Name: 一种微创、准确、高效的小鼠胸腺内注射技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 学习一种微创、准确、高效的小鼠胸腺内注射技术。该方法采用超声引导实现精准定位，适用于衰老或免疫缺陷小鼠的萎缩胸腺，可显著降低手术应激并支持大规模实验研究。

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我们感谢Raymond H. Thornton在本技术早期研究所做出的深刻而全面的工作。本研究获得了美国国家癌症研究所（NCI 1R37CA250661-01A1）、儿童白血病研究协会、哈肯萨克梅里迪安医学院以及HUMC基金会/Tackle Kids Cancer的资助支持。

所有操作均按照创新发现中心的动物护理指南进行（IACUC方案290）。在本研究中，分别使用C57BL/6小鼠（雌性，4-6周龄）、C57BL/6小鼠（雌性，6月龄）、J:NU雌性小鼠、NOD scid gamma（NSG）雌性小鼠以及B6;CAG-luc, -GFP小鼠作为年轻小鼠模型、老龄小鼠模型、无胸腺裸鼠模型、免疫缺陷模型和生物发光细胞来源。小鼠购自商业来源（见材料表）。该操作通常需要两人配合完成（一人负责无菌注射操作，另一人负责小鼠处理）。
1. 动物准备
<ol>
	<li>使用3%–4%异氟烷气体对小鼠进行麻醉诱导，并以1%–3%异氟烷气体维持麻醉状态&#160;通过&#160;一个鼻锥和精密校准的蒸发器（参见&#160;材料表).</li>
	<li>通过后肢足垫夹捏无反应确认适当的麻醉深度/意识丧失。</li>
	<li>用脱毛膏在小鼠前胸部区域涂抹一层薄薄的脱毛膏，作用时间少于1分钟，然后用湿润的纸巾彻底擦去脱毛膏及脱落的毛发。 
	注意：使用过多乳膏会导致胸部区域皮肤发炎。</li>
	<li>一次将一只小鼠仰卧放置于小动物超声成像仪的加热平台上（参见 材料表）并将鼻锥安装到位（图1).</li>
	<li>用医用胶带将小鼠的前肢和后肢固定在实验台上（图1).</li>
	<li>双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>使用氯己定葡萄糖酸盐涂抹器对无毛发的上胸部皮肤进行消毒（参见 材料表).</li>
</ol>
2. 超声设备与无菌区域的准备
<ol>
	<li>启动可用的最高频率线性探头，通常选择针对被成像动物尺寸具有最高空间分辨率的探头。在启动界面后，点击相应的按钮以激活探头。 
	注意：本实验应用中使用的小鼠探头专为小鼠及小型大鼠设计（见材料表）。</li>
	<li>按照以下步骤优化超声成像和注射的设置。
	<ol>
		<li>通过调整屏幕右侧垂直方向的滑块，将视野深度调节至适合目标动物的大小（图2）。对于幼年小鼠，最大深度设置通常约为6–8 mm。</li>
		<li>通过滑动屏幕底部水平条上的按钮，调节灰阶增益（图2）。目标是使图像初始亮度略暗于典型的&#34;灰色&#34;外观。</li>
		<li>将焦点区域（屏幕右侧蓝色箭头所示，图2）调节至预期的胸腺水平。对于幼年小鼠，该深度约为4 mm。</li>
		<li>如需采集图像，请测试存储图像和存储视频按钮的功能，确保在整个操作过程中能够正确保存图像。可通过点击屏幕右下角的保存视频按钮，或先点击冻结按钮再点击保存图像来完成（图2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将少量（约1 mL）超声耦合剂涂于探头表面（见材料表），此时探头应保持直立，可置于超声仪支架上或由助手手持。</li>
	<li>在加热平台旁准备一小块无菌区域。最佳位置通常位于加热平台与超声仪之间。
	<ol>
		<li>将以下物品放置于无菌区域：无菌探头套、橡胶圈、无菌手套和无菌超声耦合剂（见材料表）。</li>
		<li>在无菌区域布置完毕并摆放好物品后，戴上无菌手套。</li>
		<li>小心地将无菌探头套覆盖在超声换能器上（同时覆盖最初涂在探头上的耦合剂）。操作过程中保持无菌状态，仅接触无菌套，不得触及其他部分。将无菌橡胶圈套在无菌探头套外，以固定探头套。 
		注意：无论大小，空气焦点均可能干扰超声成像。因此，必须在换能器与无菌探头套之间以及探头套外表面涂抹超声耦合剂，以确保超声探头与动物之间无气界面。&#160;</li>
		<li>在探头上涂抹适量（2–3 mL）无菌超声耦合剂。 
