Name: 小鼠粪便分离和微生物群移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习小鼠粪便无菌采集与瑞士卷法肠道分析技术，用于研究肠道菌群失调与心血管疾病机制。该方法结合免疫染色技术，为深入理解肠道微生物在心脏代谢健康中的作用提供可靠实验方案。

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本研究由美国国家转化科学促进中心资助，资助号为范德堡临床与转化科学奖 UL1TR002243（授予 A.K.）；美国心脏协会资助号 POST903428（授予 J.A.I.）；美国国家心肺血液研究所资助号 K01HL13049、R03HL155041、R01HL144941（授予 A.K.），以及美国国立卫生研究院资助号 1P01HL116263（授予 V.K.）。（图 1 使用 Biorender 制作。）

本手稿中描述的所有实验程序均获得范德堡大学机构动物护理和使用委员会的批准。3月龄雄性C57B1/6小鼠购自杰克逊实验室，饲养和护理均按照《实验动物护理和使用指南》进行。
1. 人类粪便样本的采集、储存与处理
<ol>
	<li>采集粪便样本，若受试者在诊所内，应使用无菌容器。采集后36小时内将粪便样本置于4 °C冷藏，直至准备进行处理。或者，可使用 commercially available 工具采集粪便样本，以在常温下实现便捷且长期的DNA稳定性，尤其适用于居家采样。</li>
	<li>使用10%次氯酸钠溶液或其他美国环境保护署（EPA）批准的消毒剂，对生物安全级通风橱进行消毒。</li>
	<li>将粪便样本从冷藏环境中取出并移入通风橱内；使用一次性刮勺分装约1 g的等分样本，并储存于-80 °C超低温冰箱中，直至完全准备好进行处理。</li>
	<li>将所有一次性物品丢弃至生物危害垃圾桶中。对所有表面（通风橱及操作过程中接触过的任何表面）以及从通风橱中移出的物品进行消毒。</li>
</ol>
2. 小鼠粪便样本的无菌采集
注意：使用无菌技术，包括无菌器械。
<ol>
	<li>通过 CO2 窒息法处死小鼠。用 70% 乙醇喷洒小鼠胸部和侧面，小心切开皮肤和腹膜腔，暴露消化道。</li>
	<li>分离盲肠，并使用无菌手术剪将其切成两半。简要操作：暴露盲肠后，在回肠端近端 0.5 cm 处及与结肠连接处远端 0.5 cm 处进行切割。将分离的盲肠转移至无菌培养皿中。</li>
	<li>使用无菌刮勺将盲肠内容物转移至无菌管中，并将等份样品储存于 -80 °C 冰箱19。 
	&#8203;注意：由于肠道中大多数细菌为厌氧菌，在室温空气环境中暴露于氧气可能会在分离过程中损伤或杀死这些微生物。因此，粪便样本应在厌氧舱内进行分离，以维持细菌的活性。</li>
</ol>
3. 粪便移植
<ol>
	<li>将新鲜或先前冷冻的粪便颗粒按1:20（重量:体积）的比例悬浮于无菌生理盐水中，并涡旋振荡至均匀。</li>
	<li>将匀浆液通过孔径为30 µm的尼龙滤膜，以去除大颗粒物质。在79 × g 条件下离心5分钟，收集上清液用于移植。</li>
	<li>对无菌受体小鼠每日经口灌胃100 µL粪便悬液，连续3天，随后每3天灌胃一次，持续2周。若需研究肠道微生物群的作用机制，可使用普通小鼠，但需先通过抗生素处理清除其自身固有微生物群。例如，在给予粪便悬液前，连续5天每日经口灌胃头孢曲松（400 mg/kg）。
	 
