated flow cytometers and compatible analysis software.
- Necessitates rigorous standardization of buffers, aptamer folding, and gating strategies across teams.
- Adaptable to various cell lines and aptamer sequences with appropriate controls.
- Dependent on maintaining aptamer integrity and consistent assay conditions for reliable results.
