一种用于小鼠胸腺内注射的微创、准确且高效的技术

该方案为传统的手术方法和盲注方法提供了一种准确、安全且高效的非手术替代方案。它也是对老龄或免疫缺陷小鼠萎缩性胸腺进行注射的最准确技术。其主要优势在于注射过程对动物的应激极小，具有高度的安全性和精确性，同时操作快速，因而能够在避免手术应激所致免疫抑制干扰的前提下，开展大规模实验研究。

在将穿刺针和超声探头穿过胸壁时保持两者的对齐需要一定的练习。因此，我们建议与经验丰富的介入放射科医生合作进行注射操作或接受相关培训。本次操作的示范将由我实验室的技术员 Shaina Anuncio 协助完成。

首先，在小鼠胸部前侧区域涂抹一层薄薄的脱毛膏，时间少于一分钟，以去除毛发。用湿润的纸巾擦去脱毛膏和松动的毛发。通过轻捏后肢足垫无反应来确认麻醉深度适当。

在双眼涂抹眼膏以防止角膜干燥。将小鼠逐只仰卧放置于小动物超声成像仪的加热平台上，并连接鼻罩。使用医用胶带将小鼠的前肢和后肢固定在平台上。

使用氯己定葡萄糖酸盐涂抹器对无毛发的上胸部皮肤进行消毒。启动可用的最高频率线性探头，通常选择针对被成像动物体型具有最高空间分辨率的探头。

启动屏幕出现后，点击相应按钮以激活探头。为优化成像和注射的超声设置，通过调节屏幕右侧垂直方向的滑块，将视野深度调整至适合目标动物的大小。通过沿屏幕底部水平方向的滑条移动按钮，调节灰阶增益。

然后，将焦点区域调整至预期的胸腺水平。将换能器垂直放置，或置于超声设备支架上，或由助手手持，在其表面涂抹约一毫升超声耦合剂。在加热平台旁边准备一个小型无菌区域，将无菌探头套、橡胶圈、无菌手套和无菌超声耦合剂取出并放置于无菌区域内。

然后戴上无菌手套。小心地将无菌探头套覆盖在超声换能器和凝胶上。为保持无菌状态，仅可接触无菌套。

将无菌橡胶圈滑至探头套上以固定其位置。在换能器上放置两到三毫升无菌超声耦合剂。将带有超声耦合剂的探头垂直置于小鼠前胸壁已消毒的区域，进行初步成像，同时保持无菌状态。

按照之前演示的方法观察并优化超声图像。为在横断面扫描小鼠前胸部，应将探头垂直握持，并以类似画笔涂抹或扫掠的动作，从颈部至腹部上下移动。当心脏位于视野中心时，将探头轻微向颈部方向扫动。

注意上胸部两侧成对的两个圆形黑色结构。使用超声探头找到胸腺最宽的部分，该位置通常是注射的理想靶点。在选定位置预判针头的水平进针路径，并注意此处主要血管的位置。

注射时应避开这些血管。血管在超声下表现为低回声的搏动性结构。若不确定，可点击屏幕上的彩色按钮，启动彩色多普勒模式，以确认血管内是否存在血流。

一手持换能器，另一手持装有10微升注射液的30号胰岛素针头。开始注射时，将换能器向侧面移动，使胸腺偏离超声视野中心。确保视野另一侧主要为超声耦合剂，无其他结构。

将针尖置于探头下方的凝胶中，缓慢移动针头直至在皮肤表面附近可见。在超声持续引导下，沿避开血管的经皮路径将针插入胸腺。采用穿过胸腺的横向路径，使针尖到达与进针点对侧的胸腺叶。

当针尖进入胸腺目标部位后，在超声引导下迅速注射30号注射器内的内容物。为在进针和注射过程中稳定注射器，可用拇指与无名指夹持注射器，以食指控制注射器活塞。待所有内容物完全注入后，拔出针头。

在幼鼠中，由于胸腺较大，识别胸腺较为容易。而在年老或免疫缺陷小鼠中则更具挑战性。然而，使用现代超声设备仍然完全可以实现。

当针头未穿过心脏、主动脉或下腔静脉等重要结构时，视为注射成功。注射过程中可观察到针尖位于目标位置，证实药物注入胸腺内。通过向荧光素酶转基因小鼠注射荧光素（Luciferin）作为示踪剂，进一步确认注射部位位于胸腺内。

这些操作立即通过生物发光成像进行评估，可在不处死动物的情况下确认注射位置的准确性。 alternatively，可注射台盼蓝作为注射部位的可视化标记，并通过离体解剖来评估注射的准确性。本课题组已将该技术应用于多项大型研究，包括基于基因修饰前体细胞注射的癌症免疫治疗研究，以及用于改善免疫缺陷小鼠胸腺功能的研究。