向幼年斑马鱼脑室微量注射脂多糖以评估神经炎症与神经毒性

神经炎症是多种神经系统疾病中的关键因素。因此，研究和开发替代性的体内神经炎症模型以促进病理发展研究具有重要意义。本文所述技术是一种通过活体成像深入理解脑部病理变化的优秀工具，也可用于快速高效地评估潜在的抗神经炎症药物。

使用显微注射针拉制仪，按照玻璃毛细管拉制的五步方案拉制玻璃毛细管，为注射做好准备。用镊子以适当角度将针尖打开至合适大小。用0.1毫升矿物油填充针头，确保无气泡存在。

取下显微注射装置钢针的螺帽。将玻璃针孔与钢针对齐，然后拧紧螺帽。将装有针头的显微注射装置安装到显微操作仪上。

调整显微注射装置的位置，使显微操作器能够在显微镜下灵活移动该装置。排出适量的石蜡油，以便使钢针进入毛细玻璃管。将含有PBS或脂多糖的注射溶液滴加到经70%乙醇灭菌的玻片上，并调节显微注射装置，使针尖插入液滴中。

将约两微升注射溶液吸入针头中。调整显微操作仪，使显微注射装置的针尖与高倍镜下观察的幼虫处于同一视野内。使用微波炉加热溶解2%琼脂糖的双蒸水溶液。

将熔化的琼脂糖倒入塑料培养皿中。使用塑料移液管将麻醉后的幼虫转移至涂有2%琼脂糖的塑料培养皿中央。将固定好的幼虫脑部朝上摆放，以便针头接触。

调整显微镜的放大倍数，使斑马鱼的脑室结构在视野中清晰可见。将针头小心地置于视顶盖上方。用70%乙醇清洁脑区，然后使用显微操作器缓慢地用针尖刺破斑马鱼脑部的皮肤。

踩下脚踏板，注入一纳升的1倍浓度PBS或不同浓度的脂多糖。注射后立即将幼虫转移至干净的E3培养基中。24小时后，收集幼虫用于显微成像、运动行为检测以及其他指标的测定。

在E3培养基中配制1.5%低熔点琼脂糖溶液，用微波炉加热至形成澄清液体。使用洁净的塑料移液管将幼虫转移至玻璃载片上，并尽可能去除多余水分。再用塑料移液管向幼虫中加入一滴1.5%低熔点琼脂糖溶液。

使用1毫升注射器针头来调整幼虫的方向。待琼脂糖冷却并凝固后，再开始成像。在脂多糖脑室内注射后24小时，进行基因表达标志物的检测。

使用两个1 mL注射器分离幼虫的头部区域，去除眼和卵黄囊部分。用组织研磨器在11,000转/分钟下，将头部组织与200 µL RNA提取试剂研磨5秒，随后采用氯仿-异丙醇法进行RNA提取。将RNA沉淀在空气中干燥5至10分钟，然后加入30 µL无RNA酶的水以溶解RNA沉淀。

按照文稿中所述，使用随机引物和逆转录酶合成 cDNA。接下来，利用市售的 RT-qPCR 试剂盒，在 qPCR 系统上进行实时 PCR，以检测目标基因的表达水平。在脂多糖脑室内注射后 24 小时，将斑马鱼幼鱼 individually 转移至 96 孔方形微孔板的各个孔中。

向每个孔中加入 300 微升 E3 培养基，然后将幼鱼在检测板中孵育 4 小时，以适应环境。将载有幼鱼的微孔板转移至斑马鱼追踪箱中。打开光源，并将幼鱼在检测箱中孵育 30 分钟，以适应环境。

使用自动视频追踪系统监测并记录斑马鱼的行为。对单个斑马鱼幼鱼记录12次，每次五分钟，并按照文本稿件中的描述定义总移动距离。经24小时处理后，与对照组和假手术组相比，向TgEtvmat2:GFP转基因斑马鱼幼鱼脑室注射一至五毫克每毫升的脂多糖可导致脑内RA神经元显著丢失。

转基因品系 elavl3:mCherry 斑马鱼在注射 2.5 至 5 毫克/毫升脂多糖后，其幼鱼脑神经元的荧光积分密度表现出显著变化，而注射 1 毫克/毫升脂多糖则未产生影响。此外，5 毫克/毫升脂多糖诱导了运动障碍，并在 60 分钟追踪期内降低了斑马鱼运动的总距离。与对照组和假处理组相比，2.5 至 5 毫克/毫升脂多糖处理后，斑马鱼幼鱼头部一氧化氮的生成量以及促炎性细胞因子的 mRNA 表达水平均有所升高。

每微升注射一至五毫克的脂多糖可诱导中性粒细胞向幼年斑马鱼大脑募集，导致Tgmpo:eGFP斑马鱼脑区中性粒细胞数量显著增加。微注射过程中针头开口大小、注射力度以及斑马鱼头部与眼和身体的分离程度对于该操作至关重要。