Name: 一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合测定，用于评估抗癌适配体的选择性和特异性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 了解基于流式细胞术的适配体结合测定方法，用于评估抗癌适配体对癌细胞表面受体的选择性和特异性。该方法适用于免疫表型分析和诊断治疗研究。

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作者感谢精神与身体健康及临床转化研究所（IMPACT）的SEED基金资助， &#34;阿尔弗雷德·迪金博士后研究奖学金&#34; 迪肯大学的项目，以及 &#34;澳大利亚政府研究培训计划奖学金&#34;.&#160;

注意：实验开始前，请穿戴个人防护装备，包括实验服、手套和护目镜。有关本实验方案中所用材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 实验所需缓冲液
<ol>
	<li>在实验当天新鲜配制本实验所需的缓冲液——用于适配体折叠的SELEX缓冲液、封闭缓冲液（BB）、洗涤缓冲液（WB）和结合缓冲液（BiB）（表1），并将它们置于冰上或4 °C保存。 
	注意：每种适配体都需要特定的折叠条件，包括SELEX缓冲液组成及折叠温度条件。应仔细参照最初描述该适配体的原始文献中的方法进行完全复现10。本实验中，所有缓冲液均使用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）配制。每次实验所需缓冲液的体积取决于所测试的细胞系数量、重复次数以及适配体浓度的数量。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td colspan="2">成分</td>
			<td rowspan="2">所需体积</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>项目</td>
			<td>浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SELEX 缓冲液</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>每样本 50 µL + 10% 移液误差</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">封闭缓冲液</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td rowspan="4">每细胞系 500 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA a</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA b</td>
			<td>0.1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS c</td>
			<td>10% (v/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>洗涤缓冲液</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>第一次洗涤 1 mL + 每测试样本 100 µL + 10% 移液误差</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">结合缓冲液</td>
			<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td rowspan="4">每样本 50 µL + 10% 移液误差</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>20% (v/v)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：结合实验所需的缓冲液。aBovine Serum Albumin，bTransfer Ribonucleic Acid，cFetal Bovine Serum。
2. 适配体的制备
注意：本实验中使用的适配体带有荧光报告分子，因此应避免光照以防止降解。
<ol>
	<li>实验前，使用无热原且无RNase的超纯水配制100 µM的待测及对照适配体储备液（储备液A）（图1）。 
	注意：为长期保存，储备液A应置于-20 °C冰箱中冷冻保存。</li>
	<li>使用SELEX缓冲液稀释储备液A，配制用于实验的适配体工作浓度溶液（储备液B）（Table 1）。按照本方案，将储备液A稀释至1,000 nM以制备储备液B（图1）。</li>
	<li>为使适配体具备形成三维（3D）结构的条件，在250 µL离心管中，用SELEX缓冲液稀释储备液B，以配制折叠所需的适配体体积和浓度。 
	注意：折叠后的适配体将与等体积的细胞混合。因此，用于折叠的适配体浓度应为所需最终浓度的2倍。使用公式（1）计算所需的体积和浓度。请记得额外增加10%的体积以补偿移液误差。 
	Concentrationstock A × Volumestock A = Concentrationstock B × Volumestock B  (1)</li>
</ol>
<img alt="适配体（Aptamer）制备流程示意图：冻干适配体、SELEX缓冲液、PCR仪、储备液。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64304/64304fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：适配体制备步骤示意图。 1储备液1在-20 °C下长期保存。2工作浓度用SELEX缓冲液配制，不保存。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64304/64304fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
3. 癌细胞的培养与维持