		&#8203;注意：此时操作者已准备好对麻醉小鼠进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 成像与定位胸腺
<ol>
	<li>在保持无菌条件下，将涂有超声耦合剂的探头垂直放置于小鼠前胸部已消毒的区域，进行初步成像。
	<ol>
		<li>花时间观察超声图像，并进一步优化。返回步骤 2.2，进行调整，使图像外观与图3相似。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以横向平面扫描小鼠前胸部。操作时将探头垂直握持，从颈部至腹部上下移动，动作类似刷漆或&#34;扫掠&#34;。 
	注意：由于心脏具有快速运动和&#34;腔室状&#34;的外观，是胸腔中最易识别的结构。一旦定位心脏，即可将其作为参考点，用于获取胸腺图像。</li>
	<li>当心脏位于视野中心时，将探头略向颈部方向扫动。在心脏稍上方，通常可发现胸腺。</li>
	<li>将胸腺识别为位于中线、呈双叶状、金字塔形的低回声结构（在屏幕上呈现为&#34;暗&#34;或&#34;黑色&#34;），位于主动脉前方、胸骨后方（图3A）。</li>
	<li>注意上胸部两侧成对出现的两个圆形黑色结构（即&#34;低回声&#34;）。 
	&#8203;注意：这些是双侧腔静脉。主动脉为位于两侧腔静脉之间的中线处、形态相似的弯曲状低回声结构，可通过其搏动性运动轻易识别。</li>
</ol>
胸腺注射
<ol>
	<li>必要时，向探头添加更多（2–3 mL）无菌超声耦合凝胶。 
	注意：与小鼠胸廓大小相比，换能器上使用相对大量的无菌凝胶可起到以下作用 &#34;凝胶垫&#34; 围绕小鼠胸壁进行操作。这将减少视野内空气产生的超声伪影。</li>
	<li>使用超声探头定位胸腺最宽的部分，该部位通常是注射的理想靶点。在选定位置预判针头的水平进针路径。
	<ol>
		<li>注意此处主要血管（上腔静脉和主动脉）的位置。注射时应避开这些区域。</li>
		<li>血管将呈现为低回声、搏动性结构，如步骤3.7所述。若不确定，可使用彩色多普勒模式检查血管内的血流情况（图 4A）。通过轻触激活彩色多普勒模式 颜色 屏幕上的按钮</li>
		<li>如果预计主要血管（或心脏）位于预期的穿刺针路径上，则应选择新的目标区域或采用不同的入路/路径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一只手握住换能器，另一只手持30 G胰岛素针头（参见 材料表用10 µL的注射液在另一侧。 
	注意：注射液的成分根据实验设计而定。本研究使用磷酸盐缓冲液、台盼蓝或D-荧光素（0.1 µg/10 µL）。</li>
	<li>开始注射过程时，将探头横向移动，使胸腺偏离超声视野中心。确保视野的另一侧主要为超声耦合剂，无其他结构。</li>
	<li>将针尖置于换能器下方的凝胶中，并缓慢移动针头，直至在皮肤表面附近可见图4B).</li>
	<li>在持续进行超声成像以观察针头的同时，沿经皮路径将针头插入胸腺，避开血管。
	<ol>
		<li>使用一个 &#34;胸腺交叉&#34; 水平进针，将针尖置于与穿刺点对侧的胸腺叶内，以防止液体沿针道渗漏图 5A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当针尖进入胸腺目标区域后，在超声影像引导下，迅速注射30 G注射器内的内容物（如10 µL台盼蓝或D-荧光素钠，0.1 µg/10 µL）。
	<ol>
		<li>为在插入针头和注射过程中稳定注射器，应将注射器夹持于拇指与无名指之间，并用食指控制注射器活塞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在所有内容物注入后，移除针头。</li>
</ol>
5. 动物注射后的监测
<ol>
	<li>将动物转移至一个空的笼子中，并观察直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。 
	注意：预期在2分钟内完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>再额外监测动物10分钟，观察是否有痛苦、呼吸困难或出血的迹象。 
	注意：注射后不应出现疼痛，通常无需使用注射后镇痛药物。</li>
	<li>待动物完全恢复且注射后观察期间无异常情况时，将其放回与其他动物共同饲养的环境中。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