	注意：研究表明，至少需要2周的此类处理才能诱导心血管系统的变化，包括血压变化20。</li>
	<li>确保无菌受体小鼠单独饲养于无菌隔离器中，并给予无菌食物和水。</li>
</ol>
4. 收缩压测量
注意：接受来自常规饲养的3月龄C57Bl/6小鼠粪菌移植（FMT）的无菌小鼠被植入渗透压微型泵（Alzet，型号2002），以持续2周输注低剂量血管紧张素II（140 ng/kg/min）。血压通过尾套法每周监测一次。via 尾套法监测血压的方案此前已有报道21。尾套法操作简要总结如下。对于无菌小鼠的粪菌移植研究，使用尾套法等非侵入性方法测量血压是合适的。有关尾套法操作的详细步骤此前已有描述22。
<ol>
	<li>简而言之，从无菌隔离器中取出小鼠，并预热尾套法测量仪的平台和小鼠固定装置。</li>
	<li>将清醒的小鼠置于加热平台上的固定装置中，使用尾套体积描记法至少采集三轮收缩压测量数据。在正式测量前连续三天执行以下步骤，以训练小鼠适应固定状态，从而减少应激反应。
	<ol>
		<li>轻轻地将小鼠放入预热的固定装置中，尾巴留在外侧。小心地用胶带固定顶部，避免夹伤，以免造成小鼠应激。</li>
		<li>让小鼠在固定装置中静置，在平台上放置3–5分钟，并用盖布覆盖，以帮助其适应环境。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每只动物所有轮次的测量值取平均，得到其平均收缩压。</li>
</ol>
5. 评估粪菌移植对心血管变化的影响
<ol>
	<li>测量血压后，处死小鼠并按照第2节所述方法无菌采集盲肠内容物。</li>
	<li>取下肠道及其他组织，包括心脏、主动脉、肝脏、肠系膜动脉和肾脏，以研究肠道微生物群在心血管代谢健康中的作用。取材时，在小鼠体内定位相应组织，使用剪刀将其剪下。</li>
	<li>对供体和受体小鼠采集的粪便样本/盲肠内容物进行宏基因组测序分析，以确认粪菌移植（FMT）后肠道微生物群的定植情况23。微生物群成功定植的首要证据是确认供体与受体的微生物群组成相似。</li>
	<li>对获取的肠组织采用瑞士卷技术（见第6节），结合免疫染色和组织学分析，检测形态学及细胞表达的变化24。</li>
</ol>
6. 制作肠道瑞士卷
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>对一只已用70%乙醇喷洒并经适当安乐死的小鼠，从肛门端（固定于腹膜后）向胃端解剖出小鼠肠道。将分离的整个胃肠道置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。用手轻轻握住靠近胃端的近端，手动去除周围的脂肪和结缔组织。</li>
		<li>分离小肠（盲肠头侧部分），将其每段剪成Z字形锯齿状。然后按照先前描述的方法依次剪取十二指肠、空肠和回肠25。通过剪切盲肠下方的肠段来分离结肠。</li>
		<li>分别剪下十二指肠、空肠、回肠和结肠。</li>
		<li>使用带有圆头针头的注射器和PBS冲洗并清洗肠腔内部，注意避免撕裂肠壁。</li>
		<li>将肠道组织放置在滤纸上。在滤纸上标记肠段名称（例如：十二指肠），并在右上角标注“P”表示近端，或在右下角标注“D”表示远端。</li>
		<li>使用圆头剪刀沿纵向剪开肠道。将肠道在滤纸上展开，并根据需要用更多PBS进行清洗。</li>
		<li>将肠道夹在两张滤纸之间，并在靠近组织的四个角/位置用订书钉固定滤纸。</li>
		<li>浸入10%中性缓冲福尔马林溶液（4.0 g磷酸二氢钠，6.5 g磷酸氢二钠，100 mL 37%甲醛，900 mL蒸馏水）中。室温下使用摇床以5 rpm振荡过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>在蒸馏水中配制2%琼脂糖，将烧杯用铝箔覆盖后加热，并使用搅拌子持续搅拌。</li>
		<li>取出组织，移除上层滤纸。从近端开始将肠道卷起，使近端先向内卷入，继续向内卷绕，确保管腔也朝向载玻片内部。根据需要使用一根或两根30 G针头固定。</li>
		<li>使用一次性刻度移液管吸取1 mL琼脂糖溶液，在平坦表面上将琼脂糖倾倒于已卷好的肠道组织上，注意避免组织中产生气泡。</li>
		<li>让琼脂糖冷却并凝固。使用剃刀刀片修去组织周围多余的琼脂糖。</li>
		<li>将肠道组织段放入组织处理/包埋盒中（尺寸应大于常规规格，以容纳因琼脂糖增加的高度），并在4 °C条件下浸入70%乙醇中。</li>
		<li>制备石蜡包埋组织切片，并按以下说明进行免疫染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 肠道免疫染色
<ol>
	<li>脱蜡
	<ol>
		<li>将载玻片置于染色架中，依次通过以下溶液：二甲苯中 3 分钟，新鲜二甲苯中再 3 分钟，二甲苯与 100% 乙醇（1:1）混合液中 3 分钟，95% 乙醇中 3 分钟，70% 乙醇中 3 分钟，以及 50% 乙醇中 3 分钟。</li>
		<li>用流动的冷水轻轻冲洗。随后将载玻片保存在自来水浴中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗原修复
	<ol>
		<li>完成脱蜡后，将载玻片置于染色架中，在抗原修复缓冲液（pH 6 的 0.01 M 枸橼酸三钠二水合物溶液，含 0.05% Tween-20）中煮沸，100 °C 持续 20 分钟。</li>
		<li>用冷水冲洗载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色
	<ol>
		<li>从水浴中取出载玻片，将组织面朝上放入带有湿润实验室擦拭纸/纸巾的载玻片盒中。用疏水性标记笔在组织周围画出轮廓。</li>
		<li>滴加含 0.025% Triton X-100 的 Tris 缓冲盐水（TBS），覆盖组织，孵育 5 分钟。重复此步骤一次。</li>
		<li>用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 牛血清白蛋白（BSA）的 TBS 在室温下封闭 2 小时。将载玻片侧立，用实验室擦拭纸吸除封闭液。</li>
		<li>加入一抗溶液，在 4 °C 孵育至少 2 小时或过夜。用移液器轻轻在组织上滴加约 200 µL 含 0.025% Triton X-100 的 TBS，轻柔洗涤。</li>