注意：在研究开始之前，需确保细胞处于早期传代次数，具有典型的形态学特征，且无支原体污染。为了检测适配体的选择性和特异性，理想情况下需要使用目标蛋白高表达、中等表达以及低表达或不表达的细胞系。
<ol>
	<li>在T75培养瓶中接种细胞，并使用适当的培养条件。将细胞置于含5% CO2的湿润化培养箱中，于37 °C条件下培养。 
	注意：本研究中使用的是添加了10%胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（即完全培养基）。</li>
	<li>当细胞融合度达到约80%时，将其传代至含有新鲜完全培养基的新培养瓶中。 
	注意：根据目标蛋白和细胞系的不同，80%融合度可能为结合实验提供适宜的细胞数量。在本实验所用的MDA-MB-231和HEK 293T细胞系中，80%融合度是合适的。此时可进入第4部分，即结合实验。务必使用针对目标蛋白的单克隆抗体（mAbs）检测该蛋白的表达情况。</li>
</ol>
4. 结合实验
注意：图2 总结了在贴壁细胞中进行结合实验所需的步骤。
<ol>
	<li>在 II 级生物安全柜中，按以下步骤收集每个培养瓶中的细胞：
	<ol>
		<li>收集并弃去培养瓶中的培养基，加入 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），使其覆盖细胞，然后收集并弃去 PBS。重复此步骤两次，以彻底去除可能使胰蛋白酶失活的培养基残留。每个培养瓶中加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶/EDTA，于 37 oC 培养 5–10 分钟。在显微镜下观察细胞脱落情况。</li>
		<li>向细胞中加入 1 mL 完全培养基，反复吹打使细胞充分悬浮，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至适当的离心管中，于 200 × g 离心 5 分钟。 
		注：对于非贴壁细胞，直接将细胞收集至离心管中，于 200 × g 离心 5 分钟，然后进行步骤 4.1.3。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL 新鲜培养基中。使用台盼蓝染色法计数细胞：取一定体积的细胞悬液与台盼蓝混合稀释。取约 15 µL 混合液滴加至血细胞计数板与盖玻片之间。按照先前描述的方法18，使用公式（2）进行细胞计数： 
		<img alt="细胞浓度公式，用于计算每毫升总细胞数的显微镜细胞计数公式。" src="/files/ftp_upload/64304/64304eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="公式 1"> （2） 
		注：应使用尽可能少的细胞悬液体积，并记录稀释倍数。例如，等体积的细胞悬液与 0.04% 台盼蓝混合，稀释倍数为 2。在继续实验前，确保细胞活力较高（活细胞数/总细胞数 × 100），大多数贴壁细胞系的活力应约为 90%。死细胞会非特异性地结合适配体，从而影响实验结果19。也可采用其他细胞计数方法，例如使用自动细胞计数仪。</li>
		<li>收集所需数量的细胞，确保每个测试样品含有 10 × 104 个细胞。额外预留 10% 体积以补偿移液误差。 
		注：在不同实验及重复样本之间，必须始终保持细胞数量一致。</li>
		<li>将细胞于 37 °C 培养 2 小时，以使酶消化后目标蛋白在细胞膜上的表达趋于稳定。 
		注：该孵育时间可能因目标蛋白的不同而有所调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在上述 2 小时孵育期间：
	<ol>
		<li>将离心机温度预设为 4 °C。将 tRNA 和适配体储备液置于室温或冰上解冻。为保护荧光报告分子，需避免适配体管暴露于光照下。 
		注：tRNA 的作用是封闭核酸结合位点。</li>
		<li>配制 SELEX 缓冲液、BB、WB 和 BiB（见第 1 节），并将所有缓冲液置于冰上或 4 °C 保存。将热循环仪设置为空白运行循环。将 96 孔黑色板和流式细胞术管置于冰上。 
		注：将热循环仪设置为空白运行循环，可预热和预冷系统，有助于获得更可重复的实验结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成 2 小时孵育后，于 500 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 500 µL BB 中。于 4 °C 孵育 30 分钟，期间间歇性混匀。</li>
	<li>在上述 30 分钟孵育期间，进行适配体折叠操作，步骤如下：
	<ol>
		<li>配制适配体的 2 倍浓度溶液（见第 2 节），然后将适配体混合并在热循环仪中按照所需的折叠条件进行孵育。对于该 EpCAM 适配体，采用以下折叠程序：95 °C 孵育 5 分钟，随后 22 °C 孵育 10 分钟，再 37 °C 孵育 15 分钟。 
		注：每次实验均需设置阴性对照（即不含适配体的 SELEX 缓冲液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成 30 分钟孵育后，将细胞于 500 × g、4 °C 离心 5 分钟，弃去上清液，加入 1 mL WB，再次离心（500 × g，5 分钟，4 °C）。弃去上清液，将细胞重悬于适量体积的 BiB 中。</li>
	<li>将 50 µL 重悬的细胞加入预冷的 96 孔黑色板的每个孔中。将细胞保持在冰上，以抑制目标蛋白的内化。</li>
	<li>向每孔含 50 µL 细胞的体系中加入 50 µL 适配体溶液，混匀后于 4 °C 避光孵育 30 分钟。将 96 孔板于 500 × g、4 °C 离心 5 分钟，小心弃去上清液。</li>
	<li>小心地将沉淀用 WB 重悬，并于 500 × g 离心 5 分钟。重复洗涤步骤（4.7）两次，最后将细胞重悬于 100 µL WB 中，用于流式细胞术分析。 
	注：适配体与细胞相互作用示意图参见 图 3。</li>
</ol>
