Name: 肠系膜上动脉闭塞的肠缺血再灌注损伤的啮齿动物模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-20T14:05:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: 学习肠系膜上动脉闭塞法建立啮齿动物肠缺血再灌注损伤模型，用于研究肠道缺血病理机制。该手术方法通过夹闭SMA诱导缺血，再恢复血流，为开发治疗策略提供可靠的临床前研究平台。

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本项目由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所所内研究部提供资助。
我们感谢 James Hawkins 博士在本研究中的指导与支持。同时感谢 Mihai Oltean 博士和 Robert Linford 博士在定位肠系膜上动脉过程中提供的帮助。我们还要特别感谢 Patricia Carvalho Obeid Ellrich 博士、Claudio Correa Natalini 博士和 George Howell III 博士在本实验方案开发过程中提供的专业意见。最后，我们感谢 Stephen Wincovitch 在获取本文所展示的精美显微照片方面给予的协助，以及 Alicia Olivier 博士在图像标注和最终图示绘制方面提供的帮助。

本研究所述操作程序已获得美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所动物护理与使用委员会的批准，并符合《公共卫生服务关于实验动物人道护理与使用的政策》、《动物福利法》以及《实验动物护理与使用指南》中规定的各项要求。
1. 手术准备
<ol>
	<li>遵循无菌操作规程。佩戴口罩、头罩和洁净的连体服/实验服/手术服。</li>
	<li>准备以下已灭菌的材料：手术器械（参见材料表）、温热生理盐水、棉签、纱布、外科缝合钉、手术巾和手套。另需准备无需灭菌的手术胶带。使用高压灭菌或环氧乙烷灭菌技术对材料进行灭菌。</li>
	<li>在手术区域放置加热循环水毯，并用无菌毛巾或手术巾覆盖。</li>
	<li>使用精密异氟烷挥发器、加压医用空气（21% O2）以及专为小鼠设计的带有鼻罩的半封闭式非重复呼吸回路，以提供手术麻醉。</li>
</ol>
2. 动物准备
<ol>
	<li>在诱导室中通过输送含21% O₂的2%-4%异氟烷使小鼠麻醉2 以每升舱体体积0.5 L/min的速率提供医用空气。 
	注意：最好使用 21% O₂2 医用空气含氧量超过100% O₂2 对于该特定模型，通过用O₂饱和血液2 可能会干扰缺血再灌注损伤（IRI）。</li>
	<li>将小鼠从舱室中取出，移至与手术区域分离的清洁表面。为其佩戴鼻罩，以供给1.5%异氟烷和21% O₂2 医用空气。</li>
	<li>在颈胸背部皮下注射1 mg/kg的丁丙诺啡。</li>
	<li>腹腔内注射200-600 IU/kg肝素，以预防阻塞期间血栓形成。</li>
	<li>涂抹眼药膏以防止角膜损伤。</li>
	<li>使用电推剪去除腹部腹侧的毛发。</li>
	<li>将小鼠移至手术区域的加热水毯上。再次连接鼻罩，通入含1.5%异氟烷和21% O₂的气体2 医用空气以达到外科麻醉平面。</li>
	<li>将小鼠置于仰卧位，用手术胶带将其四肢固定在实验台上。</li>
	<li>使用专用于啮齿类动物的体温计经直肠监测动物体温。在整个手术过程中，将体温维持在36.5 ± 0.5 °C。</li>
	<li>使用浸有氯己定消毒液或聚维酮碘消毒液的无菌纱布对腹部腹侧进行消毒，随后使用70%酒精。重复此步骤三次，交替使用消毒液和酒精。每次均应使用新的消毒液和酒精纱布。
	<ol>
		<li>以圆形方式涂抹消毒刷洗剂和酒精，从手术区域中心开始做小圈运动，逐渐扩大圆圈范围，向边缘移动。到达手术区域边缘后，丢弃纱布。切勿从边缘向中心方向回擦。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过脚趾捏压测试（足底反射）确认动物已完全麻醉。</li>
	<li>戴上无菌手套。无菌铺巾覆盖手术区域。</li>
</ol>
3. 手术与缺血
<ol>
	<li>使用#15手术刀片在皮肤上做一条3-5厘米长的腹正中矢状切口，将皮肤与下方的肌筋膜分离，并向侧方牵开。沿腹白线用显微解剖剪刀或弹簧式显微剪刀继续切开腹壁，并放置牵开器固定位置。</li>
	<li>在手术区域周围放置用温热无菌生理盐水浸湿的无菌纱布垫。</li>
	<li>将小肠从腹腔中取出，向头侧及动物左侧翻转，并置于湿润的纱布垫上。在组织上方再覆盖一块湿润的纱布垫以防止干燥。定期向纱布滴加温热无菌生理盐水，以保持组织湿润。</li>
	<li>分离肠系膜上动脉（SMA），该动脉位于下腔静脉腹侧、腹腔动脉尾侧和肾动脉头侧。 
	注：图1 显示了手术过程中分离SMA的位置。正常情况下，SMA位于下腔静脉腹侧并朝向右侧延伸。当手术中将肠道外翻并向左侧翻转时，SMA位于下腔静脉左侧。</li>
	<li>在SMA从腹主动脉分出的根部放置无创性微血管夹，确保夹闭时不阻塞肠系膜上静脉。</li>
	<li>通过观察小肠颜色由粉红色变为苍白以及肠系膜搏动消失来确认缺血状态。</li>
	<li>在缺血期间，将内脏复位至腹腔内的原始位置。移除牵开器，并用湿润纱布覆盖切口。定期向纱布添加温热无菌生理盐水，以防止组织干燥并维持体温。</li>
	<li>在缺血45分钟后（以首次应用血管夹为起始时间点），移除阻断血管夹。通过观察肠系膜搏动恢复及组织颜色转为充血红润来确认血流再灌注。</li>