超声引导下的徒手注射是一种高效且无菌地将研究物质递送至胸腺的高精度技术。在对注射部位皮肤进行初步消毒后，由于使用了无菌手套、无菌超声探头套和无菌超声耦合剂，整个操作过程中可保持无菌状态。与常用的盲穿经皮注射方法10,17或依赖外科切口直接观察胸腺18,19的小鼠胸腺内注射技术相比，徒手超声引导技术结合了高度的安全性、快速性和极高的操作精确度。使用导轨平台进行超声引导注射14可达到相似的安全性和准确性，但这种繁琐的方法通常在小鼠麻醉并放置于成像平台后，每只注射至少需要5分钟，而徒手技术则可使熟练操作者在每只小鼠上约20至30秒内完成注射15。
掌握胸腺内注射的各种方法，包括超声引导下徒手注射技术，需要丰富的经验和培训。然而，具有超声引导操作临床经验的放射科医...

胸腺在T细胞发育和免疫中具有重要作用。T细胞缺乏症可由胸腺退化、遗传性疾病、感染以及癌症治疗等多种因素引起，导致高死亡率和高发病率1,2。小鼠模型在基础和转化免疫学研究中不可或缺，数十年来已被广泛用于研究胸腺生物学和T细胞发育，并用于开发针对胸腺功能障碍和T细胞缺乏症患者的治疗方法3,4,5。
胸腺研究的一个核心部分是在小鼠模型中向胸腺内注射细胞、基因或蛋白质等生物材料6,7,8,9,10,11,12传统的胸腺内注射方法采用开胸术，随后在直视下进行胸腺内注射，或通过 &#34;盲法&#34; 经皮穿刺纵隔注射。手术入路会显著增加气胸等风险。此外，手术过程中升高的应激反应可导致免疫抑制，从而可能影响免疫学数据的准确性13经验丰富的研究人员经过一定练习后可掌握盲注技术，但该方法准确性较低，因此仅适用于胸腺较大的幼龄小鼠。
超声引导技术已被引入作为传统胸腺内注射方法的一种精确且微创的替代方案14。然而，与徒手操作技术相比，使用集成导轨系统时该操作非常耗时。采用注射支架进行注射需要借助多种附件（如探头支架和安装座、X、Y、Z定位系统）仔细优化成像并调整探头位置，同时还需熟练操作微操纵控制系统及导轨系统的扩展装置。本文介绍了一种由放射科医师采用徒手操作方式进行的简单替代技术——超声引导下胸腺注射15，该方法既快速又准确，是一种上述方法的微创替代方案。重要的是，当前这一方法可在任何高分辨率超声成像系统上实施，无需使用注射支架和集成导轨系统。该方法特别适用于需要对大量小鼠进行注射的研究11，涉及双侧胸腺叶注射的实验，或对老年、经照射或免疫功能低下的小鼠等胸腺体积较小动物的精确注射12。