<img alt="SELEX 的细胞与适配体准备流程图；包括离心和热循环步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64304/64304fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：适配体-蛋白质结合实验操作步骤示意图。 缩写：SELEX = 指数富集配体系统进化；BB = 封闭缓冲液；WB = 洗涤缓冲液；BiB = 结合缓冲液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64304/64304fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="EpCAM 适配体结合示意图；显示特异性适配体与对照适配体与 EpCAM+/- 细胞的相互作用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64304/64304fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 3"> 
图3：展示进行适配体结合实验所需的不同类型细胞和适配体的示意图。缩写：EpCAM = 上皮细胞黏附分子。本图使用 Biorender.com 制作。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64304/64304fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
5. 流式细胞术与数据分析
注意：在开启流式细胞仪之前，确保关机溶液、清洗溶液和鞘液（0.9% NaCl）的膜过滤器单元中无“气泡”。如果滤膜单元中有气泡，需将气泡排出。确保废液容器为空，并且鞘液、水以及超纯水中含1%次氯酸钠的容器均已加满。
<ol>
	<li>打开流式细胞仪，然后开启计算机。 
	注意：此处介绍的流式细胞仪操作细节仅适用于视频中演示的仪器和软件（参见材料表）。使用其他软件需接受相应培训。</li>
	<li>打开流式细胞分析软件，登录程序，在细胞仪选项卡下运行流体系统启动。</li>
	<li>要创建新实验，在实验选项卡下点击新建文件夹，并为该文件夹/实验命名。</li>
	<li>点击新建文件夹以选中，再次在实验选项卡下点击新建实验，并为实验适当命名。</li>
	<li>要添加第一个样本/标本，在实验选项卡下点击新建标本，并为该标本正确命名（如细胞系名称/对照样本/实验样本）。</li>
	<li>要添加试管样本，先选中标本（组），然后在实验选项卡下点击新建试管。添加适当数量的试管并命名。</li>
	<li>为准备所需图表，在工作表选项卡下打开一个新工作表。当新工作表窗口弹出后，使用工作表界面打开以下内容（将鼠标悬停在图标/图片上可查看名称）：
	<ol>
		<li>绘制前向散射（FSC）与侧向散射（SCC）的点图，以选择目标细胞群。通过在前向散射与侧向散射密度图中识别并选择目标细胞群（P1），定义第一个门控。排除碎片，即前向散射信号最低的细胞群。 
		注意：FSC参数根据细胞大小检测细胞或事件，而SCC则根据其颗粒度进行区分20。</li>
		<li>绘制FSC-面积（FSC-A）与FSC-高度（FSC-H）的点图，以选择单细胞群体。通过排除双联体细胞群来定义第二个门控，因为双联体会显著影响结果和结论。使用FSC-H与FSC-A密度图排除双联体：相同大小的细胞具有相似的面积和高度，因此单细胞沿对角线聚集，并与双联体分离。 
		注意：FSC大致与细胞大小成正比。电压脉冲定义为FSC-H（信号强度）、反映细胞大小和信号持续时间的FSC-宽度，以及FSC-A（H × W）。双联体具有双倍的宽度和面积值，因此单细胞门控基于检测由双联体引起的H、W和A之间的比例失衡。</li>
		<li>绘制事件数量对目标荧光染料的直方图。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>开始流式细胞分析前，确保已打开用于控制样本采集的采集仪表盘、检查器和细胞仪电压参数调节界面，以及包含所有图表的工作表。 
	注意：进行分析至少需要100 µL含10 × 104个细胞的细胞悬液置于流式细胞管中。特别是在细胞活力较低的情况下，可进行碘化丙啶染色以选择活细胞群体21,22。</li>
	<li>运行第一个样本时，在屏幕左侧确保指向试管的箭头为绿色。若箭头非绿色，请点击箭头使其变为绿色。</li>
	<li>使用移液器将每个样本从96孔黑色板转移至流式细胞管中。以低速运行未经处理且未染色的对照样本。</li>
	<li>在采集仪表盘上选择要记录的适当事件数（30,000），将流速改为低速，然后点击采集数据。</li>
	<li>调节FSC和SCC参数的电压。确保细胞群在点图中居中，且无细胞接触图表任一轴线，以避免丢失目标细胞。</li>
	<li>将采集速度提高至中速或高速以加快样本分析，但不得超过200事件/秒。然后点击记录数据。</li>
	<li>对P1（图4A）和单细胞群（图4B）进行门控。构建事件数对所用荧光染料的直方图，并根据数据选择P1（本例中为别藻蓝蛋白（APC)）（图4C）。</li>
	<li>调整电压、完成门控并记录数据后，取出样本并点击下一试管。</li>
	<li>插入下一个样本，并重复记录所有对照和测试样本的数据（图3）。</li>
	<li>所有数据收集完毕后，用高流速依次运行三管50%次氯酸钠溶液、FACS冲洗液和超纯水，每管冲洗5分钟，以清洗流式细胞仪。</li>
	<li>然后，从细胞仪下拉菜单中点击流体系统关闭。</li>
	<li>在关闭软件、关闭仪器和计算机之前，将结果导出为.fcs文件至U盘以便传输和分析，步骤如下：
	<ol>
		<li>在分析软件中按下新建按钮，创建一个新文档和窗口用于数据分析。将样本文件拖入新窗口。</li>
		<li>双击打开未染色样本。选择P1细胞群，双击P1细胞群以生成FSC-H与FSC-A图，并对单细胞群进行门控。</li>
		<li>双击已门控的单细胞以生成事件数对所用荧光染料的直方图。</li>
		<li>在原始窗口中选择P1和单细胞，并将它们拖动至所有样本，使所有样本均应用相同的门控设置。</li>
		<li>点击布局编辑器按钮以打开布局窗口。将两个样本（对照和测试）相互叠加，生成叠加直方图。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