	<li>在最终关闭腹腔前，向腹腔内注射温热无菌生理盐水，以维持适当的水合状态。</li>
	<li>使用6-0聚乳酸羟基乙酸共聚物（polyglactin 910）缝线缝合腹壁肌肉层。沿肌肉切口线给予布比卡因（剂量不超过2 mg/kg）以缓解疼痛。使用外科缝钉或伤口夹闭合皮肤。</li>
</ol>
4. 恢复与再灌注
<ol>
	<li>将小鼠放回温暖的饲养箱或笼子中，置于循环水毯、暖手袋或其他适当的热源上。根据饲养箱体积，以每升0.5 L/min的流速输送21% O2。让小鼠在此环境中恢复90分钟。每5-10分钟观察一次小鼠是否有疼痛或痛苦的迹象，例如弓背姿势、眯眼和不愿活动。</li>
</ol>
5. 安乐死与采血
<ol>
	<li>在90分钟恢复期结束时，将小鼠放回诱导室，以0.5 L/min的腔室体积流速输送含21% O2的2%-4%异氟烷，重新诱导完全麻醉。</li>
	<li>将动物转移回手术区域，并连接鼻罩，输送含21% O2的2%-4%异氟烷以达到深度麻醉。 
	注意：CO2 不适用于本操作的安乐死方法，因其可诱导生理变化，可能干扰缺血性损伤或组织分析物13。</li>
	<li>重新打开腹正中切口，使用23 G针头和注射器从腹腔静脉尽可能采集血液，进行终末放血。预期可采集0.3–0.5 mL血液（经历缺血再灌注损伤的小鼠采血量较少，假手术开腹小鼠采血量较多）。 
	注意：终末放血的目的是辅助人道安乐死，并采集和保存血液用于后续检测（如血清生化、PCR、ELISA）。</li>
	<li>采血完成后，切断腹主动脉，以实现完全放血。</li>
	<li>采用颈椎脱位或开胸术作为辅助措施，确保安乐死成功。</li>
</ol>
6. 组织学样本的组织处理
<ol>
	<li>安乐死后，立即采集所需组织。确保迅速进行组织处理，因为死亡后自溶过程会立即开始。14,15.
	<ol>
		<li>肠道：取整个小肠和大肠，弃去盲肠。</li>
		<li>肝脏：采集左侧叶、左中叶和右中叶&#160;叶</li>
		<li>肾脏：采集双侧肾脏。按照惯例，解剖时将左肾沿纵轴切开，右肾则进行横切。 
		注意：结肠、肝脏和肾脏可用于评估缺血-再灌注损伤（IRI）引起的多器官功能衰竭或其他全身性效应。小肠用于评估原发性损伤。肝脏叶和肾脏的各个部分无需单独追踪，因每个器官将作为一个整体单元进行分析和评分。然而，肠段应保持分离，随后分别标记并单独评分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将肠道分为四个部分：十二指肠、空肠、回肠和结肠。确保三个小肠节段长度相等，可通过将小肠折叠成“U”形来实现 &#34;Z&#34; 形状，其中顶线为十二指肠，中线为空肠，底线为回肠。需注意区分近端与远端。</li>
	<li>使用连接20 G套管针的10 mL注射器，以生理盐水冲洗肠段管腔。</li>
	<li>在制备切片前，将每段肠组织平铺，使管腔面朝上。使用连接27 G针头的3 mL注射器，逐滴加入足量10%中性缓冲福尔马林，以完全覆盖黏膜全长。随后，将每段肠组织单独卷起，并放入已标记的组织包埋盒中。
	<ol>
		<li>进行卷制时，将每个肠段平铺，使管腔面朝上，然后以牙签为轴进行环形卷绕。近端部分应位于卷的内侧，管腔朝向内侧或中心。卷制过程中应尽量轻柔，避免压迫绒毛。</li>
		<li>当卷起时，肠道应呈瑞士卷状。将瑞士卷的螺旋面朝上放入包埋盒中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将组织放入装有10%中性缓冲福尔马林的已标记小瓶中，在室温下进行固定。宁可过度固定，不可固定不足。小瓶应足够大，并含有足量福尔马林，固定液体积至少应为组织体积的20倍。
	<ol>
		<li>肠道：将四个包埋盒一同放入标本杯中，固定24–48小时。</li>
		<li>肝脏：将肝叶合并置于50 mL锥形管中，固定24–48小时。</li>
		<li>肾脏：将肾脏置于一个50 mL锥形管中，固定48–72小时。 
		注意：未修整的肾脏比修整后的肾脏需要更长的固定时间。为将固定时间缩短至24–48小时，可将肾脏沿正中面纵向切开（左肾）和横向切开（右肾），放入包埋盒后置于福尔马林中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织经福尔马林固定指定时间后，用磷酸盐缓冲液（PBS）或蒸馏水冲洗，并转移至装有70%乙醇的标记小瓶中。组织可在乙醇中于室温下长期保存，以待后续进行组织学处理。
	<ol>
		<li>肠道：将四个包埋盒一起放入一个标本杯中。</li>
		<li>肝脏：将肝叶合并置于一个50 mL锥形管中。</li>
		<li>肾脏：将肾脏置于一个50 mL锥形管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备好后，将组织用苏木精和伊红（H&amp;#38;E) 染色。将经福尔马林固定的组织修整后包埋于石蜡中。在载玻片上制备5微米切片，并进行H&amp;#38;E.</li>
</ol>
7. 组织评分
<ol>
	<li>组织评分应由对样本分组不知情的有经验人员进行。</li>
	<li>肠道缺血采用 Chiu/Park 评分系统17进行评分。</li>
	<li>肾脏损伤采用 Jablonski 评分系统18,19进行评分。</li>
	<li>肝脏损伤采用 Suzuki 评分系统20,21进行评分。 
	注意：目前在肠道缺血-再灌注（IRI）啮齿类动物模型中，有多种评分系统用于评估组织损伤。本研究选用的评分系统旨在尽量减少主观估计，并最大限度地提高有目的的定性评估（表 1）。</li>
</ol>