<table><tbody><tr><td>Aquasonic 100 超声耦合剂</td><td>帕克实验室（美国新泽西州费尔菲尔德）</td><td>01-01</td><td>无菌超声传导凝胶</td></tr><tr><td>B6;CAG-luc, -GFP 小鼠</td><td>杰克逊实验室（美国缅因州巴港）</td><td>025854</td><td>生物发光细胞来源</td></tr><tr><td>BD 胰岛素注射器（带针头）</td><td>BD公司（美国新泽西州富兰克林湖）</td><td>328431</td><td>超细针头 - 12.7 毫米，30 G</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠 - 老年</td><td>杰克逊实验室（美国缅因州巴港）</td><td>000664</td><td>6个月大；衰老模型</td></tr><tr><td>C57BL/6 小鼠 - 幼年</td><td>杰克逊实验室（美国缅因州巴港）</td><td>000664</td><td>4-6周龄；幼年模型</td></tr><tr><td>Chloraprep 一步法 0.67 mL</td><td>CareFusion（美国德克萨斯州埃尔帕索）</td><td>260449</td><td>氯己定葡萄糖酸盐涂抹器</td></tr><tr><td>Curity 棉签</td><td>Cardinal Health（美国俄亥俄州都柏林）</td><td>A5000-2</td><td>无菌，6&quot;</td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Gold Biotechnology（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>LUCK-1G</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein（美国纽约州梅尔维尔）</td><td>1182097</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina X5</td><td>PerkinElmer（美国纽约州梅尔维尔）</td><td>n/a</td><td>活体生物发光成像系统</td></tr><tr><td>J:NU小鼠</td><td>杰克逊实验室（美国缅因州巴港）</td><td>007850</td><td>无胸腺裸鼠模型</td></tr><tr><td>Kendall 低致敏性纸质胶带</td><td>Cardinal Health（美国俄亥俄州都柏林）</td><td>1914C</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech 外科丁腈手套</td><td>金佰利专业公司（美国德克萨斯州欧文市）</td><td>56892</td><td>无菌手套</td></tr><tr><td>Nair 脱毛乳液</td><td>Church and Dwight（美国新泽西州特伦顿）</td><td>n/a</td><td>脱毛剂</td></tr><tr><td>NOD scid gamma（NSG）小鼠</td><td>杰克逊实验室（美国缅因州巴港）</td><td>005557</td><td>免疫缺陷模型</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1×</td><td>康宁公司（美国纽约州康宁市）</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Puralube Vet 软膏</td><td>医学与兽医国际</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td>眼膏</td></tr><tr><td>鞘</td><td>Sheathing Technologies（美国加利福尼亚州摩根山）</td><td>10040</td><td>无菌超声探头套</td></tr><tr><td>Sure-Seal 诱导室</td><td>Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)</td><td>EZ-17 85</td><td>麻醉诱导室</td></tr><tr><td>传感器 MX550D</td><td>FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）</td><td>n/a</td><td>Vevo 3100 成像探头（25–55 MHz，中心发射：40 MHz）</td></tr><tr><td>PBS 中的 0.4% 台盼蓝溶液</td><td>MP Biomedicals（美国俄亥俄州索伦）</td><td>91691049</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 3100 成像系统</td><td>FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）</td><td>n/a</td><td>超声成像系统</td></tr><tr><td>Vevo 3100 实验室软件</td><td>FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）</td><td>n/a</td><td>用于成像与分析的 3.2.7 版本</td></tr><tr><td>Vevo Compact 双麻醉系统</td><td>FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）</td><td>n/a</td><td>基于异氟烷的台式麻醉装置</td></tr><tr><td>Vevo 成像系统</td><td>FUJIFILM VisualSonics（加拿大安大略省多伦多市）</td><td>n/a</td><td>操作平台</td></tr></tbody></table>

一种用于小鼠胸腺内注射的微创、准确且高效的技术

A Minimally Invasive, Accurate, and Efficient Technique for Intrathymic Injection in Mice