开发新适体（aptamer）面临的主要挑战在于缺乏适用于该过程各个步骤的标准化指南。McKeague 等人最近揭示了其中一些相关难题，这些问题导致在发表文献中数据呈现不清晰，并难以重复相关研究。他们提出了在表征适体时必须考虑的基本指南19。适体结合实验是筛选和/或表征适体的关键步骤23，该方法被该领域研究人员广泛使用。由于目前尚无单一指南用于展示逐步操作流程，本视频方案中演示了一种常用于研究适体-蛋白质结合的流式细胞术方法。
有多种方法可用于检测适配体与其靶标之间的相互作用，流式细胞术便是其中之一。其他方法包括荧光偏振、表面等离子共振、毛细管电泳和等温滴定 calorimetry24。选择合适的方法取决于适配体的具体应用。然而，需要注意的是，每种方法都有其局限性，联合使用多种检测手段更有利于小分子适配体的表征24。本文所述方法具有多项优势，是目前最可靠、精确且准确的方法之一，同时兼具快速和成本...

癌症仍然是全球主要的死亡原因之一1。尽管近几十年来癌症治疗取得了显著进展，抗癌药物的研发仍是一个备受争议的话题。这是因为化疗作为癌症治疗的主要手段，常伴随严重的副作用，限制了患者对治疗的依从性。此外，化疗诱导的肿瘤耐药性也限制了其作为唯一医疗干预手段的应用。单克隆抗体（mAbs）的应用提高了癌症治疗的应答效果2。使用mAbs的初衷是提高化疗药物的疗效并最小化其不良反应。然而，mAbs的使用也面临挑战，不仅因其可能引发免疫反应，还由于其依赖动物生产、成本高昂以及储存条件苛刻3。20世纪90年代适配体（aptamers）的引入为癌症治疗带来了新的希望，因为适配体的应用有望解决与mAbs相关的一系列难题4。
适配体是一类为特定靶标专门设计的短链核酸序列。配体的系统性指数富集（SELEX）是适配体开发中常用的方法。在SELEX过程中，将目标蛋白与含有随机核苷酸序列的文库共同孵育，通过一系列迭代循环，筛选出针对该蛋白的特异性适配体。适配体在靶标选择性和特异性方面与单克隆抗体（mAbs）相似，因此在药物研发领域展现出广阔的应用前景。针对癌症生物标志物的适配体可作为单一药物或癌症诊断工具使用5,6,7。由于其纳米级结构，这些适配体还可作为药物载体，将细胞毒性药物特异性地递送至肿瘤组织8，从而提高靶向给药的疗效，并减少化疗相关的脱靶不良反应。此外，这类纳米药物具有较高的组织穿透能力，使其成为深部肿瘤药物递送与治疗的理想候选。适配体还可被设计用于靶向血脑屏障（BBB）上表达的转运蛋白，以改善向脑部肿瘤的药物递送9。其中一类典型代表是双功能适配体，其可靶向转铁蛋白受体（TfR）10，促进药物穿越血脑屏障，并将细胞毒性药物有效载荷递送至肿瘤细胞11。
尽管适配体具有诸多优势，但该领域的药物开发尚未成功推出上市的抗癌药物。其中一个原因可能是缺乏全球研究人员可遵循的标准且可重复的方法。本文展示了一种适配体与细胞表面表达的天然蛋白结合的逐步操作方案。该方案是抗癌适配体临床前评估的先决步骤。本实验用于验证从SELEX筛选获得或已发表的适配体序列在纯化后是否具备选择性和特异性。该基于流式细胞术的检测方法快速、可靠且灵敏，能够准确显示适配体的选择性和特异性，其中适配体被用于检测细胞表面的蛋白质12,13,14。本文以针对EpCAM的特异性适配体结合为例，演示了该方法15。EpCAM作为一种跨膜糖蛋白，在肿瘤细胞信号传导、进展、迁移和转移过程中发挥重要作用16,17。为验证该适配体的选择性和特异性，实验中使用了EpCAM阳性与阴性的癌细胞。此前开发的EpCAM特异性适配体TEPP（5′-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′）和阴性对照适配体TENN（5′-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3′）分别作为结合与非结合EpCAM的适配体10。TEPP和TENN的3'端均标记了TYE665荧光染料。
TEPP 是一种双功能适配体，其一端靶向 EpCAM，另一端靶向 TfR。这使得 TEPP 成为向 EpCAM+ 脑肿瘤递送药物的合适候选分子。TEPP 通过其靶向 TfR 的一端穿越血脑屏障，再通过靶向 EpCAM 的一端识别肿瘤，并将所携带的货物（例如细胞毒性药物）递送至肿瘤组织。TENN 与 TEPP 具有相似的长度和二维结构，但对 EpCAM 或 TfR 均无结合亲和力，因此可作为合适的阴性对照适配体。本文展示了利用 TEPP 和 TENN 通过流式细胞术检测适配体与靶蛋白结合能力的方法。该实验方案适用于细胞特异性适配体的开发，也适用于对文献中已报道的适配体序列进行进一步的补充和验证分析。对于适配体研究领域的新手，若计划在研发（R&amp;#38;D）工作中使用已发表的适配体，本方案同样具有参考价值。本文研究了文献中报道的两个适配体序列。

