小鼠粪便分离与微生物群移植

本文介绍了一种实验方案，旨在指导研究人员从采集粪便样本到采用瑞士卷法研究肠道变化，系统探究疾病中菌群失调的机制。首先，用70%乙醇喷洒已处死小鼠的胸部和体侧，小心切开皮肤和腹腔，暴露消化道。分离盲肠后，使用无菌手术剪将其纵向剪开成两半。

短暂暴露盲肠，并在回肠端近端0.5厘米处及与结肠连接处远端0.5厘米处进行切割。将分离的盲肠转移至无菌培养皿中。使用无菌刮勺将盲肠内容物转移至无菌管中，并将分装样品保存于-80°C冰箱中。

取新鲜或先前冷冻的粪便颗粒，按1:20的比例悬浮于无菌生理盐水中，涡旋振荡至均匀。将匀浆通过30微米孔径的尼龙滤膜，以去除大颗粒物质。在79×g离心5分钟，收集上清液用于移植。

将每只无菌受体小鼠每天经口灌胃100微升混悬液，连续三天，之后每三天灌胃一次，持续两周。将小鼠轻轻放入预热的小鼠固定器中的固定装置内，并使尾巴留在外侧。小心地用胶带固定上方，注意不要夹住小鼠，以免造成应激。

将小鼠置于固定器中静置，并将其放置在尾套仪平台上，用遮盖物覆盖，适应 3 至 5 分钟。使用尾套体积描记法至少采集三轮收缩压测量值，并对每只动物所有轮次的测量值取平均，得到平均收缩压。无菌条件下采集安乐死小鼠的盲肠内容物。

为了收获肠道及其他组织，需在小鼠体内定位相应组织，并用剪刀将其切除，以研究肠道微生物群在心脏代谢健康中的作用。在第一天，从肛门侧向胃侧解剖小鼠肠道，并将分离出的整个胃肠道置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。

轻轻从胃端拉出近端，用手去除周围的脂肪和结缔组织。分离小肠，并将每段小肠折叠成Z形锯齿状。随后剪切以获取十二指肠、空肠和回肠。

通过剪切盲肠下方的肠段来分离结肠。剪除十二指肠、空肠、回肠和结肠。使用带有球形针头的注射器，小心地用PBS冲洗并清洗肠腔内部，避免撕裂肠道。

将肠道置于滤纸上，并在滤纸左上角标记该肠段名称及“P”表示近端，或在左下角标记“D”表示远端。使用圆头剪刀纵向剪开肠道。将肠道在滤纸上展开，根据需要使用更多的PBS进行冲洗。

将肠道夹在两张滤纸之间，并在靠近肠道的四个位置或角落用订书钉固定。浸泡于10%中性缓冲福尔马林溶液中，于室温下使用摇床以5 rpm振荡过夜。第二天，将预先配制的2%琼脂糖加入去离子水中，放入覆盖铝箔的烧杯中，用磁力搅拌器加热。

为获取组织，先移除上层滤纸，从近端开始卷起肠道，使近端首先进入内部，并向内卷绕，确保肠腔也朝向载玻片内侧。根据需要使用一根或两根30号针头固定。使用一次性刻度移液管吸取1毫升琼脂糖，将琼脂糖倒在平坦表面上已卷好的肠段上，注意避免组织中产生气泡。

待琼脂糖冷却凝固后，使用剃刀片修剪组织切片周围的多余琼脂糖。最后将肠道切片放入组织处理或包埋盒中，并在4°C条件下浸泡于70%乙醇中。此处展示了对正常盐饮食和高盐饮食小鼠盲肠内容物中物种生物多样性估计的结果。

肠道微生物群在高盐饮食下的变化表现为细菌多样性降低。非度量多维尺度分析显示，正常盐饮食组与高盐饮食组小鼠的细菌分别聚集成独立的簇。高盐饮食与厚壁菌门与拟杆菌门比例升高相关。

来自高盐饮食小鼠的粪便微生物群移植可使无菌小鼠更易发生血管紧张素II诱导的高血压。与接受正常盐饮食小鼠肠道微生物群的小鼠相比，接受高盐饮食诱导的肠道菌群失调小鼠的无菌小鼠收缩压显著升高。代表性图像显示了来自高脂血症但无或伴有蛋白尿小鼠的回肠载脂蛋白A-I染色结果。

本方案将人类和啮齿类供体在粪菌移植实验中的关键考虑因素与操作步骤进行了系统整合。