在小鼠模型中进行胸腺内注射是研究胸腺功能及免疫功能（包括遗传性和获得性T细胞疾病）的重要技术。该技术需要将试剂和/或细胞直接递送至活体小鼠的胸腺中。传统的胸腺内注射方法包括开胸手术或微创经皮盲注，但两者均存在显著局限性。超声频率成像设备的发展使得在小鼠中实现影像引导下的经皮注射成为可能，显著提高了经皮注射的准确性，并能够靶向更小的结构。然而，影像引导注射依赖于集成导轨系统的使用，导致操作僵化且耗时较长。本文介绍一种独特、安全且高效的小鼠经皮胸腺内注射方法，无需依赖导轨系统即可完成注射。该技术利用高分辨率微型超声设备对小鼠胸腺进行无创成像，并采用徒手操作技术，在超声引导下由放射科医师将针尖直接置入小鼠胸腺。小鼠在成像前需进行清洁和麻醉处理。对于熟练掌握超声引导操作的放射科医师而言，该技术的学习周期非常短，通常一次操作即可掌握。该方法对小鼠的发病率和死亡率较低，且比目前依赖机械辅助的经皮注射技术更为快速。该方法可高效、精确且可靠地对各种大小的胸腺（包括老年小鼠或免疫缺陷小鼠等体积非常小的胸腺）进行经皮注射，同时最大程度减少动物应激。如需，该技术还可实现对单个胸腺叶的注射，并因其操作省时，适用于大规模实验研究。

成功实施该技术依赖于遵循几个关键步骤。首先，必须可靠地识别胸腺本体。在年轻小鼠中，由于胸腺体积较大，这一步较为直接（图 3A）。而在年老小鼠或免疫缺陷小鼠中，识别可能更具挑战性；然而，使用现代超声设备仍然完全可以实现（图 3B、C）。其次，至关重要的是设定针头的进针路径，使其在针尖穿过胸壁各层并进入胸腺的过程中能够持续被可视化。成功的注射要求在整个推进过程中均能清晰观察到针头。这可确保操作者确认针头未穿入心脏、主动脉或下腔静脉等重要结构（图 4）。此原则同样适用于注射过程本身：注射期间必须始终在目标位置清晰看到针尖，以确认物质已准确注入胸腺内（图 5）。
存在一些轻微的陷阱，若能及时识别，则相对容易克服。在将小鼠固定于载物台和鼻罩时，需尽量使小鼠胸廓保持中立位（即无明显向左或向右旋转）。若胸廓旋转过度，则可能难以...