<table><tbody><tr><td>带盖的1.5 mL 微量离心管</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6649</td><td></td></tr><tr><td>15 mL CellStar 蓝色螺旋盖锥底管</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管</td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II 流式细胞仪</td><td>Becton Dickinson</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva V9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA），冻干粉末</td><td>Sigma-AldrichTM</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>亮线血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle 培养基（DMEM）高糖培养基粉末</td><td>Life Technologies</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Life Technologies</td><td>21300025</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo, LLC 10.8.1</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ACS-4500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>微孔板，聚苯乙烯，96 孔，F 型底（烟囱孔），黑色</td><td>Greiner Bio One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp 热循环仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Life Technologies</td><td>18912014</td><td></td></tr><tr><td>无热原且无 RNase 的超纯水</td><td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 细胞培养瓶</td><td>Cellstar</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TENN</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&amp;prime;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td></tr><tr><td>TEPP</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&amp;prime;-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&amp;prime;</td></tr><tr><td>转移 RNA（tRNA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8508-5X1ML</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合检测方法用于评估抗癌适配体的选择性与特异性

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

开发抗癌适配体（aptamer）的一个关键挑战是高效确定所开发适配体对靶标蛋白的选择性和特异性。由于适配体相较于单克隆抗体具有多项优势，其开发在癌症研究人员中已获得极大关注。配体的指数富集系统进化（SELEX）是开发针对目标蛋白的特异性适配体最常用的方法。在完成SELEX之后，快速且高效的结合实验可加速识别过程，确认适配体的选择性和特异性。
本文介绍了一种基于流式细胞术的适配体与上皮细胞黏附分子（EpCAM）特异性结合的逐步检测方法。跨膜糖蛋白EpCAM在大多数癌瘤中高表达，在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥重要作用，因此是靶向药物递送至肿瘤的潜在理想靶点。为了评估该适配体对膜结合型EpCAM的选择性和特异性，需要使用EpCAM阳性与阴性细胞。此外，还需一种与EpCAM结合适配体长度相似且二维（2D）结构相近但无结合能力的非结合型EpCAM适配体作为对照。该结合实验包括多种缓冲液（封闭缓冲液、洗涤缓冲液、孵育缓冲液和FACS缓冲液）以及一系列孵育步骤。
将适配体与细胞系共同孵育。经过孵育和洗涤步骤后，将使用灵敏的流式细胞术检测来评估细胞。结果分析显示，EpCAM特异性适配体结合EpCAM阳性细胞，而不结合EpCAM阴性细胞。在EpCAM阳性细胞中，与非结合性适配体对照相比，EpCAM适配体的结合表现为向右的峰位移动；而在EpCAM阴性细胞中，EpCAM结合性与非结合性适配体的相应峰位重叠。这证明了EpCAM适配体的选择性和特异性。尽管本实验方案主要针对EpCAM适配体，但该方案同样适用于其他已发表的适配体。

新药发现与开发的一个重要方面是确保候选药物的选择性和特异性。这意味着候选药物应能够区分不同类型的细胞，并仅影响目标细胞群体（选择性）。通过使用在目标蛋白表达方面存在差异的细胞系来研究选择性。本研究中，选择 MDA-MB-231 和 HEK 293T 细胞系作为 EpCAM 阳性和阴性细胞。特异性是另一个关键指标，表明目标蛋白仅对单一候选药物产生响应。在此，通过使用不结合 EpCAM 的适配体 TENN 作为对照，结果显示只有 TEPP 能够与 EpCAM 结合。在 EpCAM 阳性细胞（MDA-MB-231）中，叠加代表 TEPP 和 TENN 处理细胞的直方图可见，TEPP 处理组的细胞峰向右偏移，而 TENN 处理组则无此现象。这表明适配体 TEPP 与目标蛋白 EpCAM 发生了结合（图 4D）。在阴性对照 HEK 293T 细胞中，TEPP 与 TENN 处理组的直方图叠加后未观察到任何偏移（图 4E）。这说明在表达 EpCAM 的细胞中，TEPP 作为 EpCAM 适配体与其受体特异性结合，而在不表达 EpC...

在抗癌适配体开发过程中，一个必要的步骤是检测其与靶标的结合能力。我们展示了一种基于流式细胞术的检测方法来研究这种结合，并强调了实验中必须包含阴性对照适配体，以及对该特定蛋白呈阳性或阴性的癌细胞的重要性。&#160;