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</ol>

本文作者无任何利益冲突需要披露。

尽管这种肠道缺血-再灌注损伤模型被广泛使用，但它也存在一些局限性。例如，仅阻断肠系膜上动脉（SMA）根部并不能完全阻断肠道的血流，这可能是由于肠系膜存在广泛的侧支循环，能够从腹主动脉的邻近分支获取血液。在一项猫的研究中，SMA 阻断使近端十二指肠的血流量减少了 35%，远端十二指肠减少了 61%，空肠和回肠减少了 71%，近端结肠减少了 63%；而中段和远端结肠的血流未见减少，因其大部分血供来自肠系膜下动脉23。在啮齿类动物中，空肠和回肠通常被认为是 SMA 阻断后发生最显著组织损伤的肠段9。
文献中报道的肠系膜上动脉（SMA）闭塞后缺血时间范围较广，从1分钟到90分钟甚至更长。不同的缺血时间会导致不同程度的再灌注损伤；Park等人观察到，当缺血时间介于40至60分钟之间时会出现再灌注损伤，而当缺血时间更短或更长时则未观察到该现象24。这些结果提示，过短的缺血时间不足以引发再灌注损伤，而过长的缺血时间则对组织造成严重损伤，以致无法表现出随后的再灌注损伤。此外，较长的缺血时间还伴随更高的死亡风险。如本研究所示，最初接受60分钟缺血处理的小鼠中有50%（3/6）在仅90分钟再灌注后即死亡。将缺血时间缩短至45分钟可使死亡率降至20%（1/5），且不改变组织损伤评分。根据本研究结果，通过约45分钟的SMA闭塞可达到理想的缺血损伤时间窗。
另一个变量是组织采集前的再灌注时间。与缺血时间类似，不同研究中再灌注时间差异较大，从60分钟到超过24小时不等。已有数篇文献报道，肠道黏膜在再灌注2至3小时时出现最严重的形态学损伤，而在24小时时可完成修复25,26,27。若在2至3小时的时间窗之前采集组织，可能无法充分捕捉再灌注损伤的全部程度；而在接近24小时时采集的组织则可能已开始修复过程。我们最初选择120分钟的再灌注时间，随后为降低死亡率改为90分钟。这一调整并未改变组织损伤的结果，表明偏离2至3小时时间窗30分钟仍可接受。
氧浓度也是缺血-再灌注损伤（IRI）发展过程中的一个重要变量。Wilding 等人发现，与接受21% O2的小鼠相比，使用100% O2作为载体气体输送异氟烷进行麻醉的小鼠由于肺不张导致通气-血流匹配失调。在同一项研究中，接受100% O2的大鼠出现了急性呼吸性酸中毒以及平均动脉压升高28。在诱导涉及多种全身因素的损伤（如IRI）时，应尽量避免此类生理变化。因此，在输送异氟烷时，21% O2作为载体气体似乎比100% O2更为合适。
在本方案中使用肝素存在争议。已知肝素具有抗凝血和抗炎作用29。我们发现，将缺血时间从60分钟、再灌注时间从120分钟改为45分钟缺血和90分钟再灌注，并使用400 IU/kg肝素，虽未改变肠道显微损伤程度，但降低了死亡率。一种可能的解释是肝素预防了向肺、脑等远端器官发生的致死性血栓栓塞，然而我们在最初两只死亡小鼠的尸检中，通过肉眼观察和显微镜检查均未发现此类证据。在不使用肝素的情况下采用更短的缺血和再灌注时间，可能同样有效降低死亡率。如果情况确实如此，则应谨慎考虑避免使用肝素，以尽量减少对缺血-再灌注损伤（IRI）的干扰。然而，对于希望模拟手术相关IRI病因的研究者而言，在方案中加入肝素可能是合适的，因为外科患者通常在围手术期接受肝素治疗。
异氟烷在肠道炎症和缺血情况下已被证明具有组织保护作用，其使用可能干扰临床相关的缺血-再灌注损伤（IRI）模型30,31,32。然而，有机氟吸入性麻醉剂（即异氟烷、七氟烷）在兽医和人类医学中均被广泛用作麻醉药物。此外，本实验方案所需的麻醉时间超过120分钟，因此使用吸入性麻醉剂比作用时间较短、需重复给药的注射类麻醉剂更为合适。