本方案描述了一种建立用于小鼠胸腺内注射的介入放射学操作方法，旨在避免开放性手术的风险，并提高盲穿经皮注射的准确性。

小鼠模型中的胸腺内注射是研究胸腺功能和免疫功能的重要技术，包括遗传性和获得性T细胞疾病。

该方案为传统的手术方法和盲注方法提供了一种准确、安全且高效的非手术替代方案。它也是对老龄或免疫缺陷小鼠萎缩性胸腺进行注射的最准确技术。其主要优势在于注射过程对动物的应激极小，具有高度的安全性和精确性，同时操作快速，因而能够在避免手术应激所致免疫抑制干扰的前提下，开展大规模实验研究。在将穿刺针和超声探头穿过胸壁时保持两者的对齐需要一定的练习。因此，我们建议与经验丰富的介入放射科医生合作进行注射操作或接受相关培训。本次操作的示范将由我实验室的技术员 Shaina Anuncio 协助完成。首先，在小鼠胸部前侧区域涂抹一层薄薄的脱毛膏，时间少于一分钟，以去除毛发。用湿润的纸巾擦去脱毛膏和松动的毛发。通过轻捏后肢足垫无反应来确认麻醉深度适当。在双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥。将小鼠逐只仰卧放置于小动物超声成像仪的加热平台上，并连接鼻罩。使用医用胶带将小鼠的前肢和后肢固定在平台上。使用氯己定葡萄糖酸盐涂抹器对无毛发的上胸部皮肤进行消毒。启动可用的最高频率线性探头，通常选择针对被成像动物体型具有最高空间分辨率的探头。启动屏幕出现后，点击相应按钮以激活探头。为优化成像和注射的超声设置，通过调节屏幕右侧垂直方向的滑块，将视野深度调整至适合目标动物的大小。通过沿屏幕底部水平方向的滑条移动按钮，调节灰阶增益。然后，将焦点区域调整至预期的胸腺水平。将换能器垂直放置，或置于超声设备支架上，或由助手手持，在其表面涂抹约一毫升超声耦合剂。在加热平台旁边准备一个小型无菌区域，将无菌探头套、橡胶圈、无菌手套和无菌超声耦合剂取出并放置于无菌区域内。然后戴上无菌手套。小心地将无菌探头套覆盖在超声换能器和凝胶上。为保持无菌状态，仅可接触无菌套。将无菌橡胶圈滑至探头套上以固定其位置。在换能器上放置两到三毫升无菌超声耦合剂。将带有超声耦合剂的探头垂直置于小鼠前胸壁已消毒的区域，进行初步成像，同时保持无菌状态。按照之前演示的方法观察并优化超声图像。为在横断面扫描小鼠前胸部，应将探头垂直握持，并以类似画笔涂抹或扫掠的动作，从颈部至腹部上下移动。当心脏位于视野中心时，将探头轻微向颈部方向扫动。注意上胸部两侧成对的两个圆形黑色结构。使用超声探头找到胸腺最宽的部分，该位置通常是注射的理想靶点。在选定位置预判针头的水平进针路径，并注意此处主要血管的位置。注射时应避开这些血管。血管在超声下表现为低回声的搏动性结构。若不确定，可点击屏幕上的彩色按钮，启动彩色多普勒模式，以确认血管内是否存在血流。一手持换能器，另一手持装有10微升注射液的30号胰岛素针头。开始注射时，将换能器向侧面移动，使胸腺偏离超声视野中心。确保视野另一侧主要为超声耦合剂，无其他结构。将针尖置于探头下方的凝胶中，缓慢移动针头直至在皮肤表面附近可见。在超声持续引导下，沿避开血管的经皮路径将针插入胸腺。采用穿过胸腺的横向路径，使针尖到达与进针点对侧的胸腺叶。当针尖进入胸腺目标部位后，在超声引导下迅速注射30号注射器内的内容物。为在进针和注射过程中稳定注射器，可用拇指与无名指夹持注射器，以食指控制注射器活塞。待所有内容物完全注入后，拔出针头。在幼鼠中，由于胸腺较大，识别胸腺较为容易。而在年老或免疫缺陷小鼠中则更具挑战性。然而，使用现代超声设备仍然完全可以实现。当针头未穿过心脏、主动脉或下腔静脉等重要结构时，视为注射成功。注射过程中可观察到针尖位于目标位置，证实药物注入胸腺内。通过向荧光素酶转基因小鼠注射荧光素（Luciferin）作为示踪剂，进一步确认注射部位位于胸腺内。这些操作立即通过生物发光成像进行评估，可在不处死动物的情况下确认注射位置的准确性。 alternatively，可注射台盼蓝作为注射部位的可视化标记，并通过离体解剖来评估注射的准确性。本课题组已将该技术应用于多项大型研究，包括基于基因修饰前体细胞注射的癌症免疫治疗研究，以及用于改善免疫缺陷小鼠胸腺功能的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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通过脑室内（ICV）和静脉内（IV）注射在小鼠中递送治疗剂

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超声心动图引导下的经皮心肌内注射是一种高效、可靠且可靶向的小鼠心脏基因转导剂或细胞递送方法。按照本方案所述步骤操作，实验人员可迅速掌握这种用途广泛且微创的技术。...

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皮内肿瘤移植作为小鼠肿瘤内免疫治疗研究的稳健模型

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