开发抗癌适配体的一个关键挑战是高效确定所开发适配体对靶标的亲和选择性与特异性……

本方案将帮助初次接触适配体的研究人员在项目中使用适配体，并理解完成该方案所需的各个具体步骤。适配体具有高度多功能性，本方案展示了其在免疫表型分析实验中的简便性和易用性。适配体可用于诊断和治疗应用。本方案是验证其特异性和灵敏度的初步步骤。尽管本实验具体展示了对一种细胞表面受体的染色，适配体可非常容易地用于多参数流式细胞术，从而提供高水平的表型信息。使用适配体时的关键环节包括：确保其在使用前正确折叠，以及缓冲液和离子强度条件应与筛选时保持一致。收集并弃去培养瓶中的培养基后，加入三毫升磷酸盐缓冲液（PBS），使其覆盖细胞。每瓶加入一毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37摄氏度孵育5至10分钟，并在显微镜下观察细胞脱落情况。随后，向细胞中加入一毫升完全培养基，吹打细胞上下混匀，制成单细胞悬液。将细胞移入适当的离心管中，在200 G条件下离心5分钟。弃去上清液后，用1毫升新鲜培养基重悬细胞，并通过台盼蓝染色法计数细胞：取一定体积的细胞悬液与台盼蓝混合稀释。取约15微升混合液滴加至血细胞计数板与盖玻片之间，进行细胞计数。收集所需数量的细胞，确保每个测试样品含有十万个细胞。随后将细胞在37摄氏度下孵育两小时，以使酶解脱离后目标蛋白在细胞膜上的稳定性得以恢复。孵育两小时后，在500 ×g 下离心五分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于500微升封闭缓冲液中。将细胞在4摄氏度孵育30分钟，期间进行间歇性混匀。在30分钟孵育过程中，通过制备比文中所述浓度高一倍的适配体来进行适配体折叠。然后根据所需的折叠条件，将适配体与PCR仪混合并孵育，同时确保避免适配体暴露于光照。孵育30分钟后，按照之前的方法离心细胞并弃去上清液。随后加入1毫升洗涤缓冲液，再次离心细胞。去除上清液后，将细胞重悬于适量的结合缓冲液中。接着，用移液器将50微升重悬细胞加入预冷的96孔黑色板的每个孔中。然后，向每50微升细胞悬液中加入50微升适配体溶液，混匀后于4°C避光孵育30分钟。离心并去除上清液后，用洗涤缓冲液小心重悬沉淀，再以500 ×g离心5分钟。随后在100 µL洗涤缓冲液中重悬，用于流式细胞术分析，并重复洗涤步骤两次。首先打开流式细胞仪，然后启动计算机。接下来，打开流式细胞仪分析软件，登录程序，然后在细胞仪选项卡下运行流体启动。要创建新实验，请在实验选项卡下点击新建文件夹，并将文件夹或实验正确命名。单击新文件夹以将其选中。然后再次在“实验”选项卡下，点击“新建实验”，并为实验命名。要添加第一个样本/标本，请在“实验”选项卡下点击“新建标本”，并为标本正确命名。要添加管状样本，请先选中该标本，然后在“实验”选项卡下点击“新建管”。然后加入相应数量的试管并命名。为准备所需的图表，在工作表标签下打开一个新的工作表。