		<li>加入二抗溶液，在室温下孵育 1 小时。用移液器以 TBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗 3 次，操作同步骤 7.3.4。</li>
		<li>用封片剂封片，并加盖盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fat+feeding+rather+than+obesity+drives+taxonomical+and+functional+changes+in+the+gut+microbiota+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">High-fat feeding rather than obesity drives taxonomical and functional changes in the gut microbiota in mice.</a> Microbiome. 5 (1), 43(2017).</li>
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<li>Le Roy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+microbiota+engraftment+following+fecal+microbiota+transfer+in+mice+models%3A+age%2C+kinetic+and+microbial+status+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of microbiota engraftment following fecal microbiota transfer in mice models: age, kinetic and microbial status matter.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3289(2019).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fecal+microbiota+transplantation+alleviated+Alzheimer%27s+disease-like+pathogenesis+in+APP%2FPS1+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Translation+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Fecal microbiota transplantation alleviated Alzheimer's disease-like pathogenesis in APP/PS1 transgenic mice.</a> Translation Psychiatry. 9 (1), 189(2019).</li>
<li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+the+microbiota+in+CX%283%29CR1%28%2B%29+intestinal+mononuclear+phagocyte+regulation+of+intestinal+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Critical role for the microbiota in CX(3)CR1(+) intestinal mononuclear phagocyte regulation of intestinal T cell responses.</a> Immunity. 49 (3), 151-163 (2018).</li>
<li>Hintze, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+scope+method+for+creating+humanized+animal+models+for+animal+health+and+disease+research+through+antibiotic+treatment+and+human+fecal+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer.</a> Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).</li>
<li>Wilde, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tail-cuff+technique+and+its+influence+on+central+blood+pressure+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Tail-cuff technique and its influence on central blood pressure in the mouse.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (6), 005204(2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-fiber+diet+mitigates+maternal+obesity-induced+cognitive+and+social+dysfunction+in+the+offspring+via+gut-brain+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High-fiber diet mitigates maternal obesity-induced cognitive and social dysfunction in the offspring via gut-brain axis.</a> Cell Metabolism. 33 (5), 923-938 (2021).</li>
</ol>