近端结肠、肝脏或肾脏中均未发现显微镜下病变。显微镜下未见改变可能是由于再灌注时间相对较短，仅为90至120分钟。此外，近端结肠的血液供应来自肠系膜下动脉。然而，缺乏可见损伤并不能排除系统性损伤的存在。逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）可能是通过检测TNF-α等炎症细胞因子来证明系统性损伤的更优方法。
多年来，已开发出多种该肠道缺血-再灌注损伤（IRI）模型的变体。1990年，Megison等人证明，除了闭塞肠系膜上动脉（SMA）外，同时闭塞其侧支血管可更一致地减少肠系膜血流，但会增加死亡率33。最近的一项研究表明，无需在SMA起始处闭塞，而是结扎其外周支和侧支血管以诱导远端回肠缺血，可产生可重复的损伤且无死亡率34。闭塞局部动脉分支可确保最大程度的缺血，并可能解决仅在SMA起始处结扎时所出现的多灶性、节段性血流减少问题。尽管这种替代性肠道IRI建模方法适用于研究肠道IRI对局部组织的影响，但尚不清楚其是否能准确模拟与肠道损伤相关的全身性炎症反应和多器官功能衰竭。
肠系膜上动脉（SMA）阻塞并非适用于所有类型肠道缺血-再灌注损伤（IRI）的模型。例如，非阻塞性肠系膜缺血的特征是由于心输出量减少导致的内脏低灌注。因此，该技术不适合用于研究由心肌梗死、充血性心力衰竭、主动脉瓣关闭不全或肾或肝疾病引起的肠道IRI35。Kozar 等人报道，然而，SMA阻塞是临床上与休克诱导的肠道IRI相关的有效模型36。尽管成本较高，使用猪等其他物种可能在模拟某些肠道损伤情况方面优于啮齿类动物。Gonzalez 等人于2014年发表的综述全面描述了目前用于研究肠道IRI的动物模型9。
尽管存在局限性，但在肠系膜上动脉根部进行阻断的技术仍是目前最常用的肠道缺血啮齿类动物模型之一9。该手术仅需一个血管夹和基本的实验设备，操作本身较为简便。此外，其造成的损伤具有良好的可重复性，本文所提供的数据已证实了这一点。啮齿类动物的肠系膜上动脉阻断能够可靠地模拟肠道缺血-再灌注损伤（IRI）的阻塞性病因，在兽医学和人类医学中均具有实际应用价值。因此，确保本文所述操作步骤的一致性至关重要。

缺血-再灌注损伤（IRI）可发生在任何器官，包含两个相继发生的阶段。初始阶段为血流中断，导致受累组织发生缺血；随后的再灌注过程则会引发进一步的细胞损伤。再灌注所造成的损害通常超过缺血本身引起的损伤1。IRI 的病理生理过程涉及一系列复杂的级联反应，其中最显著的是在再灌注期间氧气重新引入后产生的自由基形成2。炎症细胞的活化及细胞因子的释放也参与其中2。在肠道 IRI 情况下，内皮损伤后细菌易位进入血液循环，可导致全身性炎症反应综合征2。若 IRI 所致损伤足够严重，继发的全身效应可引起多器官功能衰竭3。
肠缺血再灌注损伤（IRI）病例与高发病率和高死亡率相关4,5,6。&#160;肠IRI在兽医学和人类医学中均与多种病理状况及外科手术相关。在兽医学中，动物尤其容易发生肠IRI相关疾病，例如胃扩张扭转（GDV）、肠系膜扭转和绞窄性肠梗阻7,8。在人类中，IRI是腹主动脉瘤手术、绞窄性疝、急性肠系膜缺血、肠扭转、创伤、休克、新生儿坏死性小肠结肠炎以及小肠切除或移植等临床情况中的主要且常见问题9。
大多数关于肠道缺血-再灌注损伤（IRI）的体内啮齿类动物研究涉及阻断肠系膜上动脉（SMA）根部，SMA是腹主动脉的一个分支，为大部分小肠及大肠近端提供血液供应10,11,12。尽管该模型应用广泛且相对简单，但目前尚未发表使用吸入麻醉剂并在21% O2医用空气条件下进行的详细实验方案。缺乏标准化操作流程给不熟悉该技术的研究人员带来困难，并影响不同研究之间的结果一致性。本文展示了在8至14周龄的雄性和雌性Swiss Webster小鼠中建立肠道IRI手术模型所需的操作步骤。该肠道IRI模型可产生可重复的组织损伤，其一致性组织病理学结果已证实了该模型的可靠性。