新工作表窗口弹出后，绘制侧向散射（side scatter）对前向散射（forward scatter）的点印迹图，以选择目标细胞群。制备前向散射高度与前向散射面积的点印迹图，以选择单细胞群体。接着，绘制事件数量相对于目标荧光染料的直方图。在开始流式细胞术之前，确保已打开用于控制样本采集的采集仪表板、检查器和细胞仪，以调整电压参数，并确保包含所有图表的工作表已打开。首先，运行未经处理的细胞。确保指向试管的箭头为绿色。如果该箭头不是绿色，请点击箭头使其变为绿色。使用移液器将每个样品从96孔黑色板转移至流式细胞术管中。在采集仪表板上，选择要记录的适当事件数，将流速调至低速，然后点击“采集数据”。调节FSC和SSC参数的电压，确保细胞群集中在点图中央，并且无细胞接触图形的任一轴线，以避免丢失目标细胞。通过在前向散射和侧向散射密度图中识别并选择目标细胞群来定义第一个门，同时排除碎片，碎片通常表现为前向散射信号最低的群体。通过排除双联细胞群体来定义第二个门，因为双联细胞会显著影响实验结果与结论。将采集速度提高至中速或高速，以加快样本分析速度，但每秒采集事件数不应超过200至300个。然后点击记录数据。在调节电压、设置门控并记录数据后，取出样本，点击下一个样本管。插入下一个样本，并对所有对照样本和测试样本重复记录数据的操作。所有数据收集完毕后，使用流式细胞仪依次运行三管50%次氯酸钠溶液、FACSRinse和超纯水进行清洗，每种溶液均以高流速运行五分钟。然后从细胞仪的下拉菜单中点击“流路关闭”。将结果导出为fsc文件至U盘以进行传输。使用分析软件进行分析：按下新建按钮以创建新的文档和窗口来处理分析，然后将样本文件拖入新窗口中。双击打开未染色样本。为圈选单细胞群体，选择P1群体并双击P1群体以生成FSC-H versus FSC-A图。双击已圈选的单细胞，以生成针对所用荧光染料的事件直方图。在原始窗口中选择 P1 和单细胞，并将其拖拽至所有样本中，使所有样本均包含相同的圈选设置。接下来，单击布局编辑器按钮以打开布局窗口，并将两个样本相互叠加，以创建叠加直方图。在EpCAM阳性的MDA-MB-231细胞中，叠加代表经TEPP和TENN处理的细胞的直方图显示，与TENN处理的细胞相比，TEPP处理的细胞向右偏移，表明TEPP适配体与目标蛋白发生了结合。在阴性对照实验中，HEK 293T细胞的TEPP与TENN处理组直方图叠加后未显示任何偏移，说明在表达EpCAM的细胞中，TEPP是与受体结合的EpCAM适配体。此外，在EpCAM阴性细胞中未观察到结合信号，进一步证实了所开发适配体的选择性和特异性。确保适配体避光保存，将适配体与细胞在培养板中混合，并在流式细胞仪上设置正确的电压。这在很大程度上取决于适配体的后续应用。例如，我们的研究重点是药物递送。因此，我们的下一步将是利用荧光显微镜评估适配体是否被细胞内化。本实验方案展示了适配体在免疫表型分析实验中替代单克隆和多克隆抗体的简便性。