作者声明不存在任何利益冲突，无论是经济方面还是其他方面。

研究肠道微生物群在心血管和代谢性疾病中因果作用的一个重要方法是将总微生物群或特定目标菌种移植到无菌小鼠体内。本文描述了从人类和普通饲养小鼠收集粪便样本并将其移植至无菌小鼠的实验方案，以研究肠道微生物群在高血压相关疾病中的作用。
在小鼠中，我们使用在厌氧环境中无菌采集的盲肠内容物；在人类中，则采集粪便样本。粪便微生物移植（FMT）可在样本仍新鲜时立即进行，也可将样本在液氮中速冻后保存于 -80 °C，待使用时取出。如果样本无法立即冷冻（例如人类在家中自行采集样本的情况），则必须使用核酸保护剂（如乙醇）进行保存。肠道中的大多数细菌为厌氧菌；在制备用于移植的粪便样本时，操作必须迅速，以避免细菌暴露于有氧环境，否则可能导致混合物中厌氧菌数量减少，从而降低移植效果27。对于纵向研究，应对所有样本同时进行宏基因组测序，以避免批次效应。用于FMT的样本可来自单个供体，也可将多个供体的样本混合后分配给不同实验组的多个受体。
在探讨机制意义之前，必须通过实验确认粪菌移植（FMT）是否成功，这一点极...

包括心脏病和中风在内的心脑血管代谢性疾病是全球首要的死亡原因1。体力活动不足、营养不良、年龄增长和遗传因素均可调节这些疾病的病理生理过程。越来越多的证据表明，肠道微生物群会影响心血管和代谢性疾病，包括2型糖尿病2、肥胖3和高血压4，这可能为这些疾病的新型治疗策略的开发提供关键线索。
微生物群导致疾病的精确机制仍不清楚，目前的研究结果差异较大，部分原因在于方法学的不同。粪便微生物群移植（FMT）是一种有效的方法，可用于明确整个微生物群或分离出的特定物种在疾病病理生理过程中的直接作用。FMT在动物研究中被广泛用于诱导或抑制某种表型。例如，通过将患病供体的粪便物质移植给健康受体，可以调节热量摄入和葡萄糖代谢5,6。在人类中，FMT已被证明是治疗复发性Clostridium difficile感染的一种安全选择7。支持其在心血管疾病管理中应用的证据正在不断出现；例如，将瘦型个体的粪便微生物群移植给代谢综合征患者可改善胰岛素敏感性8。在人类和啮齿类动物研究中，肠道菌群失调均与高血压相关9,10,11。将高盐饮食小鼠的粪便微生物群移植给无菌小鼠，会使受体小鼠易于发生炎症和高血压12。
尽管粪菌移植（FMT）在啮齿类动物中成功率较高，但其临床转化仍面临挑战。利用FMT治疗肥胖症和代谢综合征的临床试验表明，该疗法对这些疾病的作用甚微或无明显效果13,14,15。因此，仍需开展更多研究，以确定靶向肠道微生物群治疗心血管代谢性疾病的其他治疗途径。目前关于肠道微生物群与心血管疾病关系的大多数证据均为关联性研究。本文所述实验方案介绍如何结合粪菌移植（FMT）与瑞士卷技术，以同时验证疾病与肠道微生物群之间的关联性，并直接评估肠道各部位的完整性16,17,18。
本方法的总体目标是为研究肠道微生物组在实验性心血管疾病中的作用提供指导。该方案在实验设计方面提供了更详细的说明和关键注意事项，以促进生理学上的可转化性，并提高研究结果的严谨性和可重复性。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost</td><td>ThermoFisher</td><td>B40932</td><td></td></tr><tr><td>厌氧培养箱</td><td>COY</td><td>7150220</td><td></td></tr><tr><td>载脂蛋白 AI</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-52979</td><td></td></tr><tr><td>动脉剪 - 球头尖端</td><td>Fine Science Tools</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>漂白液</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-412-53</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>B14</td><td></td></tr><tr><td>CD3 抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>&amp;nbsp;14-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD68 单克隆抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>14-0681-82</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-004-221</td><td></td></tr><tr><td>CODA 高通量监测仪</td><td>Kent Scientic Corporation</td><td>CODA-HT8</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>一次性刻度移液管</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119AM</td><td></td></tr><tr><td>一次性注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA33361M1</td><td></td></tr><tr><td>饲喂针头</td><td>Fine Science Tools</td><td>18061-38</td><td></td></tr><tr><td>滤纸片</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-802</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林 (10%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-581</td><td></td></tr><tr><td>高盐饮食</td><td>Teklad</td><td>TD.03142</td><td></td></tr><tr><td>OMNIgene.GUT</td><td>DNAgenotek</td><td>OM-200+ACP102</td><td></td></tr><tr><td>渗透压微型泵</td><td>Alzet</td><td>&amp;nbsp;MODEL 2002</td><td></td></tr><tr><td>PAP笔</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z377821-1EA</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS4050</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-236-18C</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td></td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ61196AP</td><td></td></tr><tr><td>智能刮勺</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0133733</td><td></td></tr><tr><td>粪便采集装置</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-203-7255</td><td></td></tr><tr><td>TBS缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>R017R.0000</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>&lt;br/&gt; 9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Varimix平台摇床</td><td>Fisher Scientific</td><td>09047113Q</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-41</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Fisher Scientific</td><td>1330-20-7, 100-41-4</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠粪便分离与微生物群移植