<table><tbody><tr><td>Adson镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5236</td><td>外科手术器械</td></tr><tr><td>阿尔姆拉钩</td><td>Roboz</td><td>RS-6510</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>麻醉机</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>Aestiva 5</td><td></td></tr><tr><td>麻醉：异氟烷</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 10019-360-40</td><td>剂量：1-4%，INH</td></tr><tr><td>Angiocath 20 g&amp;nbsp; × 2</td><td>Smiths Medical</td><td>5057</td><td>用生理盐水和甲醛冲洗肠道</td></tr><tr><td>无创显微血管夹</td><td>Teleflex</td><td>065100</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>10% 缓冲福尔马林</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245684</td><td>组织固定</td></tr><tr><td>0.25% 布比卡因</td><td>Hospira, Inc.</td><td>NDC 0409-1160-18</td><td>剂量：以滴注方式给予，最高可达2 mg/kg</td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Par制药</td><td>NDC 42023-179-05</td><td>剂量：1 mg/kg，皮下注射</td></tr><tr><td>氯己定擦洗液 2%</td><td>Vet One</td><td>510083</td><td>手术部位准备</td></tr><tr><td>循环水毯</td><td>辛辛那提超低温设备公司</td><td>Blanketrol 2</td><td>体温维持</td></tr><tr><td>毛发剪刀 - Wahl BravMini，紫色毛发剪刀</td><td>Lambert Vet Supply</td><td>008WA-41590-0438</td><td>手术部位准备</td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>组织固定与保存</td></tr><tr><td>干冰</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>PCR 组织样本</td></tr><tr><td>EtOH 200 证明</td><td>华纳-格雷厄姆公司</td><td>64-17-5</td><td>组织储存</td></tr><tr><td>肝素（可选）</td><td>Meitheal Pharmaceuticals</td><td>NDC 71288-402-11</td><td>剂量：200-600 IU/kg</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>VetEquip</td><td>941456</td><td></td></tr><tr><td>Indus Instruments THM100 啮齿类动物监测仪</td><td>Indus Instruments</td><td>N/A</td><td>用于手术期间监测啮齿类动物体温</td></tr><tr><td>70% 异丙醇</td><td>Humco</td><td>NDC 0395-4202-28</td><td>用于清洁手术部位</td></tr><tr><td>微量离心管：0.6 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-121</td><td>PCR 组织样本，每只小鼠 8 个，终末采血，血清储存</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>微软</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>鼻锥</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>可用注射器管或气泡管自制</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;医用空气 21%</td><td>罗伯茨氧气</td><td>N/A</td><td>流速：每个L型培养室体积0.5 L/min</td></tr><tr><td>眼用软膏</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NDC 17478-062-35</td><td>手术准备</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-031</td><td>用于组织清洗及配制70%乙醇</td></tr><tr><td>样本杯</td><td>Cardinal Healthcare</td><td>C13005</td><td>用于在福尔马林中固定组织包埋盒</td></tr><tr><td>无菌卡斯特罗维霍持针器</td><td>Roboz</td><td>RS-6412</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Medline</td><td>BXTA50002Z</td><td></td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Medline</td><td>PRM21423Z</td><td></td></tr><tr><td>无菌显微解剖剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5980</td><td>外科手术器械</td></tr><tr><td>无菌显微解剖弹簧剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5693</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>无菌微型镊子</td><td>Roboz</td><td>RS-5264</td><td>手术器械</td></tr><tr><td>无菌生理盐水（0.9%）</td><td>布劳恩</td><td>R5201-01</td><td>必须预热</td></tr><tr><td>无菌手术刀片 #15</td><td>Cardinal Health（Allegiance）</td><td>32295-015</td><td>外科手术器械</td></tr><tr><td>无菌手术刀柄</td><td>Roboz</td><td>RS-9843</td><td>外科手术器械</td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td>Medline</td><td>MSG2270</td><td></td></tr><tr><td>无菌外科缝合器</td><td>Roboz</td><td>RS-9260</td><td>外科手术器械</td></tr><tr><td>无菌外科缝合钉</td><td>Roboz</td><td>RS-9262</td><td>腹部皮肤缝合</td></tr><tr><td>无菌缝线：Vicryl（聚乳酸-羟基乙酸共聚物910）6-0，27&quot; Taper RB-1 针头</td><td>Ethicon</td><td>J212G</td><td>闭合腹肌</td></tr><tr><td>手术胶带</td><td>Medline</td><td>MMM15271Z</td><td>将小鼠固定于仰卧位</td></tr><tr><td>10 ml 注射器 × 2</td><td>Medline</td><td>SYR110010</td><td>用生理盐水和甲醛冲洗肠道</td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-665</td><td>卷状肠段，每只小鼠4段。</td></tr><tr><td>毛巾或铺巾</td><td>Medline</td><td>GEM2140</td><td>水毯覆盖</td></tr></tbody></table>