a-flow-cytometry-based-cell-surface-protein-binding-assay-for

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合测定，用于评估抗癌适配体的选择性和特异性

使用随机DNA文库进行无引物适配体筛选

在本视频中，我们介绍了一种基于流式细胞术的竞争性结合实验方法，用于检测CXC趋化因子受体4（CXCR4）与其荧光标记的天然配体CXC趋化因子配体12（CXCL12）之间的相互作用，该检测在存在靶向CXCR4的小分子化合物的条件下进行。当将表达CXCR4的细胞与较低浓度的小分子共同孵育时，CXCR4与CXCL12仍可发生一定程度的结合；而随着小分子浓度逐步增加，这种结合逐渐减少。...

竞争性结合实验用于鉴定干扰受体-配体相互作用的化合物

本方案描述了一种灵敏的基于细胞的细胞毒性检测方法。通过计数在效应CD8+ T细胞数量递增的情况下，存活的靶CD4+ T细胞频率的减少，该检测可直接评估抗原特异性CD8+...

基于细胞的流式细胞术检测细胞毒活性

本实验方案的目的是评估抗癌药物的特异性 体外...

评估抗癌药物的特异性 体外

本文描述了一种基于流式细胞术的细胞结合实验，主要用作筛选工具，用于鉴定能够抑制荧光标记的CXC趋化因子配体12（CXCL12）与CXC趋化因子受体4（CXCR4）结合的化合物。...

一种基于流式细胞术的检测方法，用于鉴定可破坏荧光标记的CXC趋化因子配体12与CXC趋化因子受体4结合的化合物

我们介绍了两种用于检测人原代急性髓系白血病（AML）样本中NKG2D配体（NKG2DL）的不同染色方案。第一种方法基于一种融合蛋白，能够识别所有已知以及可能尚未发现的配体；而第二种方案则依赖于联合使用多种抗NKG2DL抗体。...

两种用于检测急性髓系白血病中NKG2D配体表面表达的流式细胞术方法以区分干细胞与主体亚群

本方案描述了一种基于流式细胞术的高通量筛选方法，用于鉴定可抑制人中性粒细胞上β2整合素活化的小分子药物。...

一种基于流式细胞术的整合素抑制药物高通量筛选技术

本方案介绍了一种自动化的、基于图像的高通量技术，用于在存在治疗性抗 HER-2...

高内涵筛选实验用于鉴定抗体依赖性细胞介导的细胞毒性调节化合物

本文介绍一种用于鉴定可调节ADCC机制化合物的方法，ADCC是抗肿瘤抗体杀伤癌细胞的重要机制。通过该方法，在存在曲妥珠单抗（Trastuzumab）的条件下，检测自然杀伤（NK）细胞对乳腺癌细胞球状体的细胞毒性作用。图像分析可识别球状体中存活和死亡的效应细胞及靶细胞。...

在肿瘤类球体模型中定量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性：用于药物发现的应用

本文介绍了一种利用ADCC生物检测试剂盒进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）实验的方案。该方法为阐明ADCC机制以及评估抗体在癌症免疫治疗中的治疗潜力提供了有力的工具。...

使用抗体依赖性细胞介导的细胞毒性报告基因生物测定法评估癌细胞中的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性

本方案描述了一种利用表面等离子共振技术检测PD-1/PD-L1抑制剂的阻断实验。该方法采用两步固定策略和定制的缓冲体系，精确测量响应单位，从而便于评估化合物或生物制剂的阻断率。此外，该方法还支持对PD-1/PD-L1抑制剂进行高通量筛选。...

利用表面等离子共振技术鉴定PD-1/PD-L1抑制剂

了解基于流式细胞术的适配体结合测定方法，用于评估抗癌适配体对癌细胞表面受体的选择性和特异性。该方法适用于免疫表型分析和诊断治疗研究。

一种基于流式细胞术的细胞表面蛋白结合检测方法用于评估抗癌适配体的选择性与特异性

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