Murine Fecal Isolation and Microbiota Transplantation

肠道菌群失调在心血管和代谢性疾病病理生理过程中起着重要作用，但其机制尚不明确。粪菌移植（FMT）是一种有效的方法，可用于阐明整体菌群或特定分离菌种在疾病病理生理中的直接作用。该方法对复发性Clostridium difficile感染患者是一种安全的治疗选择。临床前研究表明，调控肠道菌群是研究菌群失调与疾病之间机制联系的有力工具。粪菌移植可能有助于揭示以肠道菌群为靶点的新型治疗策略，用于心血管代谢性疾病的管理和治疗。尽管在啮齿类动物中成功率较高，但移植过程中仍存在转化医学方面的挑战。本研究旨在为探索肠道微生物组在实验性心血管疾病中作用的研究提供指导。本文详细描述了小鼠研究中粪菌样本的采集、处理、加工及移植的操作流程，并分别阐述了人源和啮齿类供体的样本采集与处理步骤。最后，我们介绍了结合瑞士卷技术和免疫染色技术，用于评估心血管疾病及其相关肠道菌群机制中肠道特异性形态学和完整性的变化。

上述步骤总结于图1。将小鼠盲肠内容物或人粪便重悬于无菌生理盐水中，制备混悬液，通过灌胃给予无菌小鼠（100 µL），前3天连续每天一次，之后每3天一次。在实验方案结束时，采用尾套法测量血压，随后处死小鼠，并采集组织以评估肠道微生物群以及心血管和代谢相关指标的变化。
选择微生物群的关键步骤之一是确保供体存在所关注的疾病表型，并且该表型与菌群失调相关。例如，高盐饮食与菌群失调及心血管功能障碍密切相关。本研究采用了一只喂食8% NaCl饮食的小鼠作为供体。高盐饮食引起的肠道微生物群变化包括细菌多样性降低（图2A），其聚类与正常盐摄入组的微生物群明显分离（图2B）。厚壁菌门/拟杆菌门比例也有所升高（图2C），提示高盐可诱导微生物群发生改变（改编自Ferguson等12）。
<p class="jov...

本研究的目的是概述一种用于探究心血管疾病中菌群失调机制的实验方案。本文介绍了如何无菌采集和移植小鼠粪便样本、分离肠道组织，以及采用“瑞士卷”法处理肠道，随后结合免疫染色技术分析胃肠道中的病理变化。

肠道菌群失调在心血管和代谢性疾病的病理生理过程中发挥一定作用，但其机制尚不明确。粪便...