通过闭塞肠系膜上动脉建立肠道缺血-再灌注损伤的啮齿类动物模型

Rodent Model of Intestinal Ischemia-Reperfusion Injury via Occlusion of the Superior Mesenteric Artery

肠缺血-再灌注损伤（IRI）在兽医学和人类医学的多种疾病中均有发生。在犬和马等动物中可观察到诸如胃扩张-扭转（GDV）、肠系膜扭转和绞痛等肠IRI疾病。初始的血流中断导致组织发生缺血。尽管随后的再灌注对于挽救有活力的组织至关重要，但这一过程可能引发进一步的损伤。造成IRI的主要机制是在再灌注过程中氧气重新进入受损组织，从而产生自由基，但还有许多其他因素参与其中。由此产生的局部和全身效应通常导致预后不良。
在过去50年中，肠道缺血再灌注损伤（IRI）一直是广泛研究的课题。目前研究肠道IRI最常用的方法是建立一种in vivo啮齿类动物模型，通过暂时结扎肠系膜上动脉（SMA）根部来实现。本文描述了一种采用异氟烷麻醉并在21% O2医用空气条件下实施的肠道IRI模型，该模型可产生可重复的损伤，小肠组织病理学结果具有一致性。此外，还评估了结肠、肝脏和肾脏的组织损伤情况。

我们建立了一种小鼠肠道缺血-再灌注损伤（IRI）模型，获得了稳定且可重复的实验结果。将小肠、近端结肠、肾脏和肝脏组织切片并进行苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色。由兽医病理学家使用前述评分系统（表1）对组织损伤程度进行分级。采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验及两两比较，以确定组内和组间数据是否存在显著差异。以p值小于或等于0.05作为判定统计学显著性的阈值。所有统计分析及图表绘制均在电子表格软件（例如 Microsoft Excel）中，借助 Real Statistics Resource Pack 插件完成。数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。
与接受假手术开腹术（Sham；N = 6）的动物相比，经历肠缺血-再灌注损伤（IRI；N = 7）的动物其三个小肠节段（十二指肠、空肠和回肠）的显微病变评分显著升高（图2 和 图3）。这些数据的标准误范围较窄，表明组内及组间结果具有一致性。假手术组中每个小肠节段的平均Park/Chiu评分均为0.83。假手术组十二指肠、空肠和回肠的标准误（SEM）分别为0.31、0.40和0.31。IRI组十二指肠、空肠和回肠的平均Park/Chiu评分分别为4.07 ± 0.44、4.14 ± 0.46和5.14 ± 0.40。
在本研究中，最初接受60分钟缺血和120分钟再灌注（60/120组）的小鼠中有50%（3/6）死亡。对其中3只死亡小鼠中的2只进行了尸检。这两只小鼠均出现小肠上皮坏死、充血和出血。此外，小鼠还存在淋巴细胞溶解，这是一种与生理应激相关的非特异性改变。这两只小鼠的心脏、肺、肝或肾脏均未发现病灶。将缺血时间缩短至45分钟、再灌注时间缩短至90分钟，并添加400 IU/kg肝素（45/90/H组）后，死亡率降至20%（1/5），且肠道损伤评分未发生改变（图4）。60/120组的平均Park/Chiu评分为4.56 ± 0.38（N = 3），45/90/H组的平均评分为4.375 ± 0.38（N = 4）。
在60/120小鼠和45/90/H小鼠中，均未观察到近端结肠、肝脏和肾脏存在损伤的显微镜下表现。
表1：肠道、肾脏和肝脏的评分系统。 肠道损伤采用Chiu/Park系统进行分级17。肾脏损伤采用Jablonski评分系统进行分级18,19。肝脏损伤采用Suzuki评分系统进行分级20,21。本表经许可改编自Quaedackers等17、Du等19和Behrends等21中提出的评分系统。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/Table 1 - Scoring Systems.zip" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig01.jpg" /> 
图1：肠系膜上动脉（SMA）的位置与分离。（A）通常情况下，肠系膜上动脉位于下腔静脉腹侧，并向动物右侧延伸，位置介于腹腔动脉与肾动脉之间。本图经许可改编自Margaret Cook（1965）所著《实验小鼠解剖学》&#160;22。（B）在此操作中，将肠管外翻并移至左侧（图中以湿润纱布覆盖），使肠系膜上动脉（黄色箭头）位于下腔静脉（蓝色箭头）左侧。缩写：RK = 右肾；D = 十二指肠。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig02.jpg" /> 
图2：经苏木精-伊红染色的小肠节段。 假手术组小鼠的空肠（A）和回肠（B）切片显示绒毛细长且形态完整，无扭曲。缺血-再灌注损伤组小鼠的空肠（C）和回肠（D）切片可见坏死区域（星号标记）和出血，残留绒毛变钝且形态扭曲（箭头所示）。照片来自经历45分钟缺血和90分钟再灌注并接受400 IU/kg肝素处理的小鼠。照片拍摄条件为20倍物镜，10%数码变焦。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig03.jpg" /> 
图3：空肠各肠段的Park/Chiu评分。 接受肠缺血-再灌注损伤（IRI）的动物，其三个肠段（十二指肠、空肠和回肠）的显微镜下损伤程度均显著高于接受假手术开腹术（Sham）的动物。* p&#160;&#60; 0.05，表示IRI组与Sham组相比具有显著性差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64314/64314fig04.jpg" /> 
图4：接受60分钟缺血和120分钟再灌注与45分钟缺血和90分钟再灌注（肝素剂量为400 IU/kg）的小鼠小肠Park/Chiu评分。 将缺血-再灌注时间从60分钟缺血和120分钟再灌注（60/120）缩短至45分钟缺血和90分钟再灌注并联合使用400 IU/kg肝素（45/90/H），并未导致IRI组小鼠小肠Park/Chiu损伤评分出现统计学显著差异。然而，该调整确实使死亡率从50%降低至20%。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64314/64314fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述了如何在啮齿类动物中建立一种广泛应用的肠道缺血-再灌注损伤（IRI）外科模型。该操作包括阻断肠系膜上动脉，随后恢复血流。此模型对于研究兽医学和人类医学中肠道IRI的闭塞性病因具有重要价值。