本文介绍了一种实验方案，旨在指导研究人员从采集粪便样本到采用瑞士卷法研究肠道变化，系统探究疾病中菌群失调的机制。首先，用70%乙醇喷洒已处死小鼠的胸部和体侧，小心切开皮肤和腹腔，暴露消化道。分离盲肠后，使用无菌手术剪将其纵向剪开成两半。短暂暴露盲肠，并在回肠端近端0.5厘米处及与结肠连接处远端0.5厘米处进行切割。将分离的盲肠转移至无菌培养皿中。使用无菌刮勺将盲肠内容物转移至无菌管中，并将分装样品保存于-80°C冰箱中。取新鲜或先前冷冻的粪便颗粒，按1:20的比例悬浮于无菌生理盐水中，涡旋振荡至均匀。将匀浆通过30微米孔径的尼龙滤膜，以去除大颗粒物质。在79×g离心5分钟，收集上清液用于移植。将每只无菌受体小鼠每天经口灌胃100微升混悬液，连续三天，之后每三天灌胃一次，持续两周。将小鼠轻轻放入预热的小鼠固定器中的固定装置内，并使尾巴留在外侧。小心地用胶带固定上方，注意不要夹住小鼠，以免造成应激。将小鼠置于固定器中静置，并将其放置在尾套仪平台上，用遮盖物覆盖，适应 3 至 5 分钟。使用尾套体积描记法至少采集三轮收缩压测量值，并对每只动物所有轮次的测量值取平均，得到平均收缩压。无菌条件下采集安乐死小鼠的盲肠内容物。为了收获肠道及其他组织，需在小鼠体内定位相应组织，并用剪刀将其切除，以研究肠道微生物群在心脏代谢健康中的作用。在第一天，从肛门侧向胃侧解剖小鼠肠道，并将分离出的整个胃肠道置于含有磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中。轻轻从胃端拉出近端，用手去除周围的脂肪和结缔组织。分离小肠，并将每段小肠折叠成Z形锯齿状。随后剪切以获取十二指肠、空肠和回肠。通过剪切盲肠下方的肠段来分离结肠。剪除十二指肠、空肠、回肠和结肠。使用带有球形针头的注射器，小心地用PBS冲洗并清洗肠腔内部，避免撕裂肠道。将肠道置于滤纸上，并在滤纸左上角标记该肠段名称及“P”表示近端，或在左下角标记“D”表示远端。使用圆头剪刀纵向剪开肠道。将肠道在滤纸上展开，根据需要使用更多的PBS进行冲洗。将肠道夹在两张滤纸之间，并在靠近肠道的四个位置或角落用订书钉固定。浸泡于10%中性缓冲福尔马林溶液中，于室温下使用摇床以5 rpm振荡过夜。第二天，将预先配制的2%琼脂糖加入去离子水中，放入覆盖铝箔的烧杯中，用磁力搅拌器加热。为获取组织，先移除上层滤纸，从近端开始卷起肠道，使近端首先进入内部，并向内卷绕，确保肠腔也朝向载玻片内侧。根据需要使用一根或两根30号针头固定。使用一次性刻度移液管吸取1毫升琼脂糖，将琼脂糖倒在平坦表面上已卷好的肠段上，注意避免组织中产生气泡。待琼脂糖冷却凝固后，使用剃刀片修剪组织切片周围的多余琼脂糖。最后将肠道切片放入组织处理或包埋盒中，并在4°C条件下浸泡于70%乙醇中。此处展示了对正常盐饮食和高盐饮食小鼠盲肠内容物中物种生物多样性估计的结果。肠道微生物群在高盐饮食下的变化表现为细菌多样性降低。非度量多维尺度分析显示，正常盐饮食组与高盐饮食组小鼠的细菌分别聚集成独立的簇。高盐饮食与厚壁菌门与拟杆菌门比例升高相关。来自高盐饮食小鼠的粪便微生物群移植可使无菌小鼠更易发生血管紧张素II诱导的高血压。与接受正常盐饮食小鼠肠道微生物群的小鼠相比，接受高盐饮食诱导的肠道菌群失调小鼠的无菌小鼠收缩压显著升高。代表性图像显示了来自高脂血症但无或伴有蛋白尿小鼠的回肠载脂蛋白A-I染色结果。本方案将人类和啮齿类供体在粪菌移植实验中的关键考虑因素与操作步骤进行了系统整合。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

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