肠缺血-再灌注损伤（IRI）在兽医学和人类医学中与多种疾病状态相关。肠IRI状况……

首先佩戴口罩、头罩以及洁净的实验服或刷手服。接着，将已麻醉的小鼠置于与手术区域分离的清洁表面上，并连接鼻罩，以供给含21%氧气的1.5%异氟烷。然后，在小鼠颈背部皮下注射布托啡诺。在阻塞期间，还需将肝素注射至腹腔内，以预防血栓形成。将眼用软膏涂抹于眼睛，防止角膜损伤，并使用电推剪去除腹部腹侧的毛发。将小鼠转移至手术区域的加热水毯上。再次安装输送异氟烷的鼻罩。接着，将小鼠置于仰卧位，并用手术胶带将其四肢固定在手术台上。使用专用于啮齿类动物的直肠温度计监测动物的体温。彻底消毒腹部后，进行足趾夹捏测试以确认动物已完全麻醉。最后，戴上无菌手套，并对手术部位进行无菌铺巾。首先，使用15号手术刀片在皮肤上做一道3至5厘米长的腹正中切口。将皮肤边缘与下方肌肉筋膜分离约0.5厘米，以便后续放置缝合钉。然后使用弹簧式显微剪刀沿腹白线继续切开腹壁，并置入牵开器。用温热的无菌生理盐水浸湿的无菌纱布垫围绕手术区域。将小肠从小鼠腹腔中取出，将其翻转至头侧并移向动物左侧，放置在湿润的垫巾上。用另一块湿润的纱布覆盖组织，以防止干燥。在腹腔动脉远端、肾动脉近端的下腔静脉腹侧找到肠系膜上动脉（SMA）。将其从周围结缔组织中游离出来。在SMA从腹主动脉分出处的基底部放置一个无创性微血管夹。通过观察小肠颜色由粉红色变为苍白白色来确认缺血状态。在缺血期间，将内脏复位至腹腔内的原始位置。移除拉钩，并用湿润纱布覆盖切口。缺血45分钟后，移除阻断夹。通过观察肠系膜搏动及颜色转为红润来确认血流恢复。腹腔内给予温热的无菌生理盐水，以维持适当的水合状态。然后用6-0聚乳酸羟基乙酸共聚物910缝线缝合腹壁肌肉。沿肌肉切口线局部给予布比卡因以缓解疼痛。使用外科缝钉或伤口夹闭合皮肤。将小鼠放回循环水毯的保温舱中，让其恢复90分钟，并监测小鼠是否有疼痛或不适的迹象。实施人道安乐死后，采集所需组织，如肝叶，包括左外侧叶、左中叶和右中叶。然后取出双侧肾脏。将左肾沿纵轴切开，右肾作横切面切开。最后，完整取出小肠和大肠的全长。为了将小肠段分成等长的部分，将小肠折叠成Z形，其中上部为十二指肠，中部为空肠，下部为回肠。剩余的肠段为结肠。使用装有20号套管针的10毫升注射器，以生理盐水冲洗肠段的管腔。接下来，使用显微解剖剪将肠管沿长度方向剪开，并将每段肠组织平铺，使管腔面朝上。用连接27号针头的3毫升注射器，将10%中性缓冲福尔马林液以滴加方式充分覆盖整个黏膜表面。然后将每段肠组织沿周向围绕牙签卷起，确保近端部分位于卷的内侧，且管腔朝向内侧。卷绕后，肠段应形似瑞士卷。将各个瑞士卷的螺旋面朝上，分别放入已标记的组织包埋盒中。最后，将组织置于装有10%缓冲福尔马林的标记小瓶中，于室温下固定。肠缺血再灌注损伤（IRI）后，假手术组小鼠空肠和回肠的 H&E 染色显示绒毛细长且形态正常，无扭曲。而 IRI 组小鼠的组织切片则显示存在坏死和出血区域，残留绒毛变短、形态扭曲。此外，接受 IRI 处理的小鼠三个小肠节段的显微损伤程度均显著高于接受假开腹手术的小鼠。

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肠系膜上动脉闭塞的肠缺血再灌注损伤的啮齿动物模型

我们介绍一种外科手术方法，用于诱导实验性缺血/再灌注（I/R）损伤，以模拟小鼠模型中的心肌梗死（MI），该方法可更清晰地定位左前降支动脉（LAD）上的结扎位置，从而提高小鼠MI实验的可重复性。...

通过左前降支动脉结扎建立心肌缺血-再灌注损伤的小鼠模型

本文详细描述了小鼠肠道缺血-再灌注的实验操作步骤，该方法可产生可重复的损伤且不导致动物死亡，旨在促进该技术在研究领域内的标准化。此肠道缺血-再灌注损伤模型可用于研究损伤与再生过程中的细胞和分子机制。...

小鼠肠道缺血-再灌注损伤模型

我们描述了一种通过使用硅胶包被的缝合线阻塞大脑中动脉来诱导小鼠脑卒中的模型。该方案可用于诱导永久性阻塞，或诱导短暂性缺血后进行再灌注。...

采用大脑中动脉阻塞技术诱导小鼠缺血性卒中与缺血-再灌注及梗死区域的可视化

肠梗阻是指肠道出现部分或完全阻塞，可引起严重腹痛、恶心、呕吐，并阻碍粪便排出。该小鼠肠部分梗阻造模方法可靠，可用于研究肠道内病理性细胞增殖与死亡的潜在机制。...

一种肠道部分梗阻的小鼠模型

本方案将使读者能够成功建立节段性肠缺血的猪模型，并随后分离和培养肠干细胞，以研究损伤后上皮的修复过程。...

肠道干细胞的分离与培养：基于节段性小肠缺血猪模型的研究

建立小鼠脑缺血-再灌注模型以研究中风的病理生理学机制。我们结扎右侧大脑中动脉远端和右侧颈总动脉，并在缺血10或40分钟后恢复血流。...

双血管阻断小鼠脑缺血-再灌注模型

本文介绍了一种通过暂时性双侧颈总动脉结扎并结合夹闭法建立的小鼠视网膜缺血模型。该模型有助于理解由心血管异常引发的视网膜缺血的病理机制。...

一种通过短暂双侧颈总动脉阻塞诱导的缺血性视网膜损伤小鼠模型

通过使用自制的牵开器、聚氯乙烯管和独特的打结方法，改进了大鼠心脏心肌缺血-再灌注模型。心电图、氯化三苯基四氮唑和组织学染色以及生存率分析结果表明，改进模型组的成功率和生存率均高于现有模型组。...

改良的大鼠心肌缺血-再灌注损伤模型

本方案描述了一种大鼠大脑中动脉闭塞/再灌注模型，该模型在不造成损伤的情况下保留了脑血管的解剖结构。...

一种不损伤脑血管解剖结构的大鼠中动脉闭塞/再灌注模型

本研究描述了一种通过开腹手术在大鼠中进行胸腹主动脉阻断后内脏缺血-再灌注所致急性肺损伤的模型。该模型可用于研究主动脉阻断的临床和生物学效应，以及缺血-再灌注对内脏器官和远隔肺部损伤的影响。...

通过腹腔干上主动脉阻断建立大鼠内脏缺血-再灌注后急性肺损伤模型

本方案介绍了一种通过活体显微镜诱导肠系膜缺血-再灌注损伤并可视化观察肠系膜微静脉中中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的方法。通过阻断肠系膜上动脉血流1小时后进行再灌注，可直接定量分析白细胞黏附和NETosis过程。...

通过活体显微镜观察肠系膜缺血-再灌注损伤后肠系膜小静脉中中性粒细胞胞外诱捕网的形成

学习肠系膜上动脉闭塞法建立啮齿动物肠缺血再灌注损伤模型，用于研究肠道缺血病理机制。该手术方法通过夹闭SMA诱导缺血，再恢复血流，为开发治疗策略提供可靠的临床前研究平台。

通过闭塞肠系膜上动脉建立肠道缺血-再灌注损伤的啮齿类动